미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다. 따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아는 에너지 공급뿐만 아니라 세포의 전반적인 건강을 결정하는 주요 대사 및 조절 세포기관입니다. 골격 근육에서 미토콘드리아는 작은 타원형 세포기관에서 부터 광범위하고 망상과 같은 네트워크에 이르기까지 일련의 복잡한 형태에 존재합니다. 미토콘드리아 망상이 에너지 수요의 변경과 같은 다양한 자극에 대응하여 어떻게 확장되고 발전하는지 이해하는 것은 오랫동안 연구의 주제였습니다. 이러한 성장 또는 생물 발생의 주요 측면은 원래 핵 게놈에 의해 인코딩되고, 사이토솔에서 합성되고, 다양한 미토콘드리아 하위 구획으로 전이되는 전구체 단백질의 수입이다. 미토콘드리아는 단백질 수입 기계(PIM)로 알려진 많은 선택적 내측 및 외부 멤브레인 채널을 포함하는 이러한 수입 공정을 위한 정교한 메커니즘을 개발했습니다. 미토콘드리온으로 수입하는 것은 산화 인산화를 통해 세포기관에서 파생된 ATP의 가용성과 실행 가능한 멤브레인 잠재력및 가용성에 달려 있습니다. 따라서 그 측정은 세포구 건강의 척도로 작용할 수 있습니다. PIM은 또한 세포의 에너지 상태에 단단히 결합되는 골격 근육에 적응가성의 높은 수준을 전시한다. 예를 들어, 운동 훈련은 수입 용량을 증가시키는 것으로 나타났으며, 근육 사용은 미토콘드리아 함량의 마커의 변화와 일치하여 이를 감소시킵니다. 단백질 수입은 미토콘드리아의 생물 발생 및 확장에 있는 중요한 단계이지만, 프로세스는 골격 근육에서 널리 공부되지 않습니다. 따라서, 이 논문은 운동, 건강 및 질병에 있는 세포기관 회전율에 대한 통로의 중요성을 더 잘 이해하고 관련시키는 방법을 촉진하기 위하여 단백질 수입 용량을 측정하기 위하여 골격 근육에서 고립되고 완전하게 기능하는 미토콘드리아를 사용하는 방법을 설명합니다.
서론
미토콘드리아는 다른 세포 모형에 있는 복잡한 형태학에 존재하는 세포기관이고 세포 건강에 중요한 기능의 증가 배열을 가지고 있는 것을 인식됩니다. 따라서, 그들은 더 이상 단지 에너지 생산 세포기관에 휘청해질 수 없습니다. 미토콘드리아는 주요 신진 대사 조절제, 세포 운명의 결정요인 및 신호 허브이며, 그 기능은 전반적인 세포 건강의 유용한 지표로 작용할 수 있습니다. 골격 근육 세포에서 전자 현미경 연구는 지리적으로 구별되는 subsarcolemmal (SS) 및 intermyofibrillar (IMF) 미토콘드리아의 존재를 밝혀, 이는 연결의 정도를 나타내는 1,2,3,4 이는 지금 매우 역동적이고 변화 골격 근육 활동 수준에 적응할 수 있음을 인식, 뿐만 아니라 나이와 질병. 미토콘드리아 함량과 근육의 기능은 여러 가지 방법으로 평가될 수 있으며, 세포기질의 영향과 구별되는 미토콘드리아의 호흡기 및 효소 용량(Vmax)을 더 잘 이해하기 위해 기존의 세포 ....
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프로토콜
이 실험에 사용된 모든 동물은 요크 대학의 동물 보호 시설에서 유지됩니다. 실험은 요크 대학 동물 관리 위원회의 승인을 받아 캐나다 동물 관리 위원회 지침에 따라 수행됩니다 (허가: 2017-08).
1. 골격 근육에서 서브사콜렘말과 내미오피릴라 미토콘드리아의 기능적 격리
- 시약 준비:
- 표 1에 언급된 모든 버퍼와 미디어를 준비합니다.
- 버퍼를 pH 7.4로 설정하고 나그라제 프로테아제(nagrase protease)를 제외한 4°C(최대 2주)에 저장합니다.
- 매번 신선한 나구프로테아제(표 1)를 준비합니다.
- 조직 제거 및 다진
참고: 미토콘드리아의 격리를 위한 아래 단계의 순서도가 도 1에 제공됩니다.- 완충 1 (표 1)의 ~ 20 mL유리 병기를 채우고 얼음 위에 놓습니다.
- 마우스가 마취 하에 있는 동안, 골격 근 (티비알리스 전방, 사두근, 위장 혈증 등), 약 500-1000 mg을 수확하고, 차가운 버퍼 1을 포함하는 신경병 바이알에 근육을 놓습니....
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결과
우리는 광범위하게이 프로토콜이 기능적이고 그대로 고립 된 골격 근육 미토콘드리아로 수입의 속도를 결정하기위한 유효한 분석이라고 설명했다. 처리되지 않은 조건에 비해, 매트릭스내의 말린 탈수소효소(MDH)와 같은 전형적인 전구체 단백질의 수입은 발리노마이신, 호흡기 사슬 비커플러 (도 2A)에 의해 억제될 수 있기 때문에 멤브레인 전위에 민감하다. 미토콘드리아 내막과 외부 멤브레인이 세제 트리톤 X-100의 존재 시 용해될 때 수입이 방해된다. 수입 공정은 멤브레인 을 가로 질러 전구체 단백질을 전개하는 역할을하는 외부 ATP의 존재에 민감하며 호흡 및 ATP 조항 (20이 표시되지 않음)에 의해 엄격하게 제어됩니다. 수입에 있는 뚜렷한 다름은 또한 단백질 수입 기계 식의 변이때문에 부분적으로, 이 미토콘드리아 (도 2B).......
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토론
미토콘드리아는 세포 내의 합성 및 확장을 위해 핵과 미토콘드리아 게놈의 발현과 조정에 유일히 의존한다. 그러나, 핵게놈은 미토콘드리아 프로테아메의 대다수(99%)를 인코딩하고, 이것은 미토콘드리아 생물 발생을 지원하는 단백질 수입 기계류의 중요성을 강조한다. 수입은 또한 수입 실패가 전개된 단백질 반응 및/또는 mitophagy15,16,26의 개시를 촉진할 수 있기 때문에 중요한 신호 이벤트역할을 한다. 수입은 다기능 채널 및 보호자의 발현, 손상되지 않은 막 전위, ATP의 가용성에 의존하기 때문에, 미토콘드리아 단백질 수입의 평가는 세포기관의 건강과 에너지 상태에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다.
미토콘드리아로 단백질 수입 용량의 평가는 표준 차동 원심 분리 기술을 사용하여 주변 조직에서 세포기관의 분리.......
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공개 사항
이해 상충, 재정적 또는 기타 충돌은 저자에 의해 선언되지 않습니다.
감사의 글
저자는 맥길 대학의 박사 G.C 쇼어, 워싱턴 의과 대학의 A. 스트라우스 박사, 그리고 라 트로브 대학의 박사.M.T. 라이언이 이 연구에 사용 된 표현 플라스미드의 원래 기부에 감사드립니다. 이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)에서 D. A. Hood에 대한 자금 지원을 받았습니다. D. A. 후드는 또한 세포 생리학에 있는 캐나다 연구 의자의 홀더입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2% BSA | Sigma | A2153 | |
| 35S-메티오닌 | Perkin Elmer | NEG709A500UC | 구매하려면 유효한 방사성 동위원소 허가가 필요합니다 |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| 블로팅 페이퍼; Whatman 3MM CHR 종이 | Thermo Fisher | 05-714-5 | |
| 카세트 필름 | Kodak | Kodak Xomatic | |
| 원심분리 튜브 | Thermo Fisher | 3138-0050 | |
| 클로로포름 | Thermo Fisher | C298-4 | |
| DTT | 시그마 | D9779-5G | |
| EDTA | BioShop | EDT002 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| 겔 건조기 | BioRad | 모델 583 | |
| 겔 건조 키트 | Sigma 또는 BioRad | Z377570-1PAK 또는 OW-GDF-10 | 많은 회사를 통해 다양한 옵션을 상업적으로 이용할 수 있으며, 이는 몇 가지 예에 불과합니다. |
| 글리세롤 | Caledon 실험실 화학 물질 | 5350-1-40 | |
| HEPES | 시그마 | H3375 | |
| 고속 원심 분리기 | Beckman Coulter | Avanti J-25 원심 분리기 | |
| 균질화기 | IKA | T25 디지털 울트라 Turrex | |
| 이소 아밀 알코올 또는 3- 메틸 부탄올 | 시그마 | I9392 | |
| KAc | BioShop | POA301.500 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| M7G | New England Biolab | S1404S | 1000ul 20mM HEPES로 희석하여 1mM 재고 |
| 만들기 MgCl | BioShop | MAG510 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher | M65-500 | |
| MOPS | BioShop | MOP001 | |
| NaCl | BioShop | SOD001 | |
| NTP | Thermo Fisher | R0191 | |
| OCT 플라스미드 | - | 캐나다 몬트리올 맥길 대학교 G. C. Shore 박사 | |
| 기증 pGEM4Z / hTom40 플라스미드 | - | 호주 멜버른 라 트로브 대학교 M. T. Ryan 박사 기증 | |
| pGMDH 플라스미드 | - | 워싱턴 대학교 의과 대학 A. 스트라우스 박사 기증 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol | Sigma | P3803 | 제공된 비율로도 만들 수 있습니다. |
| 인 필름 | Fujifilm | BAS-IP MS 2025 | |
| 토끼 망상적혈구 용해물 | Promega | L4960 | 동결-해동을 피하십시오; 도착 시 분취 용해물; 아미노산도 키트에 제공됩니다 |
| RNAsin | Promega도 함께 제공됩니다. | N2311 | |
| 고속 원심분리기용 로터 | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| SDS | BioShop | SDS001.500 | 주의: 섭취하거나 흡입하면 유해하므로 마스크를 착용하십시오. |
| 아세트산 나트륨 | Bioshop | SAA 304 | |
| 탄산 나트륨 | VWR | BDH9284 | |
| 살리실산 나트륨 | 밀리 포어 시그마 | 106601 | |
| 소르비톨 | 시그마 | S6021 | |
| SP6 RNA 중합 효소 | Promega | P1085 | |
| 분광 광도계 | Thermo Fisher | Nanodrop 2000 | |
| Spermidine | Sigma | S-2626 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| T7 RNA 중합효소 | Promega | P2075 | |
| 테이블탑 원심분리기 | Thermo Fisher | AccuSpin Micro 17 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher | A322-500 | |
| Tris | BioShop | TRS001 | |
| & 베타-메르캅토 에탄올 | 시그마 | M6250-100ML |
참고문헌
- Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle. The American Journal of Physiology. 251 (3), Pt 1 395-402 (1986).
- Glancy, B., et al. Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum. Cell Reports. 19
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