Zebrafish를 사용하여 색소 침착 조절자를 식별하기 위한 역 유전적 접근

Summary

멜라닌 세포 기능의 조절제는 색소 침착 결과의 눈에 보이는 차이를 지배합니다. 후보 색소 침착 유전자의 분자 기능을 해독하는 것은 어려운 일입니다. 여기에서 우리는 제브라피쉬 모델 시스템을 사용하여 후보를 식별하고 멜라닌 함량과 멜라닌 세포 수의 조절자로 분류하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

멜라닌 세포는 표피 피부에 존재하는 특수 신경 능선 유래 세포입니다. 이 세포는 유해한 자외선으로부터 게놈을 보호하는 멜라닌 색소를 합성합니다. 멜라닌 세포 기능의 섭동은 파이발디즘, 백색증, 백반증, 기미 및 흑색종과 같은 색소 장애를 유발합니다. Zebrafish는 멜라닌 세포 기능을 이해하는 데 탁월한 모델 시스템입니다. 눈에 띄는 색소 멜라닌 세포의 존재, 유전자 조작의 용이성 및 형질전환 형광선의 가용성은 색소 침착 연구를 용이하게 합니다. 이 연구는 멜라닌 세포의 다양한 단계를 표시하는 mitfa 및 tyrp1 프로모터 하에서 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 유도하는 야생형 및 형질전환 제브라피쉬 계통의 사용을 사용합니다.

후보 유전자의 모르폴리노 기반 침묵은 유충 색소 침착에 대한 표현형 결과를 평가하기 위해 달성되며 색소 침착 조절자를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 색소 침착 결과를 종합적으로 평가하기 위해 두 가지 후보 유전자인 탄산탈수효소 14(Ca14)와 히스톤 변이체(H2afv)를 사용하여 미세 주입에서 이미징 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기반 표현형 해부에 이르는 방법을 보여줍니다. 또한, 이 프로토콜은 후보 유전자를 멜라닌 세포 지정자 및 세포당 멜라닌 함량을 각각 선택적으로 변경하는 멜라닌 세포 지정자 및 분화제로 분리하는 것을 보여줍니다.

Introduction

광보호를 위한 멜라닌의 사용은 동물계에서 여러 번 진화했지만 척추동물은 그 과정을 완성한 것 같습니다. 멜라닌을 합성하고 함유하는 정교한 기계를 갖춘 전용 색소 생성 세포는 물고기에서 인간까지 보존됩니다¹. 그러나 색소 침착의 결과는 색에 따라 매우 다양하며 외피, 피부 및 모발에 생생한 패턴으로 나타납니다². 다양성에도 불구하고 색소 침착 반응에 관여하는 유전자의 레퍼토리는 현저하게 보존됩니다. 주요 멜라닌 합성 효소, 멜라노솜의 구성 요소 및 신호 전달 경로에 대한 상류 연결성과 같은 멜라닌 합성 기계의 핵심 구성 요소는 유기체 전반에 걸쳐 본질적으로 동일하게 유지됩니다. 미묘한 유전적 차이는 종(種)에서 관찰되는 색소 침착 패턴에 극적인 변화를 일으킨다³. 따라서, 하등 척추동물 유기체인 제브라피쉬(Danio rerio)에 대한 역유전적 접근은 색소 상태를 만드는 데 유전자가 관여한다는 것을 해독할 수 있는 훌륭한 기회를 제공한다⁴.

제브라피쉬 배아는 수정 후 ~24시간 이내에 단세포 수정 접합체에서 유충으로 발달합니다(hpf)⁵. 놀랍게도, 멜라닌 세포에 해당하는 세포인 멜라노포어(melanophores)는 진피에 존재하는 큰 세포이며 어두운 멜라닌 함량으로 인해 눈에 띈다⁶. 이 신경 볏 유래 세포는 ~11 hpf를 발산하고 ~24 hpf ^6,7을 착색하기 시작합니다. 보존된 유전자 발현 모듈은 멜라닌 세포 기능을 조율하는 핵심 인자의 식별을 가능하게 하고 멜라닌 세포 발달의 선택적 단계를 표시하는 형질전환 형광 리포터 라인 Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) 및 Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10의 개발로 이어졌습니다. 이러한 형질전환 어선을 사용하면 발달 일정에 따라 적절한 단서를 사용하여 조직 맥락에서 유기체 수준에서 멜라닌 세포의 세포 생물학을 조사할 수 있습니다. 이 리포터는 멜라닌 세포의 색소 기반 정량화를 보완하고 멜라닌 함량에 관계없이 멜라닌 세포 수의 뚜렷한 평가를 가능하게 합니다.

이 기사는 두 가지 중요한 매개변수, 즉 멜라닌 함량과 멜라닌 세포 수를 평가하여 멜라닌 세포의 생물학을 해독하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 전자는 저색소침착 반응에서 발생하는 일반적인 기능적 판독값인 반면, 후자는 멜라닌 세포의 사양 또는 생존 감소와 관련이 있으며 종종 유전적 또는 후천적 탈색 상태와 관련이 있습니다. 이 역 유전자 스크리닝의 전반적인 전략은 모르폴리노를 사용하여 선택된 유전자를 침묵시키고 멜라닌 세포 특이적 결과를 조사하는 것입니다. 멜라닌 함량은 평균 회색 값의 이미지 기반 정량을 사용하여 분석한 후 멜라닌 함량 분석을 사용하여 확인합니다. 다양한 성숙 단계에서 멜라닌 세포의 수는 이미지 기반 정량을 사용하여 분석되고 FACS 분석을 사용하여 추가로 확인됩니다. 여기에서 스크리닝 프로토콜은 두 개의 후보 유전자, 즉 멜라닌 생성에 관여하는 탄산 탈수효소 14와 신경 능선 전구체 집단의 멜라닌 세포 사양에 관여하는 히스톤 변이체 H2AFZ.2를 사용하여 입증됩니다. 전자는 멜라닌 세포 수가 아닌 멜라닌 함량을 변경하는 반면, 후자는 지정된 멜라닌 세포의 수를 변경하고 결과적으로 배아의 멜라닌 함량을 변경합니다. 대체로, 이 방법은 색소 침착에서 후보 유전자의 역할을 식별하고 멜라닌 세포 수와 멜라닌 함량을 조절하는 역할을 구별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

Protocol

제브라피쉬 실험은 인도 CSIR-유전체학 및 통합 생물학 연구소(IGIB)의 기관 동물 윤리 승인(IAEC)에 따라 엄격하게 수행되었습니다(제안 번호 45a). 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 제브라피쉬 배아에 모르폴리노 주입

1. 표준 바늘 풀러를 사용하여 매우 날카롭고 끝이 닫힌 피펫을 그립니다.
2. 모르폴리노가 포함된 용액을 마이크로로더 팁을 사용하여 마이크로피펫에 로드하고 마이크로인젝터 장치에 삽입합니다. 나사를 제대로 조여 마이크로피펫을 잠급니다.
   참고: 모르폴리노의 용량 표준화가 필요합니다. 적절한 용량은 >70 %의 생존율과 24 hpf의 특정 표현형을 갖는다.
3. 미세 집게를 사용하여 마이크로 피펫의 끝을 자르고 보정하십시오¹¹.
4. 보정하려면 마이크로피펫에서 모세관에 1부피의 모르폴리노 용액을 주입하고 주입 시간을 1초로 유지합니다. 이것을 다섯 번 반복하십시오. 표준, 1 mm = 30 nL 부피를 사용하여 모세관을 측정 스케일에 대고 5초 안에 주입된 부피를 찾습니다. 위의 정보를 사용하여 주입 당 1-3 nL을 주입하는 데 필요한 시간 (초 단위)을 계산하십시오¹².
   알림: 표준(1mm = 30nL)은 교정에 사용되는 마이크로 인젝터 압력 설정 및 모세관 직경에 따라 다릅니다. 이상적으로, 주사는 수정 후 15-20 분 이내에 형성되는 난황 세포 계면으로 이루어져야합니다. 다중 주사를 용이하게 하기 위해 배아를 더 낮은 온도(18°C)로 유지하여 발달을 약간 지연시킬 수 있습니다. 그러나 이것은 최소한으로 유지되어야 하며 유전자 발현 변화에 대한 낮은 온도의 복합 효과로 인해 30분 이상 연장되지 않아야 합니다.
5. 배아를 아가로스 캐스트 페트리 접시 (60mm)에 장착합니다. 능선 안에 배아를 단단히 쌓으십시오. 내화 광택 유리 피펫을 사용하여 주입을 위해 적절한 방향으로 정렬하십시오.
6. 현미경으로 조작기를 사용하여 마이크로피펫을 배아에 더 가깝게 가져오고 풋스위치를 눌러 난황 세포 인터페이스 내부에 주입합니다.
7. 모든 배아를 비슷하게 주입하십시오. 신선한 배아수 배지가 들어 있는 페트리 접시에 모아 28°C에서 배양합니다.
8. 6-8 시간 후에 주입 된 배아를 확인하십시오. 높은 불투명도로 인해 식별 가능한 모든 죽은 배아를 제거하고 감염을 피하기 위해 적어도 하루에 한 번 배아 물을 계속 교체하십시오.

2. 색소 침착 분석

1. 3 dpf 제브라 피쉬 배아에서 측면 정중선 멜라노 포어 계산 준비
   1. 배아를 0.016% 신경근 마취제로 처리하여 고정시킵니다.
   2. 이미징을 위해 배아를 장착하려면 페트리 접시 (60mm)에 1.5-2 % 메틸 셀룰로오스 몇 밀리리터를 추가하여 얇은 층을 형성합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 선택하고 메틸셀룰로오스에 부드럽게 배치하여 이미징 중 추가 움직임을 제한합니다.
   3. 최적의 측면(등쪽 줄무늬, 복부 줄무늬, 난황 줄무늬 및 중간 선 멜라닌 포어) 또는 등쪽(머리 등쪽의 멜라닌 포어) 이미징을 위해 위치를 조정합니다. 인접한 멜라닌 포어의 더 나은 해상도를 위해 더 높은 배율 (>5x)의 이미지
2. 명시야 이미징
   참고: 명시야 이미징은 8-10x 배율의 실체 현미경을 사용하여 수행됩니다.
   1. 제브라피쉬 배아가 들어 있는 페트리 접시를 현미경으로 놓습니다. 매니퓰레이터를 사용하여 5 개의 멜라닌 세포 배아 줄무늬 (등쪽, 복부, 2 개의 측면, 노른자)가 동시에 보이도록 물고기를 이러한 방향으로 조정하십시오 (그림 1C). 획득 소프트웨어를 사용하여 이미지를 빠르게 캡처합니다. 동물이 이미지화되기 전에 움직임을 되찾은 경우 마취제에 다시 담그고 충분히 고정되면 이미징을 진행합니다.
   2. 모든 물고기에 대해 이 작업을 반복하고 모든 이미지에 대해 배율이 동일하게 유지되도록 합니다.
3. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평균 회색 값 계산
   1. 2개의 dpf 제브라피쉬 배아의 등쪽 및 측면 이미지를 찍습니다.
   2. 열기 도구를 사용하여 ImageJ에서 수량화할 이미지를 엽니다. 자유형 도구를 사용하여 분석할 영역의 윤곽을 그립니다. 측정 설정 옵션으로 이동하여 평균 회색 값 | 영역을 선택합니다. M 누르기(또는 분석 | 측정)을 사용하여 선택한 영역의 평균 회색 값을 계산합니다.
   3. 분석할 면적을 일정하게 유지하면서 모든 동물의 평균 회색 영역을 개별적으로 계산합니다.
   4. 수집된 데이터로 막대 그래프를 플로팅합니다(그림 2F).
4. 멜라닌 함량 분석
   1. 2dpf에서 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 ~25개의 제브라피쉬 배아를 수집합니다.
   2. 1mL 인슐린 바늘을 사용하여 수동 탈모막을 수행하고 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 추가합니다.
   3. 배아 배지를 조심스럽게 버리고 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 얼음처럼 차가운 용해 완충액 (20mM 인산 나트륨 (pH 6.8), 1 % 트리톤 X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA)을 넣고 초음파 처리로 단백질 용해물을 준비합니다.
   4. 용해물을 1N NaOH 1mL에 용해시키고 샘플을 100°C에서 수조에서 50분 동안 배양합니다. 간헐적으로 소용돌이하여 용해물을 완전히 균질화합니다.
   5. 분광 광도계를 사용하여 490nm에서 샘플의 흡광도 판독값을 가져옵니다.
   6. 시료 흡광도를 알려진 합성 멜라닌 농도의 표준 곡선과 비교하여 멜라닌 함량을 계산합니다(그림 2G).

3. 멜라노포어 수

참고: 형질전환 제브라피쉬 배아의 형광 분석은 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 1) GFP 양성 세포 계수; 2) 형광 강도 측정.

1. 초기 제브라피쉬 배아에서 GFP 양성 세포의 FACS 기반 계수를 위한 준비
   1. 200-250 ftyrp:GFP 배아를 수집하고 일반 배아 물을 사용하여 여과기에서 세척합니다. 음성 대조군으로서 GFP-음성, 단계 일치 야생형(Assam Wildtype) 배아를 처리한다¹².
   2. 관심 단계에 따라 배아를 0.6mg/mL 프로나제가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 5-10분 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 탈모막된 배아를 일반 배아 물이 들어 있는 신선한 페트리 접시에 옮깁니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 ~100개의 배아를 수집하여 2mL 미세 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
   3. 배지를 조심스럽게 버리고 200 μL의 얼음처럼 차가운 링거 용액 (탈노킹 완충액)을 첨가하십시오. 튜브를 얼음 위에 놓고 노른자가 녹을 때까지 내용물을 위아래로 ~20회 피펫팅합니다. 4°C의 탁상용 원심분리기에서 100× g 의 속도로 튜브를 1분 동안 원심분리합니다. 다시 원심 분리하고 상청액을 조심스럽게 버립니다.
   4. 1mL 피펫을 사용하여 탈노른자 배아를 10mL의 트립신 용액(세포 해리 완충액)이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 배아의 과밀화와 비효율적 인 트립신 처리를 피하기 위해 여러 페트리 접시에서 수행하십시오. 1mL 피펫을 사용하여 배아체가 포함된 용액을 한두 번 혼합하여 응집을 줄입니다.
   5. 페트리 접시를 실온에서 15분(<24hpf 배아) 또는 30분(24-30hpf 배아) 동안 배양합니다. 세포의 분해를 돕기 위해 때때로 1mL 피펫을 사용하여 현탁액을 흡인하고 분주합니다.
   6. 배양 기간 동안 세포 계수를 위해 유세포 분석기 기계를 초기화합니다.
   7. 50mL 원뿔형 튜브 위에 70μm 세포 여과기를 놓고 트립신 처리된 현탁액을 여과기를 통해 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 동일한 현탁액으로 페트리 접시를 몇 번 세척하여 표면에 부착 된 세포를 제거하십시오.
   8. 샘플을 450 × g, 4°C에서 5분 동안 스윙 버킷 로터로 회전시킵니다.
   9. 상층액을 버리고 펠릿을 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL에 재현탁합니다.
   10. 450 × g, 4°C에서 5분 동안 다시 회전시키고 상청액을 버린다.
   11. 마지막으로, 펠릿을 PBS + 5% 소 태아 혈청에 재현탁하고 FACS가 실행될 때까지 얼음 위에 보관합니다.
2. 유세포 분석기 준비
   1. 유세포 분석기를 켜고 시동을 시작합니다.
      알림: 기계를 켜기 전에 쓰레기통을 비우고 피복액 탱크를 채우십시오.
   2. 70 μm(또는 85 μm) 노즐의 흐름 흐름을 정상화합니다. 불안정한 경우 10-15분 동안 그대로 두십시오.
3. 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지된 세포 계수
   1. 새 실험 폴더를 초기화하고 전방 산란 대 측면 산란의 산점도와 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 강도의 히스토그램을 만듭니다.
   2. 먼저 야생형 셀을 로드하여 전방 및 측면 스캐터 게이트(이중선 및 파편 제외)와 FITC 임계값을 설정합니다.
   3. 게이트가 설정된 후 샘플을 제거하고 Tg(ftyrp1:GFP) 배아에서 분리된 세포를 로드하여 멜라닌 세포를 계산합니다.
      참고: 여기에서 ftyrp1:GFP가 성숙한 멜라닌 세포를 특이적으로 표지하기 때문에 FITC 게이트 아래의 GFP 양성 세포 수는 멜라닌 세포의 수와 일치합니다.
   4. 모르폴리노가 주입된 샘플로 위의 단계를 반복하여 멜라닌 세포의 수를 추정하고 대조군과 비교합니다.
4. 제브라피쉬 배아의 형광 강도 측정
   1. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 100-120 개의 배아를 수집하여 일반 배아 물이 들어있는 페트리 접시에 옮깁니다.
   2. ~10-12 hpf에서 배아를 0.003% 1-페닐-2-티오우레아로 옮겨 색소 침착을 억제합니다.
   3. <48 hpf 배아를 이미징하기 위해 인슐린 바늘을 사용하여 수동 dechorionation을 수행하십시오.
   4. 배아를 고정시키려면 0.016% 트리카인으로 치료하십시오.
   5. 이미징을 위해 배아를 장착하려면 페트리 접시 (60mm)에 1.5-2 % 메틸 셀룰로오스 몇 mL를 넣어 얇은 층을 형성합니다. 배아를 메틸셀룰로오스에 추가하여 이미징 중 더 이상의 움직임을 제한합니다. 샘플이 들어 있는 페트리 접시를 현미경 아래에 놓습니다. 피펫 팁을 사용하여 동물을 원하는 방향으로 조정하십시오.
   6. 획득 소프트웨어를 사용하여 이미지를 수집합니다. 배아<24hpf의 경우 10배 배율로 전체 배아를 한 번에 캡처합니다. >24 hpf 스테이지의 경우 여러 스캔 필드를 확보한 후 함께 조립(스티치)합니다.
   7. 모든 물고기에 대해 이 작업을 반복하고 획득 설정이 실험 내내 일정하게 유지되는지 확인합니다.
5. 부량
   1. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 추가로 분석합니다.
   2. 열기 도구를 사용하여 ImageJ에서 수량화할 이미지를 엽니다.
   3. 자유형 도구를 사용하여 분석할 영역의 윤곽을 그립니다(그림 3E).
   4. M 누르기(또는 분석 | Measure)를 사용하여 선택한 영역 강도 측정값을 획득합니다.
   5. 분석할 면적을 일정하게 유지하면서 모든 동물의 면적당 평균 강도를 개별적으로 계산합니다.

Results

그림 1에 설명된 워크플로는 제브라피쉬 1 세포 단계에서 모르폴리노 기반 유전자 교란을 수행하는 데 사용되었습니다. 색소침착 분석은 하기와 같이 다양한 방법을 사용하여 수행하였다. 대표적인 결과를 설명하기 위해, h2afv 및 ca14 유전자를 표적으로 하는 표준화된 양의 안티센스 모르폴리노를 제브라피쉬 배아의 난황 또는 단세포 단계에 주입했습니다. 명시야 이미징을 기반으로 한 초기 표현형은 수정 후 48시간(hpf)에 수행되었으며, 이때 5개의 색소 멜라닌 포어 줄무늬(등쪽, 복부, 난황, 측면 2개)가 모두 분명했습니다.

그림 2A,B는 배아당 측면 멜라노포어의 수를 계산하여 색소 침착을 분석하는 접근 방식을 나타냅니다. 측면 멜라노포어는 기울어진 제브라피쉬의 측면 영역을 확대하여 48hpf 단계에서 수동으로...

Discussion

색소 침착 표현형은 종종 멜라닌 함량 또는 색소 함유 멜라닌 세포 수의 변화로 나타납니다. 본원에 기재된 방법은 이러한 이분법의 해부를 허용하고, 멜라닌 함량에 무관하게, 배아당 멜라노포어의 수 및 멜라닌 함량의 정성적 및 정량적 평가를 허용한다. 제브라피쉬의 높은 번식력, 색소 멜라닌 세포의 가시적 특성, 멜라노솜 전달의 부족은 중간 처리량 스크리닝이 가능한 이 역유전적 접근 방식을 사용하여 멜라닌 세포 생물학의 해부를 가능하게 합니다.

모르폴리노 기반 침묵의 선택은 침묵의 용이성과 여러 후보를 병렬로 테스트할 수 있는 능력에서 비롯됩니다. 모르폴리노-기반 침묵 접근법을 사용하는 데에는 특정한 한계가 있으며, 이러한 유용한 도구들을 사용하고 해석하기 위한 가이드라인은 이전에 설명되었다¹³. 기본적으로 여러 MO를 사용하여 녹다운시 표현형을 검증하면이 문제에 대한 실질적인 솔루션을 얻을 수 있습니다. 또 다른 전략은 CRISPR 기반 유...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 마이크로튜브	Axygen	MCT-150-A	MO 용액 준비용
2 mL 마이크로튜브	Axygen	MCT-200-C	FACS 프로토콜의 세척 단계용
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	마이크로주입
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	세포 분류용
모세관	Drummond	1-000-0010
코닝 세포 스트레이너	Corning	CLS431751	단일 세포 현탁액
DMEM 고포도당 매체	Sigma-Aldrich	D5648	FACS 프로토콜
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(트리카인)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	이미징을 위한 ZF 에
틸렌디아민테트라아세트산이나트륨염 이수화물(EDTA)	시그마-알드리치	E5134	저온 용해 완충액
FACS 튜브	BD-Biosciences		342065 FACS 프로토콜
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS 프로토콜
Graphpad 프리즘 소프트웨어 Graphstats	Technologies	NA	데이터 표현용
ImageJ Software	National Institute of health	NA	이미지 분석용
인슐린 주사기 (1 mL)	DispoVan	NA	수동 탈이온화용
멜라닌, 합성	Sigma-Aldrich	M8631	멜라닌 함량 분석용
메틸셀룰로오스	Sigma-Aldrich	M7027-250G	ZF 고정용 이미징용
Microloader 팁	Eppendorf	5242956003	Microinjection
용 Morpholino	Gene-tools	NA	녹다운 실험의 경우
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	멜라닌 형성을 억제하기 위해
바늘 풀러	Sutter Instrument	P-97	미세 주입용
Nunc 15 mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS 프로토콜
페트리디쉬(60 mm)	Tarsons	460090	용 배아 플레이트
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	냉간 용해 완충액
인산염 완충액 식염수 (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	세포 세척 용
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	탈환
용 프로테아제 억제제 칵테일	Sigma-Aldrich	P8340	냉간 용해 완충제
칼집 유체	BD FACSFlowTM	342003	FACS 프로토콜
인산나트륨	Merck	7558-79-4	저온 용해 완충액
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	저온 용해 완충액
TrypLE	Gibco	1677119	Trypsinization용