방법 논문

가변성을 제한하기 위한 망막 정맥 폐색 마우스 모델의 최적화

DOI:

10.3791/62980

⸱

2021년 8월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Cell Biology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Department of Neurology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 4The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기에서는 장미 벵골을 사용한 망막 정맥 폐색에 최적화된 프로토콜과 유전자 변형 균주에서 재현성을 극대화하기 위한 권장 사항과 함께 레이저 유도 망막 영상 현미경 시스템에 대해 설명합니다.

초록

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망막 정맥 폐색 (RVO)의 마우스 모델은 종종 신경 망막의 저산소 성 허혈성 손상을 연구하기 위해 안과에서 사용됩니다. 이 보고서에서는 다양한 유전자 변형 마우스 균주에서 일관되게 성공적인 폐색률을 달성하기 위한 최적화 권장 사항과 함께 중요한 단계를 지적하는 자세한 방법이 제공됩니다. RVO 마우스 모델은 주로 감광제 염료를 정맥 투여 한 후 안과 유도 레이저에 부착 된 망막 영상 현미경을 사용한 레이저 광 응고로 구성됩니다. 폐색 일관성의 결정 요인으로 세 가지 변수가 확인되었습니다. 장미 벵갈 투여 후 대기 시간을 조정하고 기준선과 실험 레이저 출력의 균형을 맞추면 실험 전반에 걸친 변동성을 제한하고 교합 성공률을 높일 수 있습니다. 이 방법은 망막 부종 및 저산소 성 허혈성 손상을 특징으로하는 망막 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 모델은 혈관 손상을 유발하므로 신경 혈관계, 신경 세포 사멸 및 염증을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다.

서론

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망막 정맥 폐색(RVO)은 2015년에 전 세계적으로 약 2,800만 명에게 영향을 미친 일반적인 망막 혈관 질환입니다1. RVO는 근로 연령 성인과 노인의 시력 저하 및 상실로 이어지며, 이는 가까운 10년 동안 증가할 것으로 추정되는 지속적인 시력 위협 질병을 나타냅니다. RVO의 뚜렷한 병리 중 일부는 저산소 성 허혈성 손상, 망막 부종, 염증 및 신경 손실2을 포함합니다. 현재이 장애에 대한 치료의 첫 번째 라인은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제의 투여를 통한 것입니다. 항 -VEGF 치료가 망막 부종을 개선하는 데 도움이되었지만 많은 환자들이 여전히 시력 저하에 직면 해 있습니다3. 이 질환의 병태생리학을 더 이해하고 잠재적인 새로운 치료 라인을 테스트하기 위해, 상이한 마우스 균주에 대한 기능적이고 상세한 RVO 마우스 모델 프로토콜을 구성할 필요가 있다.

마우스 모델은 인간 환자에게 사용되는 것과 동일한 레이저 장치를 구현하여 개발되었으며, 마우스에 적합한 크기로 조정된 이미징 시스템과 쌍을 이룹니다. RVO의이 마우스 모델은 20074 년에 처음보고되....

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프로토콜

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이 프로토콜은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서를 따릅니다. 설치류 실험은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 모니터링되었습니다.

참고: 모든 실험은 무게가 약 20g인 2개월 된 수컷 마우스를 사용했습니다.

1. 플록스드 유전자의 유도성 유전자 절제를 위한 타목시펜의 제조 및 투여

알림: 망막 혈관 직경은 동물의 무게에 영향을받을 수 있습니다. 실험에 사용 된 모든 동물의 무게가 비슷한지 확인하십시오.

  1. 옥수수 기름에 타목시펜을 20mg/mL의 농도로 희석합니다.
    알림: 타목시펜은 독성 물질이며 빛에 민감합니다. 빛으로부터 보호하십시오(예: 알루미늄 호일).
  2. 몇 초 동안 솔루션을 소용돌이치십시오.
  3. 55°C의 오븐에 15분 동안 그대로 둡니다.
    알림: 타목시펜이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 추가 소용돌이가 필요할 수 있습니다.
  4. 용액을 4 ° C에서 최대 1 주일 동안 보관하십시오.
  5. 타목시펜 주사에는 1G 바늘이 장착된 26mL 주사기를 사용하십시오. ....

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결과

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RVO 마우스 모델은 망막 정맥의 폐색을 성공적으로 달성하여 저산소 허혈성 손상, 혈액 망막 장벽 파괴, 신경 세포 사멸 및 망막 부종8을 유발하는 것을 목표로 합니다. 그림 1 은 재현성을 보장하기 위한 단계의 타임라인, 실험 설계의 개략도를 보여주고 실험 질문에 따라 추가로 최적화할 수 있는 단계를 간략하게 설명합니다. 수정할 수있는 세 가지 주요 단계는 장미 벵갈 투여 후 대기 시간, 기준 레이저 출력 및 실험용 레이저 출력입니다. 이 보고서에서는 C57BL/6J 마우스와 유도성 내피 세포 카스파제-9 녹아웃 마우스 라인(iEC Casp9)의 WT 및 KO 배지를 사용하여 다양한 균주에서 최적의 설정을 결정했습니다.

장미 벵골 주사에서 레이저 조사까지의 대기 시간은 정맥에서 광응고의 성공을 바꿀 수 있습니다. 대기 시간이 너무 짧으면 정맥 내 장미 벵골 농도가 낮아질 수 있지만 .......

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토론

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마우스 RVO 모델은 RVO 병리를 더 깊이 이해하고 잠재적인 치료법을 테스트할 수 있는 방법을 제공합니다. 마우스 RVO 모델이 현장에서 널리 사용되는 반면, 가변성을 해결하고 모델의 최적화를 설명하는 모델의 현재 세부 프로토콜이 필요합니다. 여기에서는 실험 동물 코호트에서 가장 일관된 결과를 얻고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하기 위해 변경할 수 있는 사항에 대한 경험의 예가 포함된 가이드를 제공합니다.

RVO 마우스 모델의 가장 필수적인 두 가지 요소는 레이저 출력과 감광제 염료의 성공적인 정맥 주사입니다. 레이저가 특정 정맥을 겨냥할 때 응고를 유도하는 데 필요한 전력을 생산하려면 레이저 출력을 적절하게 조정해야 합니다. 이 방법은 방법에서 제안한 기술을 사용하여 달성할 수 있지만 각 실험실의 시스템 설정에서 차이점을 고려하는 것이 중요합니다. 광섬유 케이블의 변형과 장비 및 실내 온도와 관련하여 수용되는 방법은 낮은 레이저 출력을 설명할 수 있는 몇 가지 변수입니다. 레.......

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (CCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (AMP) 및 National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (CMT로)의 지원을 받았습니다.
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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CarprofenRimadylNADA # 141-1994 °에서 유지합니다. C
옥수수 기름Sigma-AldrichC8267
섬유 패치 케이블Thor LabsM14L02
GenTealAlcon00658 06401
케타민 염산염Henry ScheinNDC: 11695-0702-1
LasercheckCoherent1098293
PhenylephrineAkornNDCL174478-201-15
메리디안이 있는 Phoneix Micron IV,  StreamPix 및 OCT 모듈Phoenix Technology Group
Proparacaine HydrochlorideAkornNDC: 17478-263-124°C 유지; C
리프레시Allergan94170
로즈 벵골시그마-알드리치330000-5G
타목시펜시그마-알드리치T5648-5G감광
트로피카미드AkornNDC: 174478-102-12
자일라진AkornNDCL 59399-110-20
는

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).
  2. Ehlers, J. P., Fekrat, S.

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재인쇄 및 허가

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