이 프로토콜은 연쇄상 구균 베네수엘라 세포 없는 전사 변환(TX-TL) 시스템에서 재조합 단백질의 높은 수율을 합성하는 향상된 방법을 자세히 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
연쇄상 구균 spp. 임상 항생제와 산업 화학 물질의 주요 소스. 연쇄상 구균 베네수엘라 ATCC 10712는 빠르게 성장하는 균주와 클로람페니콜, 자도마이신 및 피크로마이신의 천연 생산업체로 차세대 합성 생물학 섀시로서 매력적인 후보로 만듭니다. 따라서 S. 베네수엘라 ATCC 10712의 개발을 가속화하는 유전 적 도구뿐만 아니라 다른 연쇄상 구균 spp. 모델은 천연 제품 엔지니어링 및 발견에 매우 바람직합니다. 이를 위해, 전담 S. 베네수엘라 ATCC 10712 세포 없는 시스템은 높은 G+C(%) 유전자의 고수율 이종 발현을 가능하게 하기 위하여 이 프로토콜에 제공됩니다. 이 프로토콜은 96-well 또는 384웰 플레이트 형식으로 소규모(10-100 μL) 배치 반응에 적합하며 반응은 잠재적으로 확장 가능합니다. 세포 없는 시스템은 견고하며 최소한의 설정으로 다양한 재조합 단백질에 대해 높은 수율(~5-10 μ M)을 달성할 수 있습니다. 이 작품은 또한 mRNA와 단백질 합성의 실시간 측정을 위한 광범위한 플라스미드 툴셋뿐만 아니라 태그가 지정된 단백질의 인겔 형광 염색을 통합합니다. 이 프로토콜은 또한 액티노미세테스 게놈에 존재하는 높은 G+C(%) 유전자에서 효소 통로의 높은 처리량 유전자 발현 특성화 워크플로우 또는 연구와 통합될 수 있습니다.
서론
세포 없는 전사 번역(TX-TL) 시스템은 합성 생물학을 위한 개념 엔지니어링 프레임워크인 신속한 설계-빌드-테스트 학습 주기를 구현하기 위한 합성 생물학을 위한 이상적인 프로토타이핑 플랫폼을 제공합니다1. 또한, 개방형 반응 환경에서 고부가가치 재조합 단백질 생산을 위한 TX-TL 시스템에 대한 관심이 증가하고 있다2, 예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트에 비표준 아미노산을 통합하는 3. 구체적으로, TX-TL은 세포 추출물, 플라스미드 또는 선형 DNA, 및 단백질 합성을 배치 또는 반연속 반응으로 촉매하는 에너지 용액을 필요로 한다. 대장균 TX-TL이 지배적인 세포 없는 시스템이지만, 다수의 신흥 비모델 TX-TL 시스템은 다양한 응용 분야에서 주목을 받고 있습니다4,5,6,7,8. TX-TL의 주요 장점은 유연한 확장성(나노리터에서 리터 스케일까지)
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프로토콜
참고: GYM 매체 및 한천 플레이트 및 S30A 및 S30B 세척 버퍼용 레시피는 표 1 및 표 2 를 참조하십시오.
1. 솔루션 준비 및 일반 지침
- 예외가 명시되지 않는 한 준비 후 모든 솔루션, 세포 (성장 후) 및 세포 추출물을 얼음에 보관하십시오.
- Mg-글루타메이트 1개, M-K-글루타메이트 4M, PEG 6000, 실온1g/mL 폴리비닐술포닉산, -80°C의 기타 모든 주식에 대한 재고를 저장합니다. 화학 적 분해를 방지하기 위해 동결 해동 주기의 수를 최소화합니다.
- 3-PGA(pH 조정 필요)와 같은 에너지 솔루션 주식( 표 3 참조)의 준비를 위해 대장균 TX-TL 프로토콜41에 제공된 지침을 따릅니다.
참고: 모든 구성 품은 ddH2O에서 완전히 용해되고 -80 °C 냉동고에 알리쿼시로 저장됩니다. - 얼음에 개별 주식 또는 에너지 솔루션 (나중에 설명)을 해동. 아미노산 스톡을 42°C에서 42°C에서 15-30분 동안 소용돌이로 가열하여 모든 아미노산을 용해시합니다.
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결과
이 상세한 프로토콜은 사용자가 S. 베네수엘라 ATCC 10712 모델 스트레인(그림 1)에 기초하여 연쇄상 구균 TX-TL 시스템을 설정하는 데 도움이 되는 예로 제공됩니다. 사용자는 다른 연쇄상 구균 균주를 연구하려고 할 수 있습니다; 그러나, 더 긴 두 배 또는 뚜렷한 성장 환경 설정을 가진 다른 균주의 성장/수확 단계피크 결과를 달성 하기 위해 사용자 정의 최적화 해야 합니다. 대표적인 결과를 위해, pTU1-A-SP44-mScarlet-I 표준 플라스미드(도 2 및 도 3)로부터의 mScarlet-I 형광 단백질은 다양한 검출 방법(SDS-PAGE, 형광)을 통해 S. 베네수엘라 TX-TL에서 고수율 발현을 제공하도록 최적화하였다. 또한, 이러한 표준 .......
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토론
이 원고에서는 고수익 S. 베네수엘라 TX-TL 프로토콜이 TX-TL 시스템의 숙련된 사용자와 신규 사용자 모두를 위해 간단하게 수행할 수 있는 상세한 단계로 설명되었습니다. 기존 연쇄상 구균45 및 대장균 TX-TL41 프로토콜의 여러 기능이 제거되어 S. 베네수엘라 TX-TL5,26에 대한 최소하면서도 고수율 프로토콜을 확립했습니다. 여기에 권장되는 워크플로우는 S. 베네수엘라가 선택한 풍부한 매체에서 빠르게 성장하고 저녁에 최종 문화를 접종할 수 있도록 하는 것입니다. 이를 통해 다음 날 아침 최대 성장시 세포 수확을 허용하고 사용자가 같은 날 활성 세포 추출물을 수확하고 준비할 수 있게 합니다. 이 간소화된 프로토콜을 따라 단일 연구원이 3일 프레임워크에.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 다음과 같은 연구 지원을 인정하고 싶습니다: PSF와 PDRA로 SJM에 대한 EPSRC [EP/K038648/1]; 웰컴 트러스트는 런던 임페리얼 칼리지에서 PSF와 SJM을 위한 ISSF 펠로우십을 후원했습니다. 왕립 학회 연구 보조금 [RGS\R1\191186]; 웰컴 트러스트 시드 상 [217528/Z/19/Z] 켄트 대학에서 SJM에 대 한; 켄트 대학교에서 KC를 위한 글로벌 챌린지 연구 기금(GCRF) 박사 장학금.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2.5L 울트라수율 플라스크 | 톰슨 | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 웰 블랙/클리어 바닥판 | ThermoFisher | 10692202 | |
| 염화암모늄 (98%) | 플루오로켐 | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM 용액, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (순도에 대해서는 공급업체에 문의) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (순도에 대해서는 공급업체에 문의) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥ 98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (순도는 공급업체에 문의) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (순도는 공급업체에 문의) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (순도는 공급업체에 문의) | Melford | B2001 | |
| L-글루탐산, 헤미마그네슘염, 사수화물(>98%) | , 시그마 | 49605 | |
| 염화마그네슘(98%) | 플루오로켐 | 494356 | |
| 맥아 추출물 | 시그마 | 70167-500G | |
| , PEG-6000 | 시그마 | 807491 | |
| 피어스, 96웰 미세투석 플레이트, 10K MWCO | , ThermoFisher | 88260 | |
| 폴리(비닐 황산염), 칼륨염 | 시그마 | 271969 | |
| 글루타민산 칼륨(>99%) | , 시그마 | G1149 | |
| RTS 아미노산 샘플러 | , 5 프라임 | 2401530 | |
| 염화나트륨(99%) | , 플루오로켐 | 94554 | |
| Supelclean LC-18, SPE, C-18, SPE 컬럼(1g) | , 시그마 | 505471 | |
| 효모 추출물 | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | 오메가 |
참고문헌
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
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재인쇄 및 허가
