이 신경세포 해리 프로토콜은 출발 물질의 양이 적은 샘플을 대상으로 하며, 선택적 고정 및 염색 단계를 통해 다운스트림 분석을 위해 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 신경 해리 프로토콜 (상용 성인 뇌 해리 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 적응)은 유세포 분석 또는 단일 세포 시퀀싱과 같은 상세한 하류 분석에 대비하여 조직 처리를 최적화합니다. 신경 해리는 기계적 해리 (예를 들어 필터, 베핑 기술 또는 피펫 분쇄 사용), 효소 소화 또는 이들의 조합을 통해 수행 될 수 있습니다. 신경 세포의 섬세한 특성은 단일 세포 분석에 필요한 최소한의 세포 파편으로 실행 가능하고 진정한 단일 세포 현탁액을 얻으려는 노력을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이 데이터는 자동화 된 기계적 해리와 효소 소화의 이러한 조합이 일관되게 매우 실행 가능한 (>90 %)의 단일 세포 현탁액을 산출하여 앞서 언급 한 어려움을 극복한다는 것을 보여줍니다. 몇 가지 단계는 수동 손재주가 필요하지만 이러한 단계는 샘플 처리 및 잠재적 인 세포 손실을 줄입니다. 이 원고는 다운스트림 분석을 준비하기 위해 소량의 신경 조직을 성공적으로 해리시키기 위해 다른 실험실을 갖추는 과정의 각 단계를 자세히 설명합니다.
서론
해마는 볼로냐 해부학자 줄리오 체사레 아란지오(Giulio Cesare Aranzio)에 의해 1500년대1년에 처음 기술되었다. 이 새로 발견 된 구조물의 이름을 지을 때, Aranzio는 해 마1 속의 해마와 닮은 기묘한 유사성에서 영감을 얻었을 것입니다. 해마는 스트레스 반응에 관여하지만 학습과 기억에서의 역할로 널리 알려져 있습니다. 보다 구체적으로, 해마는 선언적 및 공간 기억(1)의 인코딩 및 검색을 담당한다.
해마 또는 해마는 CA1 (cornu ammonis), CA2 및 CA3 서브 필드1로 나뉩니다. 신경계의 나머지 부분과 비교할 때, 해마는 가소성과 진행중인 신경 발생의 잠재력을 포함하여 몇 가지 독특한 정의 특성을 가지고 있습니다2. 신경 발생은 신경 줄기 세포의 증식 및 분화의 과정이며, 그 다음에 기존의 신경 네트워크로의 통합이 뒤 따른다. 신경 발생은 치과 자이러스의 하위 과립 영역과 측심실 (및 후각 전구)의 심실 하부 영역으로 제한됩니다3. 신....
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프로토콜
실험은 UAMS의 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 6 개월 된 암컷 C57Bl6 / J 야생형 마우스를 구입하고 일정한 12 시간 빛 / 어둠주기하에 그룹 하우스 (케이지 당 4 마리의 마우스)를 구입했습니다.
1. 시약의 제조
- 고정 가능한 살아있는 / 죽은 얼룩 원액을 준비하십시오. 형광 염색을 20 μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)로 재구성한다.
- 바이알을 호일에 싸서 "재구성 된"것으로 표시 한 다음 최대 6 개월 동안 -20 ° C에 보관하십시오.
- 헤파린으로 0.9 % 식염수 용액을 준비하십시오. 헤파린 나트륨 (10 mL 당 10,000 USP 단위)의 1 바이알의 내용물을 이중 증류수 (ddH2O) 1 L에 희석하십시오.
- 동물당 약 45mL를 충분히 준비하고 4°C에서 최대 일주일 동안 보관한다.
- 1 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 만드십시오.
- 흄 후드에서, 핫플레이트를 50°C로 가열한다. 마이크로파에서, 유리 비이커에서 100 mL의ddH2O를 대략 60°C로 가열한다. 마그네틱 교반 바를 추가하고 핫 플레이트로 옮깁니다. ....
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결과
샘플은 핵심 시설에서 유세포 분석기로 처리되었고, 결과 데이터는 유동 분석을 위한 소프트웨어 패키지로 평가되었다. 이전에는 보상 대조군 (생사 얼룩 및 음성 대조군)을 분석했습니다. 여러 개의 형광이 사용되는 경우, 형광 마이너스 하나 (FMO) 대조군 및 단일 염색 대조군이 각 항체에 대해 준비되어야 한다. 실험 샘플에 대한 스펙트럼 중첩에 대한 보상은 분석된 대조군에 기초하여 계산되었다. 세포 집단 식별을 위해, 계층적 게이팅 전략이 사용되었다. 일차 게이트는 전방 산란(셀 크기) 대 측면 산란(세분성) 플롯19,20에서 파편을 제외시켰다. 이어서, 죽은 세포를 배제하였다(도 4, 도 5, 도 6, 보충 도 1, 보충 도 2, 보충 도 3, 및
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토론
이 신경 해리 프로토콜의 몇 가지 단계는 능숙한 기술과 손재주 - 관류, 상청 흡인 및 미엘린 제거가 필요합니다. 관류 과정 전반에 걸쳐 내부 장기는 손상되지 않아야합니다 (횡격막을 제거하고 심장을 자르는 것 외에); 이것은 나비 바늘로 심장의 상부 챔버를 피하는 것을 포함합니다. 필요한 헤파린을 함유 한 식염수의 양은 다양하지만 심장에서 흐르는 투명한 유체는 과정이 완료되었음을 나타냅니다. 뇌는 완전하고 적절하게 관류되어야 하며, 이 때 뇌는 흰색이 아닌 것처럼 보입니다(그림 1). 관류와 함께, 적혈구 제거 단계는 외래 적이 되어, 세포 손실을 초래할 수 있는 샘플의 과도한 조작을 제거한다. 이어서, 이물질 제거 단계는 꾸준한 손을 필요로 한다. 원심분리가 D-PBS 오버레이에 따라 명확하게 정의된 층들을 초래하기 위해서는(그림 3), 층들이 수송 중에 또는 피펫팅하는 동안 방해받지 않아야 한다. 또한, 상위 두 층을 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
실습 교육과 지속적인 제품 지원을 제공해 주신 Aimee Rogers에게 감사드립니다. 지속적인 문제 해결과 명확한 토론에 대해 Amanda Burke 박사님께 감사드립니다. 이 원고의 문법적 편집 및 서식에 대해 Meredith Joheim과 UAMS Science Communication Group에 감사드립니다. 본 연구는 NIH R25GM083247 및 NIH 1R01CA258673 (ARA)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, 다양한 색상 |
| 15 mL 팔콘 튜브 | Becton Dickinson Labware 유럽 | 352009 | 폴리스티렌 |
| 25 mL 혈청학 피펫 | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관 | Falcon | 352052 | |
| 500 mL 진공 필터/ 보관 병 시스템 | Corning | 431097 | |
| 70 μ m 세포 여과기 | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 성인 뇌 해리 키트 | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | 효소 P, 버퍼 Z, 버퍼 Y, 효소 A, 버퍼 A, 파편 제거 용액 |
| 포함 알루미늄 호일 | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, 마우스, 클론 REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| 안티 미엘린 염기성 단백질 | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| 안티 PSA-NCAM-PE, 인간, 마우스 및 쥐, 클론 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, 마우스, 클론 REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 항체 | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| 세라믹 핫 플레이트 교반기 | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| 디메틸 설폭사이드 | 피셔 사이언티픽 | BP231-100 | |
| 에탄올 | 팜코 by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 파인 가위 - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD( | v10.7.0) | |
| gentleMACS C 튜브 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| 히터가 있는 gentleMACS Octo 해리레이터 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| 유리 비커 | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| 헤파린 나트륨 | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD 고정식 아쿠아 데드 셀 스테인 키트 | ThermoFisher | L34965 | |
| 마그네틱 스티어 바 | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes 스프링 가위 | 파인 사이언스 도구 | 15012-12 | 해부 |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| 피펫 팁 GP LTS 20 µ L 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| 피펫 팁 GP LTS 250 &마이크로; L 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| 피펫 팁 RT LTS 1000 &마이크로; L FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μ L) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| 뚜껑이 있는 원형 얼음 양동 | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
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| 주걱 & 프로브 | 정밀 과학 도구 | 10090-13 | 해부 및 Perfusion |
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| 가변 흐름 연동 펌프 | Fisher Scientific | 13-876-2 | 저유량 모델 |
| VetFlo 스타터 키트, | 마우스 Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | 마취 마스크, 튜브, 유도 챔버, 숯 캔 |
| VetFlo 증발기 단일 채널 마취 시스템 | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2– 4 LPM |
| Vi-CELL XR 세포 생존도 분석기 | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | 세포 계수 |
| Vi-CELL XR 시료 바이알 4 | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | 세포 계수 |
참고문헌
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences ....
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