여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.
방법 논문
여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.
여성의 생식력과 생식 수명은 난소 난모세포 예비의 질과 양에 달려 있습니다. meiotic prophase I에 들어가는 여성 생식 세포의 약 80 %는 태아 난모세포 감소 (FOA)와 산후 생후 첫 주 동안 제거됩니다. 세 가지 주요 메커니즘은 발달 중에 생존하는 난모세포의 수를 조절하고 사춘기에 들어가는 여성의 난소 예비를 확립합니다. 난모세포 손실의 첫 번째 파동에서, 난모세포의 30-50 %가 초기 FOA 동안 제거되며, 이는 높은 Long interspersed 핵 요소 -1 (LINE-1) 발현에 기인하는 현상입니다. 난모세포 손실의 두 번째 물결은 meiotic 품질 체크 포인트에 의해 meiotic 결함이있는 난모세포를 제거하는 것입니다. 난모세포 손실의 세 번째 파동은 일부 난모세포가 모낭을 형성하지 못할 때 원시적 인 난포 형성 중에 주산기적으로 발생합니다. 난모세포 손실의이 세 가지 파동 각각을 조절하는 것이 무엇인지, 그리고 그들이 쥐 나 인간에서 난소 예비를 어떻게 형성하는지는 분명하지 않습니다.
면역 형광 및 3D 시각화는 덜 유익한 2D 섹션보다는 전체 난소의 맥락에서 난모세포 발달을 이미지화하고 분석 할 수있는 새로운 길을 열었습니다. 이 기사에서는 전체 난소 면역 염색 및 광학 클리어링을위한 포괄적 인 프로토콜을 제공하여 다중 광자 현미경을 사용한 이미징 및 상용 소프트웨어를 사용한 3D 모델링 제제를 제공합니다. 이 방법을 사용하여 C57BL / 6J 마우스에서 난소 발달 중 난모세포 감소의 역학을 보여주고 난모세포 제거의 세 가지 파동 동안 난모세포 손실을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 난모세포 시각화 및 정량화뿐만 아니라 다른 정량적 접근법을 위해 산전 및 산후 산후 난소에 적용될 수 있습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석의 요구를 충족시킬 수 있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용하기 위해 전략적으로 개발되었습니다.
대부분의 포유류 암컷은 원시적 난포 내에 저장된 유한한 수의 meiotically arrested 난모세포로 태어나 난소 예비군 (OR)1,2를 구성합니다. OR은 전체 여성의 생식 수명과 건강을 결정합니다3. OR은 일반적으로 노화와 함께 크기가 감소하고 특정 유전 독성제 (방사선 / 화학 요법) 및 환경 스트레스 (영양 실조)에 노출되면 조기에 고갈 될 수 있으며 불임 4,5,6으로 이어질 수 있습니다. 특발성 여성 불임은 종종 OR에서 발생하는 난자의 유전 적 및 생리적 품질에 기인 할 수 있으며 잘 이해되지 않는 상태로 남아 있습니다 7,8. 여성 여포 기부는 출생에 의해 크게 미리 결정되기 때문에 OR 설립 및 유지 보수와 관련된 규제 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다.
마우스에서, OR 형성은 배아일(E) 7.5<....
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사용된 모든 마우스는 C57BL/6J 유전자 균주 중 하나였다( 표 참조). 이 균주는 완전히 서열화되었으며 난소 구조와 기능에 대한 많은 연구의 표준입니다. 마우스는 NIH 지침에 따라 수용되었으며, 수행 된 절차는 잭슨 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 시약 및 조성물은 각각 표 및 표 1에 열거되어 있다.
1. 시약의 제조
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전체 난소의 면역 염색 및 이미징은 동일한 기술 및 마커를 사용하여 다양한 발달 단계에서 난소에서 난모세포 또는 단백질 발현의 시각화 및 정량화를 가능하게합니다 (그림 3). 이 프로토콜은 여러 단계의 난소 분석과 여러 마우스 균주의 분석이 필요한 대규모 프로젝트를 위해 개발되었습니다. 여기에서는 유전자 분석을 위한 표준 균주인 C57BL6/J 균주에 대해 수집된 데이터를 제시합니다. 여기에 제시된 기술은 간단하며 14-19 일 이내에 결과를 얻을 수 있으며 (그림 2D) 산전, 사춘기 및 사춘기 암컷의 난소에 사용할 수 있습니다 (그림 1 및 그림 2A, B).
이 접근법은 난소 난모세포 예비의 형성 동안 자연적으로 발생하는 난모세포 손.......
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이 기사에서는 생식 세포 정량화 및 단백질 국소화에 대한 높은 처리량 및 비교 연구를 위해 산전 및 산후 난소에 대한 상세한 3D 면역 염색 및 이미징 프로토콜을 제시합니다. 우리는 10-16 개의 다른 균주에서 6 개의 발달 시점에서 난소 (N = 6-12)의 난자 수를 분석하기 위해이 프로토콜을 개발했으며, 2-4 개의 24 웰 플레이트는 일반적으로 한 번에 처리됩니다. 이 방법은 다른 기관 또는 세포 마커에 적합할 수 있다. 예를 들어, 이 프로토콜은 적절한 항체를 사용하여 난소의 과립 세포와 같은 체세포를 표지하고 시각화하는데 사용될 수 있으며, 따라서 체세포-생식 세포 상호작용 또는 다른 난소 세포 유형의 발달에 대한 연구를 용이하게 한다.
이러한 프로토콜과 항체 조합의 한 가지 한계는 상이한 소낭선 단계의 결정적인 확인이다. 과립 세포 핵의 층에 의한 여포 단계를 확인하기 위해 면역 형광 및 2D 이미징에 사용되는 DNA 염색은 3D 접근법에 충분하지 않습니다. 4',.......
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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
이 작업은 국립 보건원 보조금 (R01 HD093778에서 E.B-F로, T32 HD007065에서 R.B로)에 의해 지원되었습니다. 방사선 실험에 도움을 주신 Zachary Boucher에게 감사드립니다. 우리는 원고를 비판적으로 읽은 Mary Ann Handel에게 감사드립니다. 우리는 Sonia Erattupuzha와 Jackson Laboratory의 Microscopy Core Service가 본 간행물에 설명 된 현미경 검사에 대한 전문가의 도움과 잭슨 연구소의 과학 기기 서비스 (Scientific Instrument Services)의 Jarek Trapszo가 3D 인쇄 어댑터 슬라이드를 설계한 것에 대해 감사하게 생각합니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 벤치탑 인큐베이터 | 벤치마크 사이언티픽 | H2200-H | 37 ° C 인큐베이터 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| C57BL / 6J | 잭슨 연구소 | 000664 | 마우스 근친 균주 |
| 디메틸 설폭 시드 (DMSO) | 시그마 알드리치 | D1435 | 위험 물질 |
| D- 소르비톨 | 시그마 알드리치 | S6021 | |
| Dumont # 5 집게 | FST | 911150-20 | |
| FastWells 시약 장벽 | GraceBio | 664113 | 끈적하고 유연한 실리콘 개스킷(접착 잘) |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Glycine | ThermoFisher Scientific | BP381-500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21246 | 희석 1:1000 |
| 염소 항-쥐 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21434 | 희석 1:1000 |
| 염소 혈청 | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| IMARIS 소프트웨어 | Oxford Instruments | 버전 9.7.0 | 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어 |
| Insight X3 | Spectra-Physics | InSight | X3 다광자 이미징을 위한 |
| 레이저 LASX 소프트웨어 | Leica | 버전 3.5.6 | 이미지 수집 소프트웨어 |
| Leica DIVE/4TUNE/FALCON | Leica | Leica Dmi8, 2P-M ready: # 158005406 | 다광자 현미경 |
| MaiTai HP | Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee One Box Multiphoton Imaging 용 초고속 레이저 | |
| 레이저 Masterflex 펌프 컨트롤러 | SPW 산업용 | 모델: 7553-50 | 관류용 연동 펌프 |
| Mayo Scissors | FST | 14010-17 | 5" – 7인치 참수를 위한 둔기/둔기 가위 |
| 마이크로 커버 안경, 사각형, No. 1.5 25x25mm | VWR | 48366-249 | |
| Mini BioMixer | 벤치마크 과학 | B3D1020 | 쉐이커/너트 37 ° C 인큐베이터 |
| 니콘 인체공학적 SMZ1270 | 라이카 | SMZ1270 | 실체 현미경 |
| 파라포름알데히드 16%(포름알데히드 수용액) | 전자 현미경 과학 | 15710 | 위험 물질 |
| PBS 정제, 인산염 완충 식염수 | ThermoFisher Scientific | BP2944100 | Milli-Q 물에 용해 |
| 페니실린-스트렙토마이신, 200x, 이중 항생제 솔루션 | ThermoFisher Scientific | ICN1670249 | |
| 폴리 비닐 알코올 (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Quadrol (N, N, N&prime, N &prime, - Tetrakis (2- 하이드 록시 프로필 에틸렌 디아민) | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| 토끼 안티 DDX4 / MVH | Abcam | ab27591 | 희석 1 : 500 |
| 토끼 안티 LINE-1 ORF1p | Abcam | ab216324 | 희석 1 : 500 |
| 쥐 안티 TRA98 / GCNA | Abcam | ab82527 | 희석 1:500 |
| 아지드나트륨 | 시그마-알드리치 | S2002 | 유해 물질 |
| 소화붕소나트륨 | 시그마-알드리치 | 452882 | 유해 물질 |
| 설탕 | ThermoFisher Scientific | S0389 | |
| Tekmar Orbital Shaker | Bimedis | VXR-S10 | shaker for room temperature |
| 트리에탄올아민 | Sigma-Aldrich | 90279 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| UNOLOK 주입 세트 | MYCO Medical | 7001-23 | 관류 용 바늘 |
| Urea | Amresco | 97061-920 | |
| X-Cite 120LED | Excelitas | S / N XT640-W-0147 | 저전력 LED 형광 램프 |
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