박테리아 스크리닝, 선택 및 격리를 위한 광분해성 하이드로겔 인터페이스

Summary

고해상도 광 패터링 도구를 이용하여 세균 세포를 분리하기 위해 광분해성 하이드로겔을 사용하는 것이 보고된다. 프로세스의 필수 실험 절차, 결과 및 이점을 검토합니다. 이 방법은 이질적인 지역 사회 또는 인구에서 희귀하거나 독특한 기능을 보여주는 표적 박테리아의 신속하고 저렴한 격리를 가능하게합니다.

Abstract

생물학자들은 오랫동안 표현형과 유전자형 사이의 관계를 이해하려고 노력해 왔습니다. 이 연결을 더 잘 이해하기 위해, 다운스트림 유전 분석을 위한 고순도에서 세포 격리와 현미경 세포 검열을 결합하는 실용적인 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서, 이질적인 세포 집단으로부터 독특한 성장 표현형을 가진 박테리아의 스크리닝 및 절연을 위한 광분해성 폴리(ethylene glycol) 하이드로겔의 사용이 설명된다. 이 방법은 하이드로겔로 세포를 캡슐화하거나 포획한 다음 배양, 현미경 스크리닝, 하이드로겔 분해 및 선택된 세포의 방출을 위한 고해상도 라이트 패터닝 도구를 사용하여 검색용 솔루션으로 사용합니다. 다른 빛 패턴을 적용하면 추출 된 세포의 형태에 대한 제어를 할 수 있으며, 링이나 십자가와 같은 패턴은 분리에 대한 DNA 손상을 완화하기 위해 최소한의 직접 UV 광 노출로 세포를 검색하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 라이트 패터닝 툴은 다양한 분해 및 세포 방출 속도를 달성하기 위해 조절 가능한 광 용량을 제공합니다. 고해상도로 분해할 수 있으므로 미크로네 규모의 공간 정밀도로 세포 검색을 가능하게 합니다. 여기서, 이 물질의 사용은 대량 하이드로겔과 마이크로 패브릭 실험실 온 칩 장치에서 박테리아를 선별하고 회수하는 것이 입증된다. 이 방법은 저렴하고 간단하며 돌연변이 라이브러리에서 희귀 한 성장 프로파일을 가진 세균 균주의 격리 및 게놈 특성에 대한 응급 표현형을 가진 세균 성 동종의 격리를 포함하여 미생물학의 일반적이고 새로운 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

Introduction

복잡하고 이기종 환경에서 독특한 행동을 가진 세포의 격리는 생물학^1에서유전 정보를 얻기위한 기본이다. 미생물학에서는 관찰 후 희귀하거나 독특한 미생물의 선택과 격리가 게놈 정보와 관찰 가능한 현상 정보 사이의 연결을 필요로하는 많은 응용 분야에서 중요해집니다. 이러한 응용 분야에는 돌연변이 라이브러리^2에서페노전형 희귀 균주를 선택하고, 복잡한 미생물 커뮤니티^3,4에서키스톤 미생물을 선택하고, 동종 포집단으로부터 희귀하지만 중요한 박테리아를 선택하는 것이 포함된다. 박테리아 집단으로부터 생존 가능하지만 비과성 세포(VBNC)의 격리는 VBNC 표현형을 가진 세포가 종종 1:10² 에서 1:10^{5 비55의}박테리아 집단에 숨겨져 있는 후자의 중요한^{예입니다.} 박테리아 격리에 있는 광범위 한 어려움으로 인해, 많은 페노 전형적으로 희귀 한 미생물에 대 한 알 수 없는 남아. 이러한 제한은 먼저 혼합물에서 표적 세포 또는 세포를 식별한 다음 다운스트림 분자 분석^7을위해 이를 검색및 격리하는 세포 격리 기술의 필요성을 강조한다.

세포 격리의 가장 일반적으로 확립된 방법 중 일부는 유혈 세포 측정 및 형광 활성 세포 분류(FACS)^8,면역자기 분리^9,10및 미세^{유체(11)를}포함한다. 이러한 격리 메서드는 값이 높지만 사용을 제한하는 단점도 있습니다. 예를 들어, FACS는 후속 게놈 분석^3에 대한 단일 세포 수준에서 일상적인 미생물 격리를 제공할 수 있지만, 종종 다운스트림 오염^{문제(11)뿐만}아니라 가용성 및 비용에 의해 제한됩니다. 미세유체 유체 계세포측정과 같은 미세유체 기반 접근법은 많은 관심을 얻었으며, 이는 종래의 유동 세포측정에 비해 필요한 샘플^{부피(12)의}현저한 감소를 허용한다. 그러나, 미세유체 장치에서 개별 또는 작은 셀 수집의 분리 및 회수는 일반적으로 보다 복잡한 설정 및 장치^{설계(13)를}요구하는 어려운 문제이다. 많은 미세 유체 기반 접근법은 기능성 화면을 수행할 때 관찰된 독특한 종의 수를 제한하는^{장치(14)에서}입력및 관찰되기 전에 유전적으로 세포를 특성화한다. 이러한 한계를 감안할 때, 많은 실험실에서 광범위하게 사용하기 위해서는 세포 선별 및 격리에 실용적인 방법과 재료의 추가 혁신이 필요합니다.

이 논문은 박테리아 스크리닝 및 격리를 위한 새로운 재료 기반 접근법을 제시합니다. 이 방법은 세포 캡슐화, 배양, 미세 관찰, 고유한 표현형을 가진 표적 박테리아의 온디맨드 방출 및 회복을 위해 광분해성 하이드로겔을 사용합니다. 하이드로겔은 10nm 메쉬 크기를 포함하도록 설계되었으며, 각 크로스링크에는 o-니트로벤질^{그룹(15)이}포함되어 있습니다. 이 물질은 관찰을 위해 세포를 캡슐화하거나 트랩하는 동시에 배양을 위해 세포에서 영양분과 폐기물을 확산시킬 수 있게 합니다. 직립 현미경을 통해 패턴365 nm UV 광원에 물질을 노출하면 o-니트로벤질 그룹 ^16,17의광분열을 통해 하이드로겔의 국소 분해를 가능하게 한다. 분해는 유전체학 및 잠재적으로 프로테오믹 및 전사 분석을 포함하여 다운스트림 분석을 위한 회복을 위한 세포의 선택적 방출을 유발합니다. 실험 적인 설치 및 프로토콜은 상대적으로 간단, 저렴 한, 그리고 미생물학 실험실에 번역. 하이드로겔 형성, 수직 밝은 필드 및 형광 현미경을 가진 포획 된 세포의 관찰, 검색을위한 패턴 UV 광원으로 관심있는 세포의 조명을 통해 세포 캡슐화만 필요합니다.

이 재료 기반 검진 방식의 주요 장점은 다양한 스크리닝 형식에 대한 적응성입니다. 가장 기본적인 형식으로, 재료는 대량 하이드로겔에 이질 세포 수집을 캡슐화하여 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 세포는 원하는 표현형에 대해 관찰되고, 유전체 특성화를 위해 개별 적인 관심 세포가 제거된다. 보다 정교한 형식으로 재료는 랩 온-칩 장치에 통합되어 장치의 원하는 영역에서 정확한 셀 방출 및 검색을 제공할 수 있습니다. 두 형식 모두 여기에 설명되어 있으며, 둘 다 최근 새로운 미생물 스크리닝 및 선택 응용 프로그램^17,18,19를가능하게 했다. 이 방법은 모델 그람 음성유기체(대장균, 아그로박테리움 tumefaciens)및 모델 그람 양성유기체(바실러스 서브틸리스)로여기에서 입증되며, 다양한 다른 박테리아로 쉽게 확장되었다.

Protocol

1. 세균균 및 배양 프로토콜

1. 적절한 성장 매체로 보충 된 천 접시에 박테리아의 줄무늬 식민지. 본 보고서에서 B. 서브틸리스(균주 1A1135, 바실러스 유전주식센터)는 ATGN(0.079M KH₂PO_4,0.015M(NH4)₂SO_4,0.6mM MgSO 4 ·7H 2 O, 0.06mMM CaCl₂·2H_{2H 2O,}0.06mM CaCl 2 ·0.001m7 MSO 4M7에 배양된다. H₂O, 0.125 M FeSO_4· 7H₂O, 28 mM 포도당, pH: 7 ± 0.2, 15 g/L agar) 한천 플레이트100 μg/mL 스펙티노마이신 과 대장균(균주 25922, ATCC)으로 보충된 100μg/mL 암페어인.
   참고: 수압 캡슐화 및 Fattahi^{외. 19에서} 이러한 물질로 방출에 대한 사전 보고 대신 A. tumefaciens C58 세포를 사용
2. ATGN 한천 접시에서 원하는 식민지를 선택하고 하룻밤 문화를 시작합니다. 여기서 사용되는 대장균 및 B. 서브틸리스 균주의 경우, ATGN 액체 배지에서 215 rpm에서 24시간 동안 37°C의 배양. 세포 배양을 향후 사용전까지 -80°C에서 -80°C에 저장합니다.
3. 멸균 접종 루프를 사용하여 글리세롤 주식에서 두 균주의 콜로니를 선택하고 ATGN 액체 미디어에서 37 °C 및 215 rpm에서 24 시간 동안 배양하십시오.

2. 하이드로겔 형성에 필요한 재료의 준비

1. 광분해성 PEG-o-NB-디아크릴레이트 합성
   참고 :PEG-o-NB-diacrylate의 사내 합성은 잘 설명되어 있으며 이전에 보고된^16,17. 또는, 합성이 일상이기 때문에 화학 합성 시설에서 아웃소싱될 수 있다.
2. 교차 연결 버퍼
   1. 세균균균에 대해 선택한 배지의 레시피를 가지고 2배 영양소로 미디어를 준비하십시오. 인산염을 첨가, 예를 들어, NaH₂PO_4, 100 mMMM의 최종 농도에 매체에. 그런 다음 pH 값을 5M NaOH(aq)를 사용하여 8로 조정합니다.
   2. 버퍼 용액을 살균하고 추가 사용이 될 때까지 -20 °C에 보관하십시오.
      참고: 이러한 금속이 티올의 산화를 이황화로 촉매하기 때문에 미디어에 존재하는 모든 전이 금속을 빼내십시오.
3. PEG-o-NB-디아크릴레이트 솔루션
   1. 알리쿼트 PEG-o-NB-디아아크릴레이트(3,400Da 분자량) 분말의 각 mg에 대해, 페그-O-NB-디아크릴레이트(98mM 아크릴농도)의 49mM 농도에 도달하기 위해 초순수수 3.08 μL을 첨가한다.
   2. 용액이 잘 섞일 때까지 용액을 소용돌이시키고 추가 사용까지 이 용액을 -20°C에 저장합니다.
4. 4-암 PEG-티올 솔루션
   1. 4-arm PEG-thiol (10,000 다 분자량) 제제의 경우, mg 분말 당 4 μL의 초순수수를 추가하여 20mM 농도(80mM의 티올 농도)에 도달합니다.
   2. 이 용액이 잘 혼합될 때까지 이 용액을 더 이상 사용할 때까지 -20°C에 저장합니다.

3. 퍼플루오로알키(비반응성) 커버립 준비

1. 폴리 프로필렌 슬라이드 메일러 내부에 최대 5 개의 유리 슬라이드 (25mm x 75mm x 1mm)를 배치하십시오. 20분 동안 2%(w/v) 세제 용액(재료표)으로슬라이드를 초음파 처리합니다.
2. 초순수물로 슬라이드를 세 번 헹구고 20분 동안 슬라이드를 물에 적시합니다. N_2의스트림을 사용하여 슬라이드를 건조.
3. 플라즈마 클린 (재료의 표참조) 2 분 섹션 4.1의 프로토콜에 따라 유리 슬라이드의 양쪽에.
4. 플라즈마 청소 슬라이드를 슬라이드 메일러에 다시 넣고 톨루엔에 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H, 2H,perfluorooctyl) 실레인의 0.5%(v/v) 용액으로 용기를 채웁니다. 이러한 유리 슬라이드를 실온(RT)에서 3시간 동안 작동하도록 허용합니다.
5. 슬라이드가 기능화된 후 슬라이드 메일러 내에서 슬라이드를 헹구고 먼저 톨루엔과 다음 에탄올(각 용매로 세 번)을 사용합니다. 다음으로, N_2의스트림으로 각 기능슬라이드를 건조시한다.

4. 티올 기능성(베이스) 커버립 준비

1. 플라즈마 클리너를 사용하여 유리 커버립의 청소
   1. 페트리 접시에 18mm x 18mm 커버립을 놓습니다. 그런 다음 페트리 접시를 플라즈마 클리너 챔버에 넣고 플라즈마 클리너의 힘을 켭분입니다.
   2. 압력 게이지가 400 mTorr를 읽을 때까지 진공 펌프를 켜서 챔버 내의 공기를 치웁니다.
   3. 압력 게이지가 일정한 압력(800-1000 mTorr)에 도달할 때까지 계량 밸브를 열어 챔버안으로 공기를 넣습니다. 그런 다음 "Hi" 모드로 RF를 선택하고 커버립을 3분 동안 노출합니다.
   4. 3분 후 RF 모드와 진공 펌프를 끕니다.
   5. 페트리 접시를 챔버밖으로 꺼내 커버립을 뒤집어 챔버에 다시 놓아 플라즈마를 유리 커버슬립의 반대편을 노출시키십시오.
   6. 반복 단계 4.1.2-4.1.4 플라즈마 유리 커버 슬립의 처리되지 않은 측면을 청소합니다.
   7. 공정을 완료한 후 챔버에서 페트리 접시를 제거하고 플라즈마 클리너와 진공 펌프를 끕니다.
2. 피라냐 용액으로 커버립의 세척 및 하이드록실화
   참고: 표준 피라냐 세척 프로토콜을 사용하여 유리 전표를 청소하고 하이드록시레이트할 수 있습니다. 피라냐 용액은 H₂O₂ 및 H₂SO_4의30:70 (v/v) 혼합물이다. 유리 커버를 청소하는 다른 방법도 사용될 수있다.
   주의: 피라냐 용액은 유기 용매로 부식성 및 폭발성이며 극도의 주의를 기울여 처리해야 합니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 코트, 내화학 성 앞치마, 안전 안경, 얼굴 방패, 산내성 부틸 장갑)의 사용과 같은 적절한 안전 및 봉쇄 조치를 구현해야 합니다. 피라냐 용액과 접촉하는 모든 유리 제품 및 작동 표면은 사용하기 전에 깨끗하고 건조하며 유기 잔류물이 없어야합니다. 피라냐 용액은 부분적으로 폐쇄되거나 닫힌 용기에 보관해서는 안 됩니다.
   1. 깨끗한 100mm x 50mm 유리 접시를 핫플레이트 마그네틱 교반기에 넣고 연기 후드 아래에 조정 가능한 교반 속도를 내고 14mL의 H₂SO_4를 접시에 넣습니다.
   2. 테플론 코팅 된 집게를 사용하여 작은 테플론 코팅 마그네틱 스터드 바를 접시 안에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 교반기를 천천히 돌려 산의 튀는 것을 피하십시오.
   3. 다음으로, H₂O_2의 6mL을 접시에 부드럽게 넣고 용액이 잘 섞일 수 있도록 합니다.
   4. 교반기끄기다음 집게를 사용하여 접시에서 교반 바를 제거합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 접시 내부에 커버립을 부드럽게 놓고 온도를 60-80 °C로 설정합니다.
   5. 30분 후, 포셉을 사용하여 커버립을 부드럽게 제거하고 탈이온화된 물(DI)에 두 번 담그고 잔류 피라냐 용액을 씻어냅니다.
   6. 물로 헹구고, 커버립을 RT의 DI 물에 보관하여 추가 사용이 이리저리 사용할 때까지 보관하십시오.
   7. 핫플레이트를 끄고 피라냐 용액이 식도록 합니다.
   8. 피라냐 용액을 폐기하려면 냉각된 피라냐 용액을 함유한 100mm x 50mm 유리 접시를 볼륨이 1.5L 이상인 더 크고 빈 유리 비커에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 1L의 물을 추가하여 희석하고 중탄산나트륨 분말을 첨가하여 중화합니다. 중탄산나트륨은 버블링과 열발생을 유발하며 매우 느리게 첨가해야 하며, 그렇지 않으면 버블링이 산의 튀는 것으로 이어질 수 있습니다. 중탄산나트륨을 추가하면 버블링을 일으키지 않으면 pH 종이로 pH를 확인하여 중화되었는지 확인하십시오. 용액이 중화되고 냉각되면 싱크대 아래로 부을 수 있습니다.
3. 커버립의 틸 기능화
   1. 건조 톨루엔에서 269mM의 5%(v/v) 용액(3-mercaptopropyl) 트리메톡시실란(MPTS) 용액을 준비한다.
   2. 개별 50mL 원심분리기 튜브에 10mL의 솔루션을 추가하고 각 튜브에 청소된 커버슬립 1개를 배치하고 용액 내에 침수합니다.
      참고: 50mL 튜브 당 하나의 커버 슬립은 다른 기판에 의해 방해받지 않고 기판의 양쪽의 티올레이션을 보장하는 데 사용됩니다.
   3. 4 시간 후, 톨루엔, 1:1 (v/v) 에탄올로 각 커버슬립(커버슬립당 4개의 워시)을 세척합니다: 톨루엔 혼합물, 그리고 에탄올.
      참고: 각 커버슬립을 언급된 솔루션을 포함하는 원심분리기 튜브에 순차적으로 침지함으로써 수행됩니다.
   4. 기판을 헹구고, 에탄올에 담그고 추가 사용이 될 때까지 4°C에 보관하십시오.
      참고: 커버립 수에 따라 이 방법은 한 번에 하나씩 커버립을 치료하기 때문에 힘들 수 있습니다. 여러 커버립의 경우 여러 커버립에 동시에 맞는 컬럼비아 항아리를 사용할 수 있습니다.

5. 실리콘 마이크로웰 어레이의 제조

1. Parylene 코팅: 이전 연구 기사^20,21에 설명된 표준 프로토콜을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 패릴렌으로 코팅합니다.
2. 미세 제조: Barua^{외. 18에} 의해 기술된 프로토콜을 따라 마이크로웰 어레이(보충도 1)를설계하고 제작한다.
   참고: Timm^{외. 17에} 의해 기술된 표준 photolithographic 기술은 parylene 코팅 실리콘 웨이퍼에 마이크로웰 어레이를 제조하기 위해 적용되었습니다.

6. 하이드로겔 형성

1. 유리 커버립의 벌크 하이드로겔 형성
   1. 하이드로겔 전구체 용액: 0.5mL 마이크로센트심분리기 튜브에 교차 연결 버퍼의 12.5 μL을추가하고 PEG-o-NB-diacrylate 용액의 5.6 μL을 추가합니다. 마지막으로, 혼합물에 4암 PEG-thiol 용액의 6.9 μL을 추가합니다.
      참고: 혼합물에 4arm PEG 티올을 추가하면 교차 연결 반응이 시작됩니다. 따라서, 하이드로겔 전구체 용액은 혼합 직후에 사용되어야 한다.
   2. 하이드로겔 전구체 용액의 세포 캡슐화의 경우 6.1.3-6.1.9 단계를 수행하십시오.
   3. 세포 캡슐화의 경우, 6.1.1 단계 전에, 원하는 세포 밀도와 교차 연결 버퍼를 접종. 이전에 보고된 바와^같이,교차 연결 완충제에서 7.26 × 10⁷ CFU/mL의 세포 밀도가 하이드로겔을 가로질러 캡슐화된 ~ 90세포/mm^2의 밀도와 상관관계가 있는 것으로 관찰되었다.
   4. 깨끗한 페트리 접시에 티오드 베이스 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립의두 개의 반대쪽에 두 개의 스페이서(재료 표 참조)를 배치합니다.
      참고: 커버슬립 표면에 하이드로겔의 공유 부착에 커버립의 틸올 기능화가 필요하다. 이는 하이드로겔 전구체 용액에 존재하는 표면 및 아크릴계 군의 반응을 통해 수행됩니다.
   5. 스페이서를 페트리 접시에 테이핑하여 베이스 커버슬립의 스페이서를 수정합니다.
   6. 불반응성, 퍼플루오로알키화 유리 슬라이드에서 전구체 용액의 원하는 부피를 피펫.
   7. 기본 커버슬립(도1C)에퍼플루오로알키드 유리 슬라이드를 놓습니다. 하이드로겔 형성이 완료될 때까지 RT에서 25분 동안 기다립니다.
   8. 겔화 후, 퍼플루오로알키드 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다. 하이드로겔은 베이스 커버슬립에 부착되어 있습니다.
      참고: 18mm x 8mm 커버립의 경우 12.7 μm 두께의 멤브레인을 얻으려면 전구체 용액의 ~7 μL(그림1A,B)을사용하십시오. 더 많은 양의 전구체 용액을 사용하면 베이스 커버슬립 아래에 하이드로겔이 발생할 수 있습니다. 이로 인해 기본 커버슬립이 페트리 접시에 달라붙어 제거 를 시도할 때 파손될 수 있습니다. 또한, 커버슬립 아래에 하이드로겔 잔류물은 현미경 검사법에 문제가 있다. 반응하지 않는 역류 유리 슬라이드의 부드러운 제거는 하이드로겔을 손상시킬 수 있기 때문에 필요합니다.
   9. 기판을 60mm x 15mm 페트리 접시에 지정된 문화 매체에 놓습니다. 여기서, ATGN 배지는 B. 서브틸리스용 100 μg/mL 스펙티노마이신 또는 37°C에서 E.coli용 100 μg/mL 암피실린으로 보충하여 24시간 배양시간에 사용되었다.

도 1: 하이드로겔 형성은 티오레이드 유리 커버립에 형성된다. (A)두께가 12.7 μm인 스페이서는 반응성 티올 군을 포함하는 베이스 커버슬립의 두 개의 반대쪽에 배치된다. (B)하이드로겔 전구체 용액은 반응성이 없는 불소 유리 슬라이드를 통해 피펫화된다. (C)비반응성 유리 슬라이드는 12.7 μm 두께의 하이드로겔의 형성을 위해 스페이서에 배치된다. (D)반응성이 없는 유리 슬라이드가 부드럽게 제거되어 하이드로겔을 베이스 커버슬립에 부착합니다. (E)준비된 하이드로겔은 문화용 배지에서 배양될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 마이크로웰 어레이를 통해 하이드로겔 형성

1. 마이크로웰 어레이의 박테리아 시드
   참고: 0.1 OD₆₀₀ 셀 서스펜션의 700 μL은 마이크로웰 어레이 기판 위에 시드되었고, 패리렌 리프트 오프 방법은 Timm et al에 의해 기술된 프로토콜을 사용하여 백그라운드에서 세포를 제거하기 위해적용되었다. ²².
2. 페그-O-NB-디아릴레이트의 5.6 μL을 pH 8 인산염 완충식식염ATGN의 12.5μL로 추가하고 4암 PEG 티올 용액의 6.9 μL과 혼합하여 하이드로겔 전구체 용액을 준비한다.
3. 전구체 용액의 파이펫 12.5 μL은 반응성이 없는, 불플루오알키드 유리 슬라이드에 있으며, 세포로 접종된 마이크로웰 어레이 기판의두 개의 반대쪽에 2개의 38 μm 강철 스페이서(재료표 참조)를 배치한다.
4. 전구체 용액 액으로 역류 유리 슬라이드를 반전시키고 마이크로웰 기판 의 중간에 액적을 놓습니다. 그런 다음 하이드로겔 형성을 위해 RT에서 25분 동안 배양합니다.
5. 마이크로웰 기판에서 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다. 하이드로겔 멤브레인은 마이크로웰 기판에 부착된 상태로 유지되어야 합니다. 6.1.9 단계로 진행합니다.

8. 세포 추출을 위한 재료 준비

1. PDMS 홀더 준비
   1. 10 개의 18 x 18mm 커버를 테이프로 붙이고 페트리 접시 바닥에 이 커버립 스택을 붙입니다.
   2. PDMS 홀더를 제조하려면 PDMS 전구체 및 경화제를 플라스틱 컵에 10:1 부피 비율로 혼합하고 진공 건조기에서 혼합물을 분해한 다음 혼합물을 페트리 접시에 붓습니다.
   3. 80 °C에서 90 분 동안 PDMS를 치료하십시오. 그런 다음 테이프로 된 블록 주위를 잘라 PDMS 홀더를 제거하고 PDMS 홀더를 유리 슬라이드에 배치하여 현미경 검사법을 쉽게 처리합니다.
2. 미세 사기 및 튜브 준비
   1. PTFE 튜브 20cm(I.D.0.05)를 자르고 튜브의 한쪽 끝을 100 μL 마이크로리터 주사기에 부착합니다.
      참고: 추출의 경우 파이펫 팁을 통해 방출된 셀을 그리는 파이펫을 사용하면 하이드로겔 표면이 손상되고 오염으로 이어질 수 있습니다.

9. 패턴 조명 도구로 하이드로겔 분해

참고: 이 섹션에서 설명한 다음 단계는 9.6.4-9.6 및 9.6.7-9.6.10 단계에 기재된 광 노출 패턴을 제외하고 벌크 하이드로겔 및 마이크로웰 어레이 모두에 대해 동일합니다.

1. 현미경을 켭니다(재료 표참조). 그런 다음 패턴 조명 도구를 켭니다(재료 표참조).
2. 365 nm LED 광원 아날로그 및 디지털 제어 모듈을 켭니다. 다음으로 LED 광원 제어 모듈을 켭니다.
3. 현미경 소프트웨어와 패턴 조명 도구에 대한 소프트웨어를 엽니 다. 하드웨어 구성 창이 열리면 로드 단추를 선택합니다.
   참고: 여기에 세 개의 장치가 로드됩니다. (타사 카메라, 제어 모듈 및 패턴 조명 도구)
4. 시작 버튼을 누릅니다. 라이트 패닝 소프트웨어 창이 열립니다. 창의 왼쪽 사이드바에서 첫 번째 옵션인 장치 제어 버튼을 선택합니다.
5. 패턴 조명 도구를 보정합니다.
   참고: 교정은 빛 노출에 사용되는 동일한 현미경 목표와 필터로 수행해야 합니다.
   1. 현미경 목표를 10배배율로 설정합니다.
      참고: 이 배율은 현미경 렌즈와 샘플 표면 사이의 충분한 작업 거리를 허용합니다. 또한 이미지 창을 통해 검색 프로세스를 실시간으로 모니터링하고 기록할 수 있습니다.
   2. 현미경 렌즈와 필터를 광 노출에 사용되는 설정으로 설정하고 교정 거울을 현미경 아래에 놓습니다.
   3. 장치 제어 창에서 LED 제어 탭을 누릅니다. LED #1을 켜고 라이트 강도를 원하는 숫자로 설정합니다. 표준 추출 실험에서는 60%로 설정됩니다.
   4. 장치 제어 창에서 패턴 조명 도구 제품 이름으로 제목을 탭을 누릅니다. 그런 다음 그리드 표시 버튼을 누릅니다.
      참고: 보정 미러에 그리드 패턴이 투영됩니다.
   5. 현미경 초점과 카메라 노출을 조정하여 그리드의 높은 화질을 얻고 카메라를 회전하여 필요한 경우 카메라 창 프레임에 평행하게 그리드 라인을 정렬합니다.
   6. 패턴 조명 도구 제품 이름으로 제목의 탭 아래에 있는 교정 마법사 단추를 선택하고 이 창에서 소프트웨어에서 제공하는 지침을 따릅니다.
      참고: 타사 카메라 설정 창이 열립니다.
   7. 교정 유형 선택 창이 열립니다. 자동 교정을 선택하고 다음을누릅니다.
   8. 사전 보정 조정 창이 열리면 소프트웨어 지침을 따르고 다음 단추를 누릅니다.
   9. 매핑 정보 창이 열리면 원하는 폴더에 따라 이 보정을 저장합니다. 이것은 날짜, 현미경 이름, 객관적인 렌즈 및 필터에 넣어 이루어집니다.
   10. 보정 후 패턴 조명 도구 제품 이름으로 명명된 탭 아래에 있는 작업 영역 정의 버튼을 눌러 필요한 경우 패턴 조명 도구의 작업 영역을 정의합니다.
6. 패턴 준비를 위한 시퀀스 설계 섹션입니다.
   1. 소프트웨어 창의 왼쪽 에서 시퀀스 디자인 버튼을 누릅니다. 그런 다음 프로필 시퀀스 편집기 단추를 누릅니다.
   2. 프로필 시퀀스 편집기 창이 열리면 프로필 목록에서 새 프로필 옵션을 선택합니다.
      참고: 이제 패턴 편집기 창이 열립니다.
   3. 다양한 패턴 모양과 크기를 선택하여 빛 노출을 위해 원하는 패턴을 준비하거나 원하는 경우 수동으로 패턴을 그립니다.
   4. 벌크 하이드로겔의 원 및 깨진 교차 패턴의 경우 9.6.5- 9.6.6 단계를 따르십시오.
   5. 원 패턴의 경우, 전체 식민지를 커버하기 위해 대상 박테리아 식민지 위에 30 μm 직경의 원을 정의합니다. 셰이프 채우기 색상을 흰색으로 선택합니다.
   6. 깨진 크로스 패턴의 경우 3 μm x 8 μm 치수패턴 드로잉 창에서 사각형 모양을 선택합니다. 대상 콜로니의 가장자리에 이 치수로 네 개의 사각형을 배치하고 패턴의 절반은 콜로니와 오버레이를 갖습니다.
   7. 마이크로웰 어레이의 원 및 링 패턴의 경우 단계를 따르십시오 9.6.8-9.6.10.
   8. 원 패턴의 경우 웰 둘레 에 10 μm 직경 원을 그립니다. 셰이프 채우기 색상을 흰색으로 선택합니다.
   9. 링 패턴의 경우 직경 20 μm의 원을 그리고 우물 위에 놓고 모양을 선택하여 흰색을 채웁니다.
   10. 직경 10 μm의 또 다른 원 패턴을 채우기 모양의 검은색으로 그려 웰 의 둘레에 놓습니다.
7. 패턴을 편집하고 원하는 추출 방법에 따라 셰이프를 수정합니다. 패턴 조명 도구의 작업 영역 내에 원하는 패턴이 있는지 확인합니다.
8. 샘플을 PDMS 홀더에 놓고 정의된 미디어를 샘플 위에 배치하여 시료 탈수를 방지하고 방출된 셀에 대한 반송파 솔루션을 제공합니다.
9. 그런 다음 교정 미러로 바꿉시다.
10. 하이드로겔 내의 식민지의 선명한 이미지를 얻으려면 현미경 초점을 조정합니다. 식민지를 검사하여 관심 있는 식민지를 식별합니다.
11. 여기서, 카메라 뷰가 샘플 내부의 콜로니를 보여주면서 조명 패턴을 설계하여 셀 추출을 위한 다양한 패턴을 테스트합니다.
12. 정의된 패턴을 저장합니다. 정의된 패턴을 저장한 후 세션 제어 섹션을 선택합니다.
13. 이 섹션에서패턴 조명 도구 제품 이름이 적힌 제목의 탭 아래에 저장된 시퀀스를 추가합니다.
14. 시퀀스를 추가한 후 원하는 노출 위치에 대해 보고 조정하는 패턴을 시뮬레이션하는 옵션을 선택합니다.
    참고: 샘플 위치는 패턴이 대상 영역에 정확하게 투영되도록 여기에서 조정할 수 있습니다.
15. 다음으로, 광 강도를 60%로 조정하고 노출 시간을 LED 제어 탭 아래40초로 조정하고 노출 공정을 시작합니다.
16. 하이드로겔 분해를 실시간으로 모니터링하고 밝은 필드 모드를 사용하여 셀 방출을 보장합니다.
    참고: 하이드로겔의 원치 않는 영역이 저하되어 교차 오염이 발생할 수 있으므로 광 노출 시 시료의 움직임을 방지합니다.

10. 셀 검색

참고: 세포 검색 절차는 벌크 하이드로겔및 마이크로웰 어레이 모두에 대해 동일합니다.

1. 365nm 광 노출 및 세포 방출 후, 마이크로리터 주사기 및 미세 유체튜브(그림 2)를사용하여 세포를 수집한다.
   참고: 세포 검색은 패턴 노출 직후에 수행해야 합니다. 이렇게 하면 방출된 세포가 조사된 영역에서 멀어지기 전에 국소화된 세포 복구를 가능하게 합니다.
2. 현미경을 밝은 필드에서 FITC 또는 TRITC 필터로 변경하여 육안으로 샘플의 노출 영역을 시각화할 수 있도록 합니다.
3. 노출된 지역이 있으면 튜브 끝을 조사 지점에 놓습니다. 그런 다음 현미경 필터를 다시 브라이트필드로 변경하여 실시간으로 세포 검색을 모니터링합니다.
4. 튜브의 다른 쪽 끝에 부착 된 주사기를 사용하여 방출 된 세포를 조심스럽게 철회하십시오. 용액의 200 μL을 철회하고 DNA 분석 또는 도금을 위해 1.5mL 원심분리기 튜브에 용액을 삽입합니다.

도 2: 하이드로겔로부터 방출되는 세포를 수집하는 추출 방법의 회로도 표현. 여기서, 365nm UV 노출, 하이드로겔 분해 및 세포 방출 직후, 현미경은 TRITC 필터로부터 빛으로 하이드로겔 샘플을 조명하는 데 사용되어 세포 방출이 발생한 영역을 덮고 있는 밝은 녹색 반점이 발생한다. 이렇게 하면 사용자가 샘플 수집을 위한 공간 위치를 식별하는 데 도움을 주게 됩니다. 이 영역을 시각화한 후 마이크로리터 주사기에 부착된 수집 튜브를 이 지점에 배치하고 샘플을 수집합니다. 10배율에서의 브라이트필드 현미경 검사는 정확한 세포 수집을 위해 튜브 및 하이드로겔 표면의 끝을 실시간으로 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

11. 게놈 DNA 정제 및 DNA 품질 측정

1. DNA 정제 키트(재료 표 참조)를사용하여 박테리아 분리에서 DNA를 추출합니다.
   1. 완충 AE로 용출을 요구하는 마지막 단계(7단계)까지 DNA 정화 키트^{핸드북(23)에} 기재된 제조업체의 사양을 따릅니다.
   2. 용출 단계의 경우 제조업체의 사양을 따르면 200 μL 대신 버퍼 AE 100 μL을 사용하는 차이가 있습니다.
   3. 11.1.2 단계에서 설명한 대로 한 번 용출을 반복합니다. 이 단계는 증가 된 전반적인 DNA 수율로 이어집니다.
2. UV-Vis 분광광계를 사용하여 DNA 품질을 측정합니다(재료 표참조).
   1. 분광계를 켭니다. 장치 초기화 후 홈 페이지에서 화면에서 dsDNA 옵션을 선택합니다.
   2. 다음으로, 받침대 팔을 들어 올리고 DI 물과 보풀이 없는 물티슈로 받침대 위치를 청소합니다.
   3. 빈 용액의 파이펫 2 μL, 여기에 AE 버퍼, 받침대 위치에 부드럽게 받침대 팔을 아래로 가지고 화면에 빈을 선택합니다.
   4. 다음으로, 받침대를 들어 올리고 DI 물로 받침대 위치를 청소하여 이전 측정에서 잔류 재료를 제거합니다.
   5. 받침대 위치에 샘플(2 μL)을 적재하고 받침대 팔을 아래로 가져오고 화면의 측정 버튼을 선택합니다.
   6. 모든 샘플에 대해 11.2.4 및 11.2.5 단계를 다시 수행합니다.
   7. 측정이 완료되면 화면에서 "실험 종료"를 선택합니다. 플래시 드라이브를 장치에 삽입하고 화면에 "데이터 내보내기"를 누릅니다.

12. 하이드로겔 및 마이크로웰 추출물에서 세포 생존 가능성 결정

1. 96웰 플레이트를 사용하여 10^5의 희석 계수로 세균 현탁액을 희석시 희석시.
2. 파이펫 10 μL 희석 세균 현탁액및 각 박테리아 현탁액에 대한 ATGN 플레이트에 세 번 반점.
3. 접시를 기울여 서고 표면에 셀을 퍼뜨리습니다. 세균 현탁액을 포함하는 ATGN 플레이트를 공기 건조시.
4. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 배양한다. 콜로니 형성 단위(CfU) 숫자를 계산하고 기록합니다. 각 플레이트에 세균 현탁액의 세 가지 스프레드를 모두 계산합니다.
   참고: 플레이트의 오염을 방지하기 위해 생물학적 안전 캐비닛에서 12.1-12.4 단계를 수행합니다.

Results

세포 방출을 위한 통제된 하이드로겔 분해를 유발하는 UV 빛의 능력을 조사하기 위하여는, 하이드로겔은 박테리아가 존재하지 않는 thiolated 커버립위에 먼저 캡슐화되었습니다. 각 하이드로겔은 서로 다른 강도와 노출 시간에 빛의 세 복제 원 패턴에 노출되었다. 백분율 겔 분해는 각 광 강도에서 UV 광 노출 후 계산되었고, 노출 시간은 형광 이미징^19,24에대한 형광-5-maelimide 염료와 펜던트 티올 그룹을 결합하여 정량화되었다. 이 두 매개 변수가 하이드로겔 저하에 미치는 영향을 보여주는 대표적인 예가 도 3에표시됩니다. 패턴 조명 도구에서 제공하는 패턴 조명은 소수의 셀만 방출할 수 있는 해상도로 하이드로겔 분해의 공간-시간적 제어를 제공합니다.

그림 3: 하이드로겔 분해제어. UV 광 용량 및 그로 인한 하이드로겔 분해 속도는 패턴 조명 도구를 통해 튜닝할 수 있습니다. (개시) 패턴 하이드로겔 분해를 위해 두 가지 다른 광 강도가 선택되었습니다. 365nm UV 광 노출 후, 하이드로겔은 형광 이미징을 위해 형광-5-말리미드로 표지되었습니다. 파타히 외¹⁹ 저작권 2020 미국 화학 협회의 허가하에 전재 (적응) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포 추출을 위해, 상이한 광 패턴은 세포 방출을 조사하기 위해사용되었다(도 4). 여기서, Agrobacterium 박테리아 세포는 티오레이트 유리 커버립을 통해 대량 하이드로겔로 캡슐화된 다음 마이크로 스케일 콜로니로 배양되었습니다. 하이드로겔은 밝은 시야 현미경 검사에서 검사되었고, 표적 마이크로콜로니는 다양한 자외선 패턴에 노출되었다. 상이한 노출 패턴이 방출된 세포의 형태에 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 이는 다양한 응용 분야에 잠재적으로 유용합니다. 예를 들어, 표적 식민지 주변에 링 패턴을 노출하면 전체 콜로니가 여전히 보호 PEG 하이드로겔에 캡슐화되어 있으며 직접 UV 광노출(도 4A)이없으면 세포를 보존하고 쉽게 다운스트림 정화를 제공할 수 있습니다. 대조적으로, 식민지의 일부 또는 전부를 UV 광에 노출시킴으로써, 세포는 집계된 세포클러스터(도 4B)또는 자유, 개별 세포(도4C)로추출될 수 있다.

도 4: 추출된 세포의 형태에 대한 제어. (A)전체 세포 식민지를 방출하기 위해 링 패턴을 사용하여 PEG 매트릭스에서 보호된다. (B)골재로 세포 방출을 위한 깨진 크로스 패턴의 사용. (C)개별 세포를 방출하기 위해 교차 패턴을 사용합니다. [19] [1] [1]^[1] 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

캡슐화 프로토콜에서 중요한 것은 셀 파종 밀도와 하이드로겔의 두께모두이며, 이러한 파라미터 는 관찰을 위해 하이드로겔에 통합된 세포의 수에 영향을 미칠 수 있다. 이를 입증하기 위해, A. tumefaciens 세포 샘플은 얇은 스페이서(12.7 μm) 또는 두꺼운 스페이서(40 μm)를 사용하여 두 개의 서로 다른 두께의 하이드로겔로 캡슐화되었고, 확립된 프로토콜에 따라 이미지화되었다. 얇은 하이드로겔은 하이드로겔 전체에 걸쳐 90개의 콜로니/mm^2의 마이크로콜로니 밀도를 초래하여 최소한의 식민지 중복이 관찰되었다(그림5A). 대조적으로, 하이드로겔 두께가 12.7 μm보다 커서 수직방향(도 5B)에서겹치는 콜로니의 형성이 발생하여 여러 식민지의 추출이 발생할 수 있다. 중첩된 콜로니는 빛 패턴의 2차원 특성으로 인해 추출 하는 동안 교차 오염을 일으킬 수 있습니다. 예를 들어, 상부 식민지는 표적으로 삼을 수 있으며, 기본 식민지도 그것으로 추출된다(도5C). 따라서 하이드로겔 제제에는 12.7 μm 스페이서를 사용하는 것이 좋습니다.

그림 5: 하이드로겔 두께는 추출 순도에 영향을 미칩니다. (A)하이드로겔 형성을 위해 두께가 12.7 μm인 스페이서를 활용하여 콜로니가 10배 초점 평면 내에 형성된다. (B)12.7 μm보다 두께가 큰 스페이서가 사용되는 경우 콜로니의 오버레이는 10배배율로 관찰될 수 있다. (C)교차 오염은 세포 방출 시 콜로니의 오버레이로 발생할 수 있다: (i) 고리 패턴은 표적 세포 식민지를 방출하는 데 사용되며, (ii) 표적 세포 식민지는 하이드로겔로부터 분리되고, (iii) 두 번째, 기본 식민지는 표적 식민지 아래의 빛 노출 중에 관찰된다. 이 식민지는 또한 제거되어 교차 오염이 발생합니다. 파타히 외¹⁹ 저작권 2020 미국 화학 협회의 허가하에 전재 (적응) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

UV 광이 있는 박테리아에 대한 잠재적 손상을 감안할 때, 세포 생존가능성에 대한 다양한 자외선 마이크로패턴의 효과는 모델, 그람 양성균(B. subtilis)및 모델, 그람 음성 박테리아(대장균)를 사용하여 더욱 연구되었다. 각각은 대량 하이드로겔 내에서 캡슐화되었고 표준 프로토콜에 따라 마이크로 스케일 콜로니로 배양되어 하이드로겔과의 호환성을 확인했습니다. 동등한 크기의 표적 마이크로콜로니(26± μm 직경)는 일정한 광량(168mJ/mm^2)에노출되었고, 전체 마이크로콜로니를 UV 광에 노출시키는 원 패턴의 형태로 또는 하이드로겔 모서리만 저하시키는 교차 패턴으로 세포에 대한 광 노출을 최소화하였다. 세포는 각 식민지에서 회수된 CFU/mL을 정량화하기 위해 회수및 도금되었다. 세포 회수 수준에 큰 차이가 발견되지않았다(도 6A). 추출된 세포의 순도를 더욱 조사하기 위해, DNA는 대장균 샘플에서 추출되고 UV-Vis 분광계를 사용하여 분석하였다. 두 패턴 모두, DNA 품질 수준은 1.8과 2.0(도6B)사이의 A_260/A280 범위 내에 속하며, 이는 유전체 염 시퀀싱^25에이상적인 범위에 있다. 이것은 기술된 조건하에서 방출을 위해 사용된 UV 패턴이 대량 하이드로겔에서 또는 추출 후에 게놈 DNA 질에 회수된 실행 가능한 세포의 양에 최소한의 효력이 있다는 것을 보여줍니다.

그림 6: 대량 하이드로겔에서 방출되는 박테리아의 세포 생존 가능성 및 DNA 품질에 대한 상이한 빛 노출 패턴의 영향. (A)교차 패턴 및 원 패턴을 사용하여 추출 후 대장균과 B. 서브틸리스 모두에 대한 세포 회수 수준. 이 실험을 위해, 각 식민지에서 방출된 세포의 수가 동등하도록 동일한 직경(26 μm ± 1 μm)을 가진 구형 식민지로부터 추출하였다. 그런 다음 추출된 솔루션을 도금하여 각 패턴에서 획득한 CFU/mL을 계산했습니다. 통계 분석은 대장균과 B. 서브틸리스 모두에 대한 교차 및 원 패턴에서 얻은 CFU/mL(P-값 > 0.05, n= 6 모두 균주에 대해 유의한 차이를 보였다). (B)교차 및 원 패턴을 사용하여 격리된 대장균 세포에 대한 DNA 품질의 분광측정량. 여기서, 통계 분석은 사용되는 패턴에 대한 DNA 품질에 유의한 차이를 나타내지 않았다(P-값 > 0.05, n = 6)(C)교차 및 원 패턴에 노출된 동일한 직경의 콜로니의 브라이트필드 영상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

마이크로웰 어레이는 대량 하이드로겔에 비해 더 많은 제어된 스크리닝 기능을 제공하는 대체 랩 온 어칩 스크리닝 인터페이스를 제공합니다. 예를 들어, 마이크로웰 어레이는 비수화의 세포 수를 조절할 수 있는 이산 배양 부위로 박테리아의 파종을 가능하게 한다. 깊이와 직경과 같은 마이크로웰의 기하학적 특징은 표준 미세 제조 방법을 통해 제어됩니다. 이러한 이점으로, 마이크로웰은 공간^{감금(26)하에서}박테리아 성장을 연구하는 데 유용했으며, 가장 최근에는^{마이크로스케일(18)에}함께 국한될 때 다른 세균종 간의 공생 및 적대적 상호 작용의 발견에 유용하게 사용되어 왔다. 16S 앰플리턴 염기서열분석과 같은 유전체 분석을 위한 우물에서 의세포 추출은 이러한 응용 분야에 매우 중요합니다. 동일한 하이드로겔 소재를 사용하여 UV 광은 원 또는 링 패턴으로 관심 있는 셀을 잘 함유하고 있는 셀위에 노출될 수있다. 후자는 세포의 직접적인 조사를 방지하기 위해 마이크로웰 경계에서만 하이드로겔 분해를 보장합니다. 이를 입증하기 위해, mCherry를 발현하는 A. tumefaciens 세포는 우물로 씨를 뿌린 후, 하이드로겔은 마이크로웰 어레이에 부착하였다. 세포는 배양된 다음 원 또는 링 패턴으로 조사되었습니다. 그 때 막은 형광염-5-말리미드 염료로 염색되었다. 2색 형광 이미지는 우물 내의 막과 세포가 모두 조사^{패턴(17)에}대해 제거된다는 것을 밝혔다. 벌크 하이드로겔 포맷과 달리, 여기서 세포 추출은 셀^{클러스터(18)의}형태로만 관찰되었다.

그림 7: 마이크로웰 어레이로부터세포 격리에 대한 가벼운 패턴의 영향을 보여주는 대표적인 공초점 현미경 영상. (A)파종 후 세균(적색)을 함유한 40μm의 직경을 가진 마이크로웰. (B)원과 링 패턴(파란색)을 이용한 광 노출. (C)적색형 감소는 세포가 조사된 우물에서 추출된다는 것을 보여준다. (D)조사 후 멤브레인과 박테리아의 2색 형광 이미지로, 대상 우물에서 하이드로겔(green)과 박테리아(red)를 모두 제거했음을 나타낸다. (E)Z-스택, 대상 우물의 2색 형광 이미지. 빨간색선(D)은(E)로이미지된 xz 평면을 나타내고 녹색 선(E)은(D)에서이미지된 xy 평면을 나타낸다. 이미지(C-E)의샘플은 방출된 셀의 제거를 위해 세척한 다음 고정 및 이미지화하였다. 스케일 바 = 40 μm. 반 데르 Vlies 외^17의허가하에 전재 (적응) . 저작권 2019 미국 화학 소성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이러한 포맷에서 추출 후 박테리아 세포 생존력 및 DNA 품질을 정량화하기 위해 B. 서브틸리스 및 대장균 세포는 원 및 링 패턴을 사용하여 마이크로웰 어레이로부터 종자, 배양 및 방출되었다(도8A,B). 방출된 세포는 ATGN 천 판상에서 도금되었고, 추출된 세포의 DNA 품질은 정량화되었다. 각 추출 중에 일관된 수의 세포가 존재하도록 하기 위해 유사한 형광 성 강도(~6000 A.U.)를 가진 마이크로웰은 이와 유사한 수의 세포가 방출을 목표로 삼았습니다. 원 패턴을 사용하여 추출된 실행 가능한 세포의 수는 어느박테리아(도 8C)에대한 링 패턴을 사용하여 추출된 실행 가능한 세포의 수와 크게 다르지 않았다. 또한, DNA 품질 수준은 어느박테리아(도 8D)에대해 원과 링 패턴 사이에 크게 다르지 않았다. 따라서, 벌크 하이드로겔의 연구 결과와 유사하게, 여기에 지정된 강도 와 기간에 UV 광을 적용하는 것은 마이크로웰 어레이에서 추출된 세포의 생존가능성 과 DNA 품질에 무시할 수 있는 영향을 미쳤다. 이 사실 인정은 실행 가능한 박테리아 세포가 다운스트림 분석을 위한 최소한의 손상으로 마이크로웰에서 선택적으로 검색될 수 있다는 것을 보여줍니다.

그림 8: 마이크로웰 어레이에서 방출되는 박테리아의 세포 생존력 과 DNA 품질에 대한 다양한 광 노출 패턴의 영향. (A,B) 대장균과 B. 서브틸리스모두의 경우, 10 μm 마이크로웰에서 세포 추출에 원 패턴과 링 패턴이 사용되었습니다. 직경 10μm의 원형 패턴과 10 μm의 내지름과 20 μm의 외경을 가진 링 패턴이 세포 추출을 위한 실험에서 사용되었다. 동일한 직경을 가진 마이크로웰은 각 마이크로웰에서 방출된 세포의 수가 동일하도록 하기 위하여 이용되었습니다. (C)추출된 솔루션은 각 노출 패턴에서 획득한 CFU/mL을 계산하기 위해 도금되었다. 통계 분석은 대장균과 B. 서브틸리스 모두에 대해 원 및 링 패턴으로부터 얻은 CFU/mL에 유의한 차이를 나타내지 않았다(P-값 > 0.05, n = 6 모두 균주에 대해). (D)분광측법은 원및 링 패턴을 사용하여 대장균과 B. 서브틸리스 세포의 DNA 품질을 측정하는 데 사용되었습니다. 여기서, 통계 분석은 사용된 패턴에 대한 DNA 품질에 유의한 차이를 나타내지 않았다(P-값 > 0.05, n =6 모두 균주에 대해). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보조 도1: 마이크로웰 어레이의 설계 및 제작. (A)실리콘 웨이퍼에서 마이크로웰 어레이를 제조하기 위해 표준 미세 제조 기술이 적용되었다. (B)각 기판은 20 μm 깊이와 30 μm 피치와 10μm 직경 우물의 7 x 7 배열로 구성되었다. (C)각 어레이는 225마이크로웰로 구성되었다. 이 그림은 Barua 외^18에서수정되었습니다. 저작권 2021 프론티어 미디어. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 원고는 박테리아 스크리닝 및 격리를 위해 광분해성 하이드로겔의 사용을 보여줍니다. 재료와 접근 방식은 높은 처리량 배양, 성장 미디어 및 성장 조건을 제어하며 간단하고 비용 효율적인 방식으로 깨끗하고 정확한 세포 추출을 가능하게 합니다. 추출은 패턴 조명 도구와 결합된 형광 현미경만 필요하며 여러 세포 표적을 격리하기 위해 순차적으로 수행할 수 있습니다. 각 추출은 수행하는 데 5-10 분이 걸리며 단일 하이드로겔에서 최대 30 개의 표적 식민지가 제거되었습니다. 이 접근법의 주요 장점은 벌크 하이드로겔과 마이크로웰 어레이 모두에서 스크리닝하여 입증된 바와 같이 다양한 분석 형식에 대한 적응성입니다. 두 형식의 분리 과정은 배양 및 현미경 관찰 후 하류 유전자 형에 대한 고유 한 성장 거동을 표시하는 박테리아를 분리하는 데 성공적으로 사용되어 왔으며 세포 유전자형을 표현형에 연결하는 중요한 기능입니다. 현재까지 이러한 인터페이스에서 추출된 박테리아의 게놈 특성화에는 16S 앰플리코 시퀀싱이 포함되어 있으며, 응급 성장^거동을생성하는 환경 미생물군유전체에서 박테리아의 다종 수집을 식별하고, 전체 게놈 시퀀싱을 통해 돌연변이 라이브러리¹⁹내에 존재하는 세포에서 희귀 한 성장 프로파일을 유발하는 유전 적 돌연변이를 성공적으로 식별합니다.

세포 스크리닝 및 격리를 위해 대량 하이드로겔을 사용하는 것은 가장 간단하고 간단한 형식입니다. 대량 광분해성 하이드로겔은 투명 유리 커버립위에 전구체를 혼합한 후 표준 직립 또는 반전형 형광 현미경으로 이미지된 3D 세포 배양 매트릭스에서 세포를 캡슐화한 후 빠르게 형성(25분) 형성된다. 따라서, 이 방법은 미량 제조 자원이나 전문 지식이 없는 일반적인 미생물학 실험실에 번역될 가능성이 있다. 이 형식의 단점은 세포가 3차원 하이드로겔 전체에 걸쳐 무작위로 지향된다는 것입니다. 따라서 세포는 배율 목표와 함께 이미징할 때 초점 평면에서 나타날 수 있으며 세포 식민지가 서로 너무 가깝게 향하거나 식민지의 수직 오버레이가 있는 경우 추출이 어려울 수 있습니다. 설명된 대로 얇은 하이드로겔(<13 μm)을 증착하는 것은 이 단점을 완화하는 데 매우 중요합니다. 깨진 크로스 라이트패턴(도 4B)에노출되는 것이 바람직하며, 이러한 패턴은 UV 광에 노출이 최소화되고 도금을 통해 쉽게 회수할 수 있는 하이드로겔이 없는 세포로 인해 바람직하다.

대조적으로, 마이크로웰 어레이 포맷은 박테리아 세포가 작은 배양 또는 공동 배양 사이트로 봉사하는 이산 마이크로웰로 분할되기 때문에 보다 잘 제어된 인터페이스를^{제공한다(17,18,26)}. 마이크로웰 치수, 피치 및 밀도는 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 정밀하게 제작됩니다. 대량 하이드로겔에 비해, 박테리아는 하이드로겔 전체에 무작위로 분산되지 않고 미리 정의된 위치에만 존재하기 때문에 특이성이 높고 교차 오염 가능성이 낮은 마이크로웰 어레이에서 추출될 수 있습니다. 종자용에서 박테리아 세포의 농도 및 비율은 또한 이전^{보고(26)에서}특징화된 종자 과정을 통해 마이크로웰 접종의 양과 조성을 제어하기 위해 다양할 수 있으며, 이는 사용자가 화면의 실험 설계에 유연성을 부여한다. 마이크로웰 어레이 형식으로 선별의 주요 단점은 미세 제조에 필요한 추가 시간과 전문 지식입니다. 마이크로웰의 제조비용은 자재 비용과 클린룸 비용을 포함하는 어레이당 ~$10의 비용으로 추정되었습니다. 또한, 마이크로웰 어레이는 전통적으로 실리콘으로 만들어지며, 기판이 투명하지 않으므로 이미징 문제를 일으킬 수 있습니다. 더욱이, 실리콘 표면으로부터 산란하는 광의 양이 많으며 마이크로웰 내의 이미징을 제한할 수 있으며 패턴 조명 도구(도8A,B에서볼 수 있음)로부터 UV 광으로 하이드로겔 노출 시 패턴 분해능을 감소시킬 수 있다. 유사한 마이크로웰은 이러한 유형의 제한 사항을 해결하기 위해 투명 석영 기판에서^{제조되었습니다(27).} 그러나,이 제조는 상당히 더 어렵다. 우물의 둘레를 비추는 링 패턴에 노출되면 UV 노출을 최소화하면서 우물에서 자유 세포를 방출하는 것이 바람직하다.

어느 형식에서 발생하는 가장 일반적인 문제는 하이드로겔 부종으로 인해 배양 중에 기본 기판에서 하이드로겔을 분리하는 것입니다. 이것이 대량 하이드로겔에 대한 문제인 경우, 염기 유리 커버슬립의 표면을 가로지르는 화학물질(MTPS) 부착층에서 티올 군의 존재, 밀도 및 균일성을 적절한 표면 특성화 기술(XPS, ATR-FTIR, AFM 등)을 이용하여 검증되어야 한다. 비효율적인 표면 기능화로 인해 표면 티올 그룹의 밀도가 낮기 때문에 기판과 하이드로겔 간의 약한 상호 작용으로 이어질 수 있다. 낮은 수준의 표면 티올화가 발생하면 MTPS 솔루션의 안정성을 확인해야 합니다. MTPS 처리 전에 깨끗한 표면을 보장하기 위하여 유리 슬라이드의 초기 청소에서 주의해야 하고, MTPS 표면 반응 도중 무수성 톨루엔의 사용을 보장하기 위하여 주의해야 합니다 (프로토콜 섹션 4). 마이크로웰 어레이의 경우, 표면은 티오레이트되지 않으며, 하이드로겔은 대신 하이드로겔과 우물의 부분 충전을 통해 부착되며, 이는 하이드로겔을 실리콘^{기판(17)에}고정시한다. 하이드로겔 분리가 이 시스템에서 문제가 되는 경우, 더 많은 마이크로웰 또는 다른 마이크로스케일 특징을 어레이에 새겨 더 강한 부착을 촉진하기 위해 기판에 하이드로겔을 더 고정시킬 수 있다.

어느 형식의 기술의 제한은 박테리아가 있는 하이드로겔의 제한된 안정성이다. A. tumefaciens와같은 일부 박테리아는 실험 시간을 제한하는 5-7 일^17,19의과정을 통해 하이드로겔을 저하시킬 수 있다는 점에 주목되었습니다. 세균성 분해 의 기계장치에 대한 현재의 조사가 진행중입니다. 다른^{시스템에서}언급된 바와 같이, 디아크릴레이트 단량체로부터 존재하는 에스테르 단은 박테리아 매개 가수분해 및/또는 효소 분해의 대상이 된다는 가설이다. 보다 안정적인 하이드로겔 화학을 개발하면 박테리아가 하이드로겔에 남아 있을 수 있는 시간이 연장되고 성장 속도가 느린 미생물로 화면을 확장할 것입니다. 두 번째 제한은 두 가지 형식 모두에서 세포 회수 및 추출이 열린 환경에서 발생하여 외부 오염에 취약할 수 있는 비교적 높은 추출 량(30-100 μL)이 발생한다는 것입니다. 따라서 추출 용액 볼륨을 최소화하면서 대상 식민지로부터 충분한 세포가 존재하도록 주의를 기울여야 합니다. 도금 및 회수 또는 DNA 물질의 추출을 위해 충분한 세포를 얻으려면 벌크 하이드로겔에서 세포가 적어도 10 μm의 식민지 직경에 도달할 만큼 충분히 배양되어야 한다는 것이 관찰되었습니다. 세포 추출에 필요한 부피를 낮추기 위해, 마이크로리터 주사기 및 튜브(도 2)를 사용하는 것이 파이펫팅보다 더 효율적이라는 것을 관찰하였다. 튜브를 통해 분리를 릴리스 지점에서 보다 정확하게 그려서 용액 량이 줄어들고 오염 가능성을 낮출 수 있었습니다.

향후 작업은 이러한 하이드로겔의 기계적 특징이 다양한^{분자량(28)의}적절한 PEG 기반 단조량 전구체 의 선택에 의해 잘 제어되고 기계적 상호 작용이 박테리아^{행동(29)에서}중요한 역할을 하기 때문에 하이드로겔 기계적 특성이 세포 성장에 미치는 영향을 이해하는 것을 포함한다. 하이드로겔 소재를 다양한 시스템 및 장치에 쉽게 통합할 수 있기 때문에, 이 물질을 미세유체 시스템에 통합하는 데에도 중점을 둔다. 이렇게 하면 현재 오픈 컬렉션 형식에 필요한 기존의 30-100 μL 볼륨과 비교하여 펨톨리터에서 피콜리터 볼륨까지 추출 용액이 줄어듭니다. 용액 량이 작으면 잠재적오염을 크게 줄이고 단일 셀 격리 및 특성화로 접근 방식을 이동합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-메르캅토프로필)트리에톡시실란	시그마-알드리치	175617-25G	> 95%
알코녹스 세제 분말	알코녹	1104
황산암모늄	피셔 케미컬	A702-500	인증 ACS 과립
오토클레이브 SK300C	야마토 사이언티픽	18016
바실러스 서브틸리스 1A1135	바실러스 유전자 재고 센터	1A1135
명시야 정립 현미경	Olympus Corporation	BX51
염화칼슘, 무수	Fisher Chemical	C614-500	데시케이터 펠릿, 4-20 메쉬
원심분리기 5702	Eppendorf	5702
구연산 일수화물	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS 시약, > 99.0%
D-포도당( 포도당)	VWR Amresco 생명 과학	0188-1KG
Dneasy 혈액 & 조직 키트	Qiagen	69504	DNA 정제 키트
DOWSIL 184 실리콘 엘라스토머 베이스	Dow Silicones Corporation		저장 온도: -30-60 ° C
DOWSIL 184 실리콘 엘라스토머 경화제	Dow Silicones Corporation		보관 온도: < 32 C
EPOCH2 마이크로플레이트 분광 광도계	BioTek Instruments	EPOCH2
대장균 ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
에탄올, 무수	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand 현미경 커버 유리	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest 프리미엄 현미경 슬라이드 플레인	Fisher Scientific	12-544-4
과산화수소 용액	Sigma-Aldrich	216763-500ML	억제제 함유, H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
황산 마그네슘, 7 수화물	Macron 정밀 화학	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
메탄올	시그마-알드리치	179337-4L	ACS 시약, > 99.8%
NanoDrop One 분광 광도계	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
질소, 압축	Matheson	UN1066
산소 플라즈마 세척기	Harrick Plasma	PDC-001-HP
펜타에리트리톨 테트라(메르캅토에틸) 폴리옥시에틸렌(4 arm-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
인산염 완충 식염수(PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	15 &도 사이에 저장; C– 30 > C
폴리디메틸 실록산(PDMS) Slygard 184	다우코닝	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
프리미엄 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1mm
중탄산나트륨	Sigma-Aldrich	S5761-500G
염화나트륨	시그마 생명과학	S5886-500G	세포 배양에 적합한 생물 시약
수산화나트륨	시그마-알드리치	S8045-500G	BioXtra, > 98%, 펠릿(무수)
인산나트륨 일염기성 이수화물	시그마-알드리치	71505-250G	BioUltra, 분자생물학용, > 99.0% (T)
스테인리스강 두께 게이지	정밀 브랜드 제품	77739
황산	시그마-알드리치	320501-2.5L
톨루엔, 무수, 99.8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	무수, > 99.8%
Trichloro(1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) 실란(TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
트립틱 콩 육수	Sigma-Aldrich	22092-500G	미생물학용
Super Nuova 디지털 핫 플레이트 교반기	Thermo Scientific	S131825
초음파 초음파 발생기	Fischer Scientific	FS-110H