검은 후추 식물에 대한 Phytophthora capsici에 대한 효과적인 접종 방법

검은 후추 (Piper nigrum L.)는 우디 등반가이자 가장 중요한 향신료 작물 중 하나입니다. 그것은 "향신료의 왕"¹으로 알려져 있으며 아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카 전역의 40 개 이상의 국가와 지역에서 재배됩니다. Phytophthora 뿌리 썩음은 검은 후추의 가장 파괴적인 질병이며, oomycete Phytophthora capsici에 의해 발생합니다. 이 병원균은 또한 큐커빗, 가지, 칠리 고추 및 토마토 ^2,3을 감염시킵니다. 검은 후추를 사용하면 전체 작물이 때때로이 질병에 의해 파괴 될 수 있습니다. 후추 재배 지역의 확장은 내성 품종의 이용 불가능으로 인해 제한되며, 이는 중국 후추 산업의 발전을 크게 방해했습니다. 검은 후추 식물에 대한 Phytophthora capsici에 대한 효과적인 접종과 정확한 샘플링 시스템은이 식물 - 병원균 상호 작용을 연구하는 데 필수적입니다.

생식 형질 자원에서 내성의 확인 및 스크리닝은 병원균의 병원성과 내성 품종의 번식 및 활용을 연구하기위한 기본 요구 사항입니다. 널리 사용되는 접근법은 식물 종 및 병원균 그룹에 기초한 다양한 식별 방법을 사용하는 것이다. 현재의 식별 방법에는 집단 식별, 개인 식별, 장기 식별, 조직 식별, 세포 식별, 생화학 적 식별 및 분자 식별이 포함되며 최근 몇 년 동안 개발 된 ^4,5. 이 분야에서 성공했지만 많은 문제가 있습니다. 어떤 방법을 선택하든 명확한 목표, 신뢰할 수있는 결과 및 간단하고 신속하며 표준화하기 쉬운 방법을 포함하여 식물 저항 식별의 기본 요구 사항은 일관됩니다. 이 원칙은 또한 후추 저항의 식별에 따라야합니다.

자연 현장 조건에서 질병 저항성의 확인은 많은 환경 요인에 의해 영향을받을 수 있습니다. 따라서 분리 된 잎과 관개 된 뿌리를 실험실에서 사용하여 질병 저항성을 확인하는 것이 제안되었습니다. 건강한 식물로부터의 어린 잎을 실험실 에서 시험관 내에서 접종하고, 병든 잎 면적을 식물⁶의 질병 저항성을 확인하기 위해 병원균을 접종하여 측정하였다. 그러나, 시험관내 잎 접종은 분자 상호작용 연구를 위한 것이 아니라 일반적인 내성 확인을 위해서만 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 질병 내성 상태는 관개 된 뿌리 접종에 종종 나타나며, 질병 저항성에 대한 분자 육종에 대한 후속 연구에서 불확실성을 야기합니다. 따라서 빠르고 간단한 실내 감지 방법이 필수적입니다. 이 연구는 실험실에서 저항 식별 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.

1. 감염에 대한 후추 절단 식물의 준비

1. 소독 된 가지치기 칼 또는 secateurs를 사용하여 건강하고 활발하게 자라는 검은 후추의 직교 성 가지에서 직경 0.5cm의 약 40cm 길이의 5 노드 절단을 가져 가십시오. 플라지오트로픽 브랜치의 아래쪽 세 노드를 자릅니다, 위쪽 두 노드는 약 10개의 잎을 그대로 남겨 둡니다.
2. 토양과 동물 분뇨 (소 배설물 또는 양 배설물)가 들어있는 뿌리 기질을 1:1의 비율로 준비하십시오. 응원 기판을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브한다.
3. 절단을 약 50°의 각도로 응원 기판에 삽입하고, 세 번째 노드는 기판 표면과 기판 위의 이 노드의 겨드랑이 새싹을 터치합니다.
   참고 : 여기에 사용 된 가방의 크기는 높이 40-60cm, 직경 25-30cm입니다.
4. 식물의 뿌리 위에 10-20 L의 물을 붓는다. 뿌리와 성장을 위해 25-30 ° C의 온도에서 90 % 그늘이있는 온실에 절단을 놓습니다.

2. Phytophthora capsici (P. capsici)의 전파

참고 : Phytophthora capsici 문화의 재고는 향신료 및 음료 연구소, 중국 열대 농업 과학 아카데미⁷의 식물 보호 실험실에서 유지됩니다.

1. 흐르는 수돗물로 감자 괴경을 닦고 닦은 다음 감자 200g을 1cm³의 큐브로 자릅니다. 큐브 중 일부를 이중 증류수 (ddH2O) 800 mL가 들어있는 비이커에 넣고₂₀분 동안 끓입니다.
2. 중력 여과를 사용하여 이중 거즈를 통해 국물을 여과하십시오. 상기 여액에 덱스트로스 20 g 및 한천 15 g을 첨가하고, 혼합물을 ddH2O.로 부피 1 L까지 토핑하여 감자 덱스트로스 한천 (PDA)을 준비하고, 혼합물을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브⁸.
3. 액체 형태의 멸균된 PDA 20 mL를 층상 공기 흐름 후드 내부의 직경 9 cm 둥근 페트리 접시에 붓는다. 결로를 방지하기 위한 수단으로 하룻밤 사이에 층류 후드 내부에 뚜껑이 열려 있는 PDA 플레이트를 그대로 두십시오.
4. 접종 루프를 사용하여 시험관 내부의 Phytophthora capsici 스톡에서 균사체를 채취하십시오. PDA와 접촉하는 균사체 측과 함께 접종물을 페트리 접시에 놓습니다.

3. 후추의 감염

1. 잠복
   1. 접종을 위해 기질 표면에서 5cm 위, 줄기의 뿌리 근처에있는 영역을 확인하십시오.
   2. 마개 보어를 사용하여 페트리 접시에서 PDA 상의 피토프토호라 캡시치 배양물의 성장 가장자리에서 직경 0.5 cm의 균사체의 디스크를 코어 아웃한다.
   3. 주사기 바늘을 사용하여 줄기를 손상시키고 선택한 접종 영역에서 삼각형 패턴으로 세 개의 구멍을 만듭니다. 균사 디스크로 각 구멍을 덮으십시오. 상처 입은 부위가 균사 디스크로 완전히 덮여 있는지 확인하기 위해 구멍을 서로 가깝게 배치하십시오.
   4. 균사 디스크를 건조를 방지하기위한 수단으로 멸균 된 축축한 면봉으로 덮으십시오. 패드를 폴리에틸렌 스트립으로 줄기에 묶어 접종 디스크의 위치를 유지하십시오.
      참고 : 접종 후 8 시간에, 접종 된 구멍은 검은 색으로 변하고 시간이 지남에 따라 병변이 연장되었습니다. 잎은 노랗게 변하고 떨어졌으며 접종 된 식물은 접종 후 7-10 일 후에 사망했습니다. 대조 식물에서 병변이 발생하지 않았습니다. 대부분의 유전자는 대조군과 비교하여 Phytophthora capsici 로 접종 한 후 다르게 발현되었습니다. 감염된 조직의 조직병리학적 분석은 피토프토라 고추 시 치가 자일렘에서 콜로니화되었음을 입증하였다.
2. 관심있는 식물 재료를 샘플링하고 후속 연구에 사용하기 위해 액체 질소 중 -80°C에서 보관하십시오.
   참고: 액체 질소, 비닐 봉지, 마커 펜, 가지 가위 및 기타 재료는 실험 전에 준비되었습니다.
3. 특정 식물 재료가 사용을 위해 샘플링 된 후, 나머지 모든 식물 재료, 남은 Phytophthora capsici 배양 및 배양 배지 및이 접종 작업에 사용 된 모든 도구 및 실험실을 오토클레이브합니다.

도 1은 P. capsici 접종 후 후추 잎의 증상을 나타낸다. 도 2는 P. capsici 접종 후 후추 줄기의 증상을 나타낸다. 병원체는 기저 줄기에서 검은 후추를 감염시켰다; 잎 황변, 시들음 나타남, 자일렘 갈변 및 혈관 흑색과 같은 증상이 점차 나타납니다. 도 3은 피토프토호라 캅시치를 대조군과 비교하여 접종한 후 다르게 발현되는 대부분의 유전자를 보여준다. 도 4 는 감염된 조직의 조직병리학적 분석에 의해 자일렘에서 콜로니화된 피토프토라 캡시치를 입증하였다.

그림 1: P. capsici 접종 후 후추잎의 증상7. CK : 대조군; 접종 : 예방 접종 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: P. capsici 접종 후 후추 줄기의 증상7. 접종 : 예방 접종 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 후추 뿌리에서 유전자의 상세한 발현 프로필. 도면의 에러 막대는 세 가지 생물학적 복제로부터의 발현 수준의 표준 오차를 나타낸다. x축 상의 CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24, 및 48은 P. capsici로 접종한 후 대조군에서 각각 8, 12, 24, 및 48 h를 참조한다. y축은 유비퀴틴과 비교한 상대적 발현 수준을 나타낸다. 각 열은 세 개의 생물학적 반복실험으로부터의 평균값과 SD(표준 편차)를 더한 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 감염된 조직의 조직병리학적 분석. 톨루이딘 블루 O 염색 단독(왼쪽 컬럼)과 코튼 블루 및 사프라닌 O 이중 염색(오른쪽 컬럼)(20X)의 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

In this study, the basal head was pinpricked to damage and provide an effective inoculation system in the black pepper plant. Mycelial pellets then covered the three holes to retain moisture and enable the pathogen to infect the plant well. Following inoculation, the leaves turned yellow and dropped off and the inoculated plants died. No lesions developed in the control plants. Most genes expressed differently following inoculation with Phytophthora capsici in comparison to the control group. Fungal diseases are responsible for structural and physiological disorders in a significant number of crops, leading to decreased productivity and economic losses for their producers. Structural studies employing histological techniques on the mode of penetration and colonization of plant tissues by fungi provide a detailed indication of the interactions between the pathogen and the plant tissue. These studies have revealed important aspects to help understand the monocycle of diseases. Histopathological analysis of infected tissues demonstrated Phytophthora capsici colonized in the xylem. This method provides a better means for solving the instability that is caused by traditional inoculation methods including soil drench or root dipping. An effective inoculation and precise sampling system for Phytophthora capsici on black pepper plants are essential for studying this plant-pathogen interaction. It also provides a promising means for studying the mode of action between plants and other soil-borne plant pathogens in agricultural precision breeding.

At the same time, this protocol represents a more efficient way of providing reference for the incubation of woody vine. In previous studies, pathogens were inoculated by root dipping with spore suspensions cultured in V8 medium⁹. It takes 7 days for the spore suspension to be ready, whereas the use of PDA to culture Phytophthora capsici takes just 5 days. The PDA plate was sealed using permeable surgical tape as a means of avoiding contamination from other bacteria and fungi. The cultures were kept at room temperature. The method used in this study can save more time and be performed more rapidly. Black pepper is a woody vine with many sugars and phenols¹⁰, and the zoospores produced by Phytophthora capsici generally occur in soils, making it difficult to infect black pepper vines and cause infection instability in the root¹¹. This protocol provides better results, enabling a strong interaction between vine plants and soil-borne pathogens. The detection of the dynamic process between plants and pathogens is visible and convenient.

The irrigating root method is fast and time-saving, but a problem remains unsolved for black pepper. Phytophthora capsici is a soil-borne pathogen that generally infects plant roots via sporangia and zoospores¹². In nature, the sporangia is able to spread via rain and irrigation. Once the zoospores become attached to the plant surface, the germ tubes may quickly develop and penetrate the plant tissue, which results in infection^13,14. This can cause uncertainty that choosing hyphae as an infection source will be similar to the spore suspension. The method used in this study starts with pinpricking the basal head of the black pepper plant to damage it. The damaged area is then covered with Phytophthora capsici and moisture is retained, ensuring that the pathogen can infect the plant well. This method is better at solving the instability caused by traditional inoculation methods including soil drench or root dipping. It is also a promising method for studying the mode of action between plants and other soil-borne plant pathogens in agricultural precision breeding.