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방법 논문

글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출

6.9K 조회수

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DOI:

10.3791/63088

⸱

2022년 2월 8일

 ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Molecular Biosciences, The University of Queensland, 2Centre for Nutrition and Food Sciences, Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation, The University of Queensland, 3Jiangsu Provincial Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 4Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, 5Department of Bioinformatics, School of Medical Informatics and Engineering, Xuzhou Medical University, 6Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety, College of Agriculture, Yangzhou University, 7Glycation and Diabetes Group, Mater Research Institute-The University of Queensland, Translational Research Institute

이 논문에서

요약

최적의 슈크로스 농도는 슈크로스 밀도 구배 원심분리를 사용하여 간 글리코겐의 추출을 위해 결정하였다. 글리코겐 분해 효소를 억제하기 위해 10분 끓는 단계를 추가하면 유익한 것으로 입증되었습니다.

초록

간 글리코겐은 동물의 혈당 수치 유지에 관여하는 과분지 포도당 중합체입니다. 글리코겐의 특성은 그 구조의 영향을 받습니다. 따라서 글리코겐의 대표 샘플을 분리하는 적절한 추출 방법은 이 거대분자 연구에 매우 중요합니다. 다른 추출 방법과 비교하여, 슈크로스 밀도 구배 원심분리 단계를 사용하는 방법은 분자 손상을 최소화할 수 있습니다. 이 방법을 기초로, 최근의 간행물에서는 원심분리 중에 사용되는 슈크로스 용액의 밀도를 변화(30%, 50%, 72.5%)하여 다양한 크기의 글리코겐 입자를 추출하는 데 가장 적합한 농도를 찾아 더 작은 입자의 손실을 제한하는 방법을 설명합니다. 글리코겐 분해 효소를 변성시켜 글리코겐을 보존하는 능력을 테스트하기 위해 10분 끓는 단계를 도입했습니다. 가장 낮은 슈크로스 농도(30%)와 비등 단계의 첨가는 글리코겐의 가장 대표적인 샘플을 추출하는 것으로 나타났다.

서론

글리코겐(Glycogen)은 동물, 곰팡이 및 박테리아에서 발견되는 포도당의 복잡한 과분지 중합체입니다1. 포유류에서 간 글리코겐은 항상성을 보존하는 혈당 완충 역할을 하는 반면, 근육 글리코겐은 에너지를 직접 공급하는 단기 포도당 저장소 역할을 한다2. 글리코겐의 구조는 종종 세 가지 수준으로 설명됩니다(그림 1 참조). 1. 선형 사슬은 (1→4)-α 글리코시드 결합을 통해 포도당 단량체에 의해 형성되며, 분기점은 (1→6)-α 글리코시드 결합을 통해 연결됩니다. 2. 특히 골격근과 같은 조직에서 독립적 인 글리코겐 분자 3,4로 작용하는 고도로 분지 된 β 입자 (직경 ~ 20 nm); 3. 더 작은 β 글리코겐 단위로 구성된 더 큰 α 글리코겐 입자(직경 300nm까지)는 간5, 심장6 및 일부 비포유류 종7에서 발견된다. 당뇨병 마우스의 간 α 입자는 분자적으로 깨지기 쉬우며 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해될 때 β 입자로 분해되는 경향이 있는 반면, 비당뇨병 대조군의 α 입자는 일반적으로 변하지 않습니다. 한 가지 가설은 이러한 취약성이 당뇨병에서 볼 수 있는 열악한 혈당 균형을 악화시킬 수 있으며, 깨지기 쉬운 α 입자가 잠재적으로 더 빠르게 분해되는 β 입자 8,9,10,11의 비율을 높일 수 있다는 것입니다.

전통적인 글리코겐 추출 방법은 간 조직을 뜨거운 알칼리성 용액(12) 또는 트리클로로아세트산(TCA)13 또는 과염소산(PCA)14과 같은 산 용액에 노출시키는 비교적 가혹한 조건을 이용합니다. 간 조직의 다른 성분에서 글리코겐을 분리하는 데 효과적이지만, 이러한 방법은 필연적으로 글리코겐 구조를 어느 정도 저하시킵니다15,16. 이러한 방법은 글리코겐 함량의 정량적 측정에 적합하지만 이러한 구조적 손상으로 인해 글리코겐에 대한 구조적 정보를 얻는 데 중점을 둔 연구에는 적합하지 않습니다. 이러한 방법의 개발 이후, 슈크로스 밀도 구배 초원심분리 17,18,19와 함께 차가운 트리스 완충액(글루코시다제 분해를 억제하는 것으로 나타남)을 활용하는 보다 온화한 추출 절차가 개발되었다. pH가 ~8로 제어된 상태에서 이 방법은 글리코겐을 이전 절차에서 볼 수 있는 산 또는 알칼리성 가수분해에 노출시키지 않습니다.

균질화된 간 조직의 자당 밀도 구배 초원심분리는 대부분의 세포 물질에서 글리코겐 입자를 분리할 수 있습니다. 필요한 경우, 추가적인 정제는 제조용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있으며, 그 결과 부착된 글리코겐-결합 단백질(20)과 함께 정제된 글리코겐을 수거할 수 있다. 이 방법은, 보다 온화한 조건에서, 글리코겐의 구조를 보존할 가능성이 더 높지만, 글리코겐의 일부가 상층액, 특히 밀도가 낮은 더 작은 글리코겐 입자에서 손실되는 것을 방지하기는 어렵다15. 글리코겐 손실의 또 다른 잠재적 원인은 온화한 조건에서 일부 효소 분해가 발생하여 더 가혹한 추출 방법에 비해 글리코겐 수율이 낮아진다는 것입니다. 최근 연구에서는 글리코겐21의 구조를 보존하기 위해 간-글리코겐 추출 방법을 최적화했다고 보고했습니다. 여기서, 다양한 슈크로스 농도(30%, 50%, 72.5%)를 시험하여 더 낮은 슈크로스 농도가 더 작은 글리코겐 입자의 손실을 최소화하는지 여부를 결정하였다. 그 근거는 밀도가 낮을수록 더 작고 밀도가 낮은 입자가 자당 층을 관통하여 나머지 글리코겐과 함께 펠릿에 응집될 수 있다는 것이었습니다.

이 연구에서는 글리코겐 분해 효소가 변성될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 10분 끓는 단계가 있는 추출 방법과 없는 추출 방법을 비교하여 부분 분해가 없는 더 많은 글리코겐을 추출했습니다. 추출된 글리코겐의 구조를 결정하기 위해 전체 분자 크기 분포 및 글리코겐 사슬 길이 분포를 사용했으며, 이는 이전에 발표된 전분 추출 최적화와 유사합니다22. 시차 굴절률(DRI) 검출 기능이 있는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 총 분자량을 분자 크기의 함수로 설명하는 글리코겐의 크기 분포를 얻었습니다. 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE)을 사용하여 각 주어진 크기(또는 중합 정도)의 글루코시드 사슬의 상대적 수를 설명하는 사슬 길이 분포를 분석했습니다. 본 논문은 이전의 최적화 연구21을 기반으로 간 조직에서 글리코겐을 추출하는 방법론을 설명한다. 데이터는 글리코겐 구조를 보존하는 데 가장 적합한 방법이 10분 끓는 단계로 30%의 자당 농도임을 시사합니다.

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프로토콜

이 절차(21 )를 최적화하기 위해 사용된 마우스 간은 12마리의 수컷 BKS-DB/Nju 배경 마우스(7.2주령, 재료 표 참조)로부터 얻은 것이었다. 동물 사용은 우한 대학 동물 관리 및 윤리 위원회의 인민 병원, IACUC 문제 번호에 의해 승인되었습니다. WDRM 20181113.

1 동물 조직

  1. 쥐의 간(각 쥐의 전체 간 1-1.8g)의 무게를 잰다.
  2. 쥐의 간을 액체 질소에 급속 얼린 후 -80°C에서 보관합니다.

2. 완충액 및 시약의 제조

  1. 탈이온수로 5mM Tris, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 50mM NaF 및 5mM 피로인산나트륨을 포함하는 글리코겐 분리 완충액을 준비하고 pH를 8로 조정합니다.
  2. 30%(w/w) 자당 용액(간 글리코겐21에 가장 적합한 것으로 밝혀짐)을 준비합니다.
  3. 아세트산나트륨 완충액(1M, pH 4.5), 아세트산 완충액(0.1M, pH 3.5), 수산화나트륨 용액(0.1M) 및 시아노보로하이드라이드나트륨(1M)을 준비한다.
  4. 15% 빙초산 50μL에 APTS 5mg을 첨가하여 8-아미노피렌-1,3,6-트리설포네이트(APTS) 용액을 제조합니다.
  5. 50% 아지드화나트륨과 함께 0.02mM 질산암모늄을 함유한 질산암모늄 용액을 준비합니다.

3. 글리코겐 추출(그림 2)

  1. 얼어붙은 간 조직(~1g)을 6mL의 글리코겐 분리 완충액이 들어 있는 15mL 튜브에 옮깁니다.
  2. 얼음 위에 두고, 조직 균질화기를 사용하여 간 조직을 균질화하십시오.
  3. 현탁액의 절반(3mL)을 새 튜브에 옮기고 10분 동안 끓입니다(글리코겐 구조 연구21에 최적인 것으로 나타남). 현탁액의 나머지 절반(3mL)을 얼음 위에 두어 변성되지 않은 관련 단백질을 포함하는 글리코겐을 추출합니다.
    알림: 끓이지 않은 샘플은 글리코겐 추출 단계 동안 항상 얼음 위에 보관해야 합니다. 글리코겐 단백질이 연구에 중요하지 않은 경우 전체 샘플은 10분 끓는 단계를 거칠 수 있습니다.
  4. 각 튜브에서 8μL 부분 표본을 제거하고 부분 표본을 얼음 위에 보관한 다음 글리코겐 함량 측정에 사용합니다(섹션 4 참조).
  5. 나머지 현탁액을 6,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  6. 상층액을 초원심분리 튜브로 옮기고 3.6 × 105g에서 4°C에서 90분 동안 원심분리합니다. 
  7. 나머지 상층액을 버리고 펠릿을 1.5mL의 글리코겐 분리 완충액에 재현탁시킵니다.
  8. 4mL 초원심분리 튜브에 30% 자당 용액 1.5mL에 샘플을 층층화하고 4°C에서 2시간 동안 3.6 ×10-5g의 원심분리기를 사용합니다. 
  9. 나머지 상층액을 버리고 펠릿을 200μL의 탈이온수에 재현탁시킵니다.
  10. 현탁액에 800μL의 절대 에탄올을 첨가하고 잘 혼합하여 글리코겐23,24를 침전시킵니다. 혼합물을 -20 °C에서 최소 1시간 동안 보관하여 침전되도록 합니다.
  11. 샘플을 6,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 200μL의 탈이온수에 재현탁시킵니다.
  12. 이 에탄올 침전 과정을 3번 반복하고 최종 글리코겐 펠릿을 200μL의 탈이온수에 재현탁시킵니다.
  13. 글리코겐 함량 측정을 위해 각 튜브에서 8μL의 부분 표본을 제거합니다(섹션 4 참조).
  14. 나머지 상층액을 액체 질소에 얼리고 밤새 동결 건조(동결건조)합니다. 건조 글리코겐 샘플을 -20°C의 냉동실에 보관합니다.
    참고: 건조 글리코겐 샘플은 -20°C에서 안정적이어야 합니다. 그러나 구조적 변화 없이 얼마나 오래 지속되는지를 나타내는 데이터는 없습니다.

4. 글리코겐 함량 측정(그림 3)

  1. 8μL의 글리코겐 상층액(섹션 3.13 및 3.4 참조), 5μL의 아밀로글루코시다아제(3269U/mL) 및 100μL의 아세트산나트륨 완충액(1M, pH 4.5)을 마이크로 원심분리 튜브에 추가하고 튜브를 탈이온수로 500μL 표시까지 채웁니다.
  2. 아밀로글루코시다아제 대신 탈이온수를 사용하는 대조군을 준비합니다.
  3. 대조군을 얼음 위에 유지한 상태에서 50°C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
  4. 4°C에서 6,000× g 으로 10분 동안 원심분리하고 생성된 각 상층액 300μL를 글루코시다아제 산화효소/과산화효소(GOPOD) 시약 1mL와 혼합합니다.
  5. 0, 10, 20, 30, 40 및 50μg의 D-글루코스를 포함하는 300μL의 탈이온수와 1mL의 GOPOD 시약을 혼합하여 검량선을 구성합니다.
  6. 혼합물을 50°C에서 30분 더 배양합니다.
  7. UV-vis 분광광도계를 사용하여 96웰 플레이트(웰당 150μL)를 사용하여 각 샘플의 흡광도(510nm)를 판독합니다.
  8. 실험 샘플의 흡광도에서 대조군 샘플(아밀로글루코시다아제 없음)의 흡광도를 뺀 다음 D-포도당 표준 곡선을 기반으로 글리코겐 함량을 계산합니다.

5. 조잡한 수확량, 글리코겐 수확량 및 순수성 결정

  1. 조잡한 수율의 경우, 동결 건조된 글리코겐 샘플의 무게를 측정하고 수율을 습윤 간 조직의 백분율로 계산합니다.
    참고: 이 수율은 각 글리코겐 함량 단계에서 취한 부분 표본을 보정하기 위해 조정해야 합니다.
  2. 글리코겐 순도의 경우 최종 펠릿의 글리코겐 함량을 측정하십시오., 섹션 4에 설명된 대로. 원유 수율에 대한 결정된 글리코겐 함량의 백분율로 순도를 계산합니다(5.1단계 참조).
  3. 글리코겐 수율의 경우, 섹션 4에 설명된 대로 끓이지 않고 원심분리하기 전에 균질화된 샘플의 글리코겐 함량을 측정합니다. 글리코겐 수율을 최종 펠릿의 글리코겐 함량의 백분율로 계산합니다(단계 5.2 참조) 초기 균질액에서 측정된 글리코겐 함량의 글리코겐 함량.

6. 체인 길이 분포 분석(그림 4)

  1. 1.5mL 튜브에 동결 건조된 글리코겐 0.5mg을 계량합니다.
  2. 90μL의 탈이온수와 1.5μL의 아지드화나트륨(0.04g/mL)을 튜브에 추가합니다.
  3. 5μL의 아세트산 완충액(0.1M, pH 3.5)과 2μL의 이소아밀라아제 용액(180U/mg)을 튜브에 추가하여 글리코겐을 분선합니다.
  4. 샘플을 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
  5. 샘플에 5μL의 수산화나트륨 용액(0.1M)을 추가하여 pH를 7.0으로 높입니다.
  6. 샘플을 액체 질소에 동결하고 밤새 동결 건조(동결건조)합니다.
  7. 동결 건조된 분지형 글리코겐에 2μL의 APTS 용액(15% 빙초산 50μL에 APTS 5mg)과 시아노보로하이드라이드나트륨(1M) 2μL를 추가합니다.
  8. 샘플을 4,000× g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
  9. 어두운 곳에서 60°C에서 3시간 동안 샘플을 배양합니다.
    알림: 튜브는 내용물을 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮을 수 있습니다.
  10. 200μL의 탈이온수를 샘플에 추가하고 모든 침전물이 용해될 때까지 소용돌이칩니다.
  11. 샘플을 4,000× g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
  12. 분석을 위해 50μL의 부분 표본을 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 마이크로 바이알로 옮깁니다.
    알림: 데이터는 각 중합 정도(DP, 기호 X)에 대한 (분지화된) 사슬(Nde(X))의 상대적 풍부도로 표시됩니다.

7. 분자 크기 분포 분석(그림 5)

  1. 동결 건조된 글리코겐 0.5mg을 질산암모늄 50mg과 아지드화나트륨 0.02%에 1mg/mL로 녹입니다.
  2. 샘플을 80°C의 열혼합기에서 300rpm에서 3시간 동안 배양합니다.
  3. 0.3mL/min의 유속으로 80°C에서 사전 컬럼과 1000 Å 및 10,000 Å 컬럼을 사용하여 SEC 시스템에 시료를 주입합니다( 재료 표 참조). 굴절률 검출기를 사용하여 각 용리 부피에서 분자의 상대적 중량을 측정합니다.
  4. 몰 질량이 342에서 1.22 × 106 사이인 풀루란 표준(PSS)을 사용하여 SEC 범용 검량선을 플로팅하여 용리 시간을 Rh(유체역학적 반경)로 변환합니다. 시차 굴절률(DRI) 검출기의 데이터를 SEC 중량 분포 w(log Rh)를 Rh의 함수로 표현합니다.

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결과

상술한 절차가 가장 최적의 방법(10분 비등 단계를 첨가한 30% 슈크로스)에 대한 것이지만, 앞서 기술한 바와 같이, 3개의 슈크로스 농도(30%, 50%, 72.5%)를 통해 추출된 글리코겐에 대한 데이터가 여기에 제공된다(21). 프로토콜에 따라, 상이한 조건에 의해 추출된 건조 글리코겐의 순도, 조율 및 글리코겐 수율은표 21에서 재현된 표 1에 나와 있다. 다양한 조건으로 추출한 그룹 간에 조수 수율과 글리코겐 수율에 유의한 차이가 없었습니다. 대조적으로, 글리코겐 순도는 슈크로스 농도 (표 1, P < 0.001) 및 비등 단계 (표 1, P < 0.0001)의 첨가에 의해 유의하게 영향을 받았다. 가장 높은 순도의 글리코겐은 10분 비등 단계와 함께 30% 슈크로스 농도를 사용하여 추출되었으며, 이것이...

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토론

이전 연구에 따르면 글리코겐의 구조는 그 특성에 중요합니다. 예를 들어, 분자 크기는 글리코겐(10)의 분해 속도에 영향을 미치고, 사슬 길이 분포는 이의 용해도(26)에 영향을 미친다. 이러한 관계를 제대로 이해하려면 대표적이고 손상되지 않은 샘플을 가능한 한 많이 분리하는 절차로 글리코겐을 추출하는 것이 중요합니다. 전통적인 추출 방법은 고온 알칼리성 조건 또는 저온 산을 사용했습니다. 글리코겐을 다른 조직 성분으로부터 분리하는 데 효과적이지만, 이러한 방법은 화학적으로 가혹하며 글리코겐27의 분자 구조를 분해하는 것으로 나타났습니다.

그 이후로 슈크로스 밀도 구배 원심분리(17,18)를 사용하는 비교적 부드러운 방법이 개발되어, 대부분의 세포 ...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 FACE에 대한 기술 지원을 해준 Mr. Gaosheng Wu와 Miss Yunwen Zhu, SEC에 대한 기술 지원을 해준 Mr. Zhenxia Hu와 Mr. Dengbin에게 감사를 표합니다. MAS는 Advance Queensland Industry Research Fellowship, Mater Foundation, Equity Trustees, L G McCallam Est and George Weaber Trusts의 지원을 받습니다. 이 연구는 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램, 중국 자연 과학 재단 보조금 C1304013151101138, 2017 장쑤 혁신 및 기업가 정신 인재 프로그램의 지원을 받았습니다. 그림 1-5는 BioRender를 사용하여 작성되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
8-아미노피렌-1,3,6-트리설포네이트(APTS)SIGMA Aldrich93410.1M 용액
아세트산SIGMA Aldrich6950920.1M, pH 3.5 용액
Agilent 1260 Infinity SEC 시스템Agilent, Santa Clara, CA, USA크기 배제 크로마토그래피(SEC)
BKS-DB/Nju 배경 마우스난징 대학교 난징 생물 의학 연구소
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format)MegazymeK-GLUC
에틸렌딘니트릴로테트라아세트산(EDTA)SIGMA Aldrich431788
HomogenizerIKAT 25
염산SIGMA Aldrich21040.1 M 용액
염산SIGMA Aldrich21040.1 M 용액
P/ACE MDQ plus 시스템Ab Sciex, USFluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
굴절률 검출기Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetateSIGMA Aldrich2412451 M, pH 4.5 solution
Sodium azideSIGMA AldrichS2002
염화나트륨SIGMA AldrichS9888
시안노보로하이드라이드나트륨 SIGMA Aldrich1561591M 용액
화나트륨SIGMA Aldrich201154
수산화나트륨SIGMA Aldrich436170.1M 용액
질산나트륨SIGMA AldrichNISTRM8569
피로인산나트륨SIGMA Aldrich221368
SucroseSIGMA AldrichV90016
SUPREMA pre-column, 1,000 및 10,000 columnsPolymer Standards Services, 독일크기 배제 크로마토그래피(SEC)
TrizmaSIGMA AldrichT 1503
Ultracentrifuge tubesBeckman4 mL, open-top thinwall Ultra-clear tube, 11 x 60 mm
불 마인츠

참고문헌

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