지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
전자 결정학은 고해상도 구조 측정을 위한 강력한 도구입니다. 수용성 또는 막 단백질과 같은 거대 분자는 유리한 조건하에서 고도로 정렬된 2차원(2D) 결정으로 재배될 수 있다. 2D 이미지 처리를 통해 최종 재구성의 해상도에 성장된 2D 결정의 품질은 매우 중요합니다. 수년에 걸쳐, 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위해 지원 층으로 사용되었습니다. 이 방법은 또한 일체형 막 단백질의 2D 결정화에 적용될 수 있지만 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다. 지질 단층은 극지 지질 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지하고 비 극성, 아실 체인, 꼬리 분할을 공기로 분할하여 표면 장력을 깨고 수면을 평평하게 하는 공기-물 인터페이스에서 형성됩니다. 헤드 그룹의 충전 된 자연 또는 독특한 화학 적 moieties는 용액의 단백질에 대한 친화력을 제공하여 2D 어레이 형성에 대한 결합을 촉진합니다. 2D 어레이를 가진 새로 형성된 단층은 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 구리 그리드에서 전자 현미경(EM)으로 쉽게 이송될 수 있다. 이 작품에서, 우리는 극저온 전자 현미경 (극저온-EM) 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론을 기술합니다.
서론
2D 결정 또는 단백질의 헬릭 어레이를 통한 전자 회절은 유리한 경우1,2,3에서하위 나노미터 분해능을 달성할 수 있다. 특히 관심은 근원 환경1에서2D 멤브레인 단백질 어레이 또는 결정으로 재구성된다. 결정은 특정 공간 주파수에서 구조 적 인자의 강도를 향상시키는 신호 증폭기역할을하기 때문에, 전자 결정학은 단일 입자 저온-EM에 대한 것보다 작은 분자와 같은 고해상도에서 더 작은 크기로 대상을 프로빙 할 수 있습니다. 전자 빔은 주문된 2D 단백질 배열에 의해 확산될 수 있으며, 검출기4에이미지 평면이 기록되는 위치에 따라 회절 패턴 또는 격자 이미지를 생성한다. 그 때 디질화 된 강도는 추출 및 크리스탈의 2D 프로젝션 구조를 재구성하기 위해 처리 될 수있다. 전자는 엑스레이보다 더 큰 산란 단면을 가지며, 그 산란은 주로 분자5에서전자와 충전된 원자 사이의 쿨롬 상호 작용을 기반으로 하는 러더포드 모델을 따릅니다. 2D 멤브레인 결정의 두께는 일반적으로 100 nm 미만이며, 표본
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프로토콜
1. 테플론 블록 준비
- 화학성 PTFE(폴리테트라플루오로로틸렌) 수지로부터 테플론 블록을 준비합니다. 일반 드릴을 사용하여 블록에 구멍을 만들고 그림 1에표시된 치수를 만듭니다.
2. 모노레이어 지질 제제
참고: 예상 작동 시간: 30-45분
- 지질 재고 준비
- 9:1 (v/v) 클로로폼/메탄올에 0.01 mg/mL 지질 혼합물을 준비하여 8.91mL의 클로로폼, 메탄올 0.99mL, 10 mg/mL 지질의 0.01mL를 사용한다.
- 테플론 플레이트 준비
- 메탄올 욕조에서 테플론 접시를 5분간 초음파 처리합니다.
- 뜨거운 물로 15분간 씻으시면 됩니다.
- 증류수로 헹구는 다.
- 데프론 플레이트를 건조기에서 30분 간 건조시키고 사용하지 않을 때진공 상태로 유지하십시오(그림1).
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결과
EM 그리드에 증착된 지질 단층은 염색없이 전송 전자 현미경(TEM)으로 시각화될 수 있다. 단층의 존재는 빔 경로에 시편이 없는 영역과 의대조 차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 커버리지가 있는 영역은 비어 있는 구멍을 통해 전자 빔이 산란되지 않고 더 밝은조명(도 3)을나타내기 때문에 커버리지가 없는 영역보다 국부적 대비가 낮습니다.
2D 단층 결정화의 조건을 검사하려면 네거티브 얼룩 EM 또는 극저온-EM 이미징을 사용하여 시편의 이미지를 조사합니다. 단층이 구멍을 덮는지 여부는 스테이지가 기울어질 때 더 강한 가장자리 대비로 관찰될 수 있습니다. 결정이 형성되면 이미지 전원 스펙트럼 또는 주기각표가 포리에 또는 회절 반점을 표시합니다. 작은 크기(< 200nm)의 크리스탈과 임의로 지향되는 결정은 전력 스펙트럼에서 고강도 링을 나타낼 수 있다. 결정이 재배되지 않으면 파워 스펙트럼에 Fourier 반점이 표시되지 .......
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토론
지질 단층은 생물학적 거대 분자의 구조 연구를 위한 대형 2D 결정의 성장을 용이하게 하는 강력한 도구입니다. 공기-물 인터페이스에서 온전한 지질 단층층을 성공적으로 준비하기 위해 지질 아실 체인의 산화가 단층의 포장 중단으로 이어질 수 있고 그로 인한 결정 형성에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 실험 당일에 지질을 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 분말 형태로 구입한 지질은 일반적으로인지질(35)을용해시키는 데 사용되는 클로로폼:메탄올 용매의 혼합물을 사용하여 용해되어야 한다. 클로로폼:메탄올 용매는 밀봉된 유리 바이알에 미리 만들어 보관할 수 있다. 용존지질은 공기-물 인터페이스에 적용되는 동안 클로로폼:메탄올 용매가 완충제에서 완전히 증발할 때까지 기다립니다. 지질 단층의 형성과 2D 결정의 형성을 위한 적당한 대기 시간은 이 실험에서 필수적입니다. 전형적으로, 지질 단층 및 2D 어레이의 형성은 인큐베이션 시간18의약 30 60 분 이내에.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해상충이 없습니다.
감사의 글
이 원고의 준비는 부분적으로 P.-L.C에 미 육군 연구 실 (W911NF2010321)과 애리조나 주립 대학 시작 기금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 |
| mL 소형 피펫용 전구 | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| 클로로포름 | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| 데시케이터 진공 | Southern Labware | 55207 | |
| EM 그리드 | 전자 현미경 과학 | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 &마이크로; M 홀, 1.3 &마이크로; m 공간 |
| 여과지 | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | 직경 90mm |
| 유리 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton 주사기(25 &마이크로; L) | Hamilton Company | 80465 | |
| 해밀턴 주사기(250 &마이크로; L) | Hamilton Company | 81165 | |
| 해밀턴 주사기 (5 µ L) | Hamilton Company | 87930 | |
| 해밀턴 주사기 (500 µ L) | Hamilton Company | 203080 | |
| 메탄올 | 시그마-알드리치 | M1775-1GA | |
| 페트리 접시 | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| 테플론 블록 | Grainger | 55UK05 | 60 µ 측면 주입 포트가 있는 L 웰, 수동으로 만든 |
| 핀셋 | 전자 현미경 과학 | 78325 | 다양한 스타일 |
| 초순수 | |||
| 초음파 세척기 | VWR | 97043-996 |
참고문헌
- Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
- Avila-Sakar, A. J., Chiu, W.
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재인쇄 및 허가
