여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.
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이 논문에서
요약
초록
정상 상태에서 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 크게 정지 상태로 유지되며 에너지 요구를 충족시키기 위해 주로 당분해에 의존하는 것으로 여겨집니다. 그러나 감염이나 혈액 손실과 같은 스트레스 조건 하에서, HSC는 증식 성이되어 하류 전구 세포를 빠르게 생산하여 차례로 분화되어 궁극적으로 성숙한 혈액 세포를 생산합니다. 이 전이 및 분화 과정 동안 HSC는 정지에서 빠져 나와 글리코 분해에서 산화 인산화 (OxPHOS)로 대사 전환을 빠르게 겪습니다. 노화, 암, 당뇨병 및 비만과 같은 다양한 스트레스 상태는 미토콘드리아 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 조혈 중 HSC 및 선조의 대사 재 프로그래밍 및 분화를 변화시킬 수 있습니다. 정상 및 스트레스 조건 하에서 HSC와 선조의 글리콜 및 미토콘드리아 기능에 대한 귀중한 통찰력은 각각 세포 당 분해 및 미토콘드리아 호흡의 지표 인 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비율 (OCR)의 평가를 통해 얻을 수 있습니다.
여기서, 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 조혈 줄기 및 원시전구 세포(HSPCs)를 모두 포함하는 마우스 골수 유래 혈통-음성 세포 집단에서 ECAR 및 OCR을 측정하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 마우스 골수로부터 혈통 음성 세포를 분리하는 접근법을 설명하고, 세포 시딩 밀도 및 2-데옥시-D-글루코오스(2-DG, 당분해를 억제하는 글루코스 유사체) 및 이러한 분석에 사용되는 다양한 OxPHOS 표적 약물(올리고마이신, FCCP, 로테논 및 안티마이신 A)의 농도 최적화를 설명하고, 약물 치료 전략을 설명합니다. 당분해, 글리콜 용량 및 글리콜 보유량과 같은 글리콜 플럭스의 주요 파라미터, 및 OxPHOS 파라미터, 예컨대 기저 호흡, 최대 호흡, 양성자 누출, ATP 생산, 예비 호흡 용량 및 커플링 효율은 이들 분석에서 측정될 수 있다. 이 프로토콜은 비부착성 HSPC에 대한 ECAR 및 OCR 측정을 허용하며 모든 유형의 현탁액 셀에 대한 분석 조건을 최적화하도록 일반화할 수 있습니다.
서론
조혈은 고도로 전문화 된 기능을 가진 다양한 유형의 성숙한 혈액 세포가 HSC1에서 형성되는 과정입니다. HSC는 자기 갱신 및 다양한 다능성 및 혈통 특이적 선조 집단으로 분화 할 수 있습니다. 이 선조는 궁극적으로 림프구, 골수성, 에리스로이드 및 거핵구 혈통의 세포를 생산합니다. 자기 재생 능력을 유지하기 위해 HSC는 크게 정지 상태로 유지되며 다른 조직 줄기 세포와 마찬가지로 ATP 생산 2,3을 위해 미토콘드리아 OxPHOS보다는 당분해에 의존하는 것으로 여겨집니다. 세포 주기로의 진입은 향상된 호흡 및 OxPHOS로 이어지고, 그 결과 HSC 유지 및 기능3에 해로운 반응성 산소 종(ROS)의 수준이 상승한다. 따라서 반복되는 세포 분열은 HSC의 자기 재생 능력을 감소시키고 궁극적으로 고갈로 이어질 수 있습니다.
성인 조혈에서 HSC는 주로 비대칭 세포 분열을 겪으며, 그 동안 딸 세포 중 하나가 HSC 잠재력을 유지하고 글리콜 대사에 계속 의존합니다. 다른 딸 세포는 자기 재생 능력을 잃지만 증식하고 결국 분화 된 기능적 조혈 세포를 일으....
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프로토콜
모든 척추동물 실험은 미시간 대학교 동물 사용 및 관리 위원회의 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1. 분석 전날 (총 시간 : ~ 10 분)
- 센서 카트리지의 수화 (스텝 타임: ~10분)
- 세포외 플럭스 분석 키트를 열고 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트 어셈블리를 분리합니다. 다음날 사용할 수 있도록 적재 가이드 플랫을 저장하십시오.
- 센서 카트리지(뚜껑이 있는 상단 녹색 부분)를 유틸리티 플레이트(하부 96웰 마이크로플레이트)에서 수동으로 분리하고 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.
- 다중 채널 피펫을 사용하여, 유틸리티 플레이트의 각 웰을 플럭스 분석 키트에 포함된 200μL의 캘리브란트로 채운다.
- 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 올려 놓고 센서를 캘리브란트에 완전히 잠기십시오.
- 조립된 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트를 교정제와 함께 비CO2 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓는다. 캘리브란트의 증발을 방지하려면 인큐베이터가 제대로 가습되었는지 확인하십시오. 비CO2 37°C 인큐베이션을 위해 규칙적인 오븐 인큐베이터를 사용하는 경우, 물을 함유하는 개방된 비커를 인큐....
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결과
이 프로토콜을 사용하여, 다양한 OxPHOS 표적 약물의 세포 수 및 농도(세포외 플럭스 분석에 사용됨)를 최적화하여 24주령의 암컷 C57BL/6 마우스로부터 분리된 HSPC의 ECAR 및 OCR을 측정하였다. 먼저, 세포 수 및 올리고마이신 농도를 최적화하기 위해 당분해 스트레스 시험을 수행하였다. 웰당 5 내지 104 내지 2.5 × 10,5 범위의 다양한 수의 HSPCs가 이 검정× 사용되었다. 도 2A 및 도 2C에 나타난 바와 같이, 비글리콜성 산성화 속도는 세포 수가 5 내지 10 내지 4에서 2.5 × 10 5로 증가×면서 상승하지만, 2 내지 10 5 내지 5 × 10 5내지 2.5 사이×만 최소한으로증가한다. 예상대로, 10 mM 글루코스의 주사는 모든 세포 수에서 당분해를 자극하며, EC.......
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토론
이 방법 논문은 Seahorse 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 마우스 HSPCs에서 세포 생물에너지학(당분해 및 OxPHOS)의 평가를 위한 최적화된 프로토콜을 기술한다. 이 장치는 각각 글리코 분해 및 미토콘드리아 호흡의 메트릭 인 살아있는 세포의 ECAR 및 OCR을 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 따라서, 세포 생물에너지를 실시간으로 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 96웰 마이크로플레이트 기반 플랫폼은 고감도로 고처리량 정량화를 제공하므로 2개의 샘플만 동시에 분석할 수 있는 다른 고해상도 호흡계인 Oroboros O2k 또는 클래식 Clark 전극(20)과 비교하여 단일 플레이트를 사용하여 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다.
세포외 플럭스 분석기는 세포가 단층으로 존재해야 하기 때문에 부착성 세포 유형의 분석에 주로 사용되어 왔으며, 현탁액에서 성장한 세포를 분석하는 것이 더 어려워졌습니다. 더욱이, 포트로부터의 약.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
롬바르드 실험실에서의 작업은 NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 및 ME200030) 및 Glenn Foundation for Medical Research의 지원을 받습니다. Li 실험실에서의 작업은 NIH (NHLBI 5R01HL150707)에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 &무; m 필터 | Corning | 430626 | 여과-멸균하는 데 사용됨 |
| Life Technologies | 11360-070 | 미토콘드리아 스트레스 테스트 분석 매체의 구성 요소 | |
| 15mL 원뿔형 팔콘 튜브 | Corning | 352096 | HSPC 수확 및 분석 약물 용액 준비 중에 사용 |
| 200mM L-글루타민 | Life Technologies | 25030-081 | 해당과정 스트레스 테스트 및 미토콘드리아 스트레스 테스트의 구성 요소 분석 매체 |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375 | 해당과정 스트레스 테스트 중 3차 약물 주입 |
| 5x 농축 완충액(MojoSort) | Biolegend | 480017 | HSPC 수확 중 세척에 사용 |
| 염화암모늄(NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-3 | ACK 용해 구성 요소 완충액 |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | 미토콘드리아 스트레스 테스트 중 3차 약물 주입 |
| Bio-Rad DC 단백질 분석 키트 | Bio-Rad | 500-0112 | 제조업체의 지침에 따라 사용 |
| 카르보닐 시안화물-4(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP) | 시그마-알드리치 | C2920 | 미토콘드리아 스트레스 테스트 중 2차 약물 주입 |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | 셀 접착제. 세포 마이크로 플레이트 백 |
| 3 자동 세포 계수기 | ThermoFisher Scientific | 세포 계수 | |
| EDTA | Fisher Scientific | O2793-500 | ACK 용해 완충액 및 RIPA 용해 완충액의 구성 요소 |
| Falcon 70 &mu 코팅에 사용됩니다. m 필터 | Fisher Scientific | 08-771-2 | HSPC 수확 중 세포 여과기로 사용 |
| Gibco Fetal bovine serum(FBS) | Fisher Scientific | 26400044 | HSPC 수확 중 분석 완충액을 준비하는 데 사용 |
| Gibco HBSS | Fisher Scientific | 14175095 | HSPC 수확 중 분석 완충액을 준비하는 데 사용 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | 미토콘드리아 스트레스 테스트 분석 배지 및 해당과정 스트레스 테스트의 첫 번째 주입 |
| 올리고마이신 | 시그마-알드리치 | O4876 | 해당과정 스트레스 테스트 중 2차 약물 주입 및 미토콘드리아 스트레스 테스트 중 1차 약물 주입 |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | 단백질 정량화를 위한 분석 후 세포를 세척하는 데 사용 |
| 중탄산칼륨(KHCO3) | Fisher Scientific | P235-500 | ACK 용해 완충액 |
| Protease Inhibitor Cocktail(PIC) | Roche | 11836170001 | 정제로 공급됩니다. 1정을 10mL의 RIPA 완충액에 용해시켜 1x PIC를 만들었습니다. |
| Rat biotin antimouse-B220, 클론 ID: RA3-6B2 | Biolegend | 103203 | HSPCs 수확 중 계통 고갈에 사용됨 |
| Rat biotin antimouse-CD2, 클론 ID: RM2-5 | Biolegend | 100103 | HSPCs 수확 중 혈통 고갈에 사용됨 |
| Rat biotin antimouse-CD3, 클론 ID: 17A2 | Biolegend | 100243 | HSPCs 수확 중 혈통 고갈에 사용됨 |
| Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3 | Biolegend | 100603 | HSPCs harvest rat |
| biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7 | Biolegend | 100703 | HSPCs harvest while lineage depleation during HSPCs harvest Rat |
| biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5 | Biolegend | 108403 | HSPCs harvest during lineage depleation during HSPCs Rat |
| biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119 | Biolegend | 116203 | HSPC 수확 중 혈통 고갈에 사용 |
| Rotenone | , Sigma-Aldrich, | R8875 | 미토콘드리아 스트레스 테스트 중 3차 약물 주입 |
| Seahorse XFe96, 세포외 플럭스 분석기 | Seahorse Biosciences, 이제 Agilent | ECAR 및 OCR 실시간 측정용. | |
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| 수산화 나트륨 (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | 1 N 용액을 준비했습니다. pH 정규화에 사용 |
| Streptavidin Nanobeads (MojoSort) | Biolegend | 480015 | HSPCs 수확 중 혈통 고갈에 사용 |
| Tris-HCl | Fisher | BP153 | RIPA 용해 완충액의 구성 요소 |
| XF 염기 배지 | Agilent | 102353-100 | 염기 배지 해당작용 스트레스 테스트 및 미토콘드리아 스트레스 테스트 분석 매체 |
| XF 준비 스테이션 | Seahorse 비 | 2 37 ° C incubations | |
| XFe96 extracellular FluxPak | Agilent | 102416-100 또는 102601-100 | 유틸리티 플레이트가 있는 어세이 카트리지, 어세이 카트리지에 약물 로딩을 위한 로딩 가이드 플랫, XF 캘리브란트 용액 및 XF 세포 배양 마이크로플레이트가 포함되어 |
참고문헌
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019
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재인쇄 및 허가
