이 프로토콜은 비강 상피 세포 수집, 확장 및 기관형 기도 상피 세포 모델로의 분화와 라이브 셀 이미징 및 맞춤형 스크립트를 통한 섬모 박동 빈도의 정량화를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
섬모 기능 (박동 빈도, 패턴)의 측정은 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 호흡기 질환의 진단 도구로 확립되었습니다. 그러나, 이들 기술의 더 넓은 적용은 온도, 습도 및 pH와 같은 환경 인자의 변화에 대한 섬모 기능의 극단적 인 민감성에 의해 제한된다. 낭포 성 섬유증 (CF) 환자의기도에서 점액 축적은 섬모 박동을 방해합니다. 섬모 기능은 CF 막 횡단 전도도 조절기 (CFTR) 채널 활성의 지표로서 1 차기도 세포 모델에서 조사되었습니다. 그러나 동일한 CFTR 돌연변이를 가진 환자의 경우에도 CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 섬모 박동 빈도의 상당한 환자 간 변동성이 발견되었습니다. 또한, 기능 장애 CFTR 조절 염화물 분비가 섬모 기능에 미치는 영향은 잘 이해되지 않았습니다. 현재 체외 기도 모델의 샘플 준비, 이미지 획득 및 섬모 박동 주파수 (CBF) 분석을 입증하는 포괄적 인 프로토콜은 없습니다. 환경적으로 통제된 조건에서 수행된 표준화된 배양 조건 및 이미지 획득은 개인 간 및 CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 CBF의 일관되고 재현 가능한 정량화를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세 가지 다른 기도 상피 세포 모델 시스템에서 CBF의 정량화를 설명합니다: 1) 천연 상피 시트, 2) 투과성 지지 삽입물 상에서 이미징된 공기-액체 인터페이스 모델, 및 3) 세포외 기질-포매된 3차원 오가노이드. 후자의 두 가지는 생체 내 폐 생리학을 복제하여 섬모를 뛰고 점액을 생성합니다. 섬모 기능은 환경 제어 챔버에서 고속 비디오 카메라를 사용하여 캡처됩니다. 사용자 정의 스크립트는 CBF 분석에 사용됩니다. CBF 측정을 클리닉으로 번역하는 것은 환자별로 CFTR 조절 약물에 대한 반응을 예측하는 데 중요한 임상 도구로 구상됩니다.
서론
섬모 박동 빈도(CBF) 및 패턴의 측정은 원발성 섬모 운동 이상증(PCD)1과 같은 호흡기 질환의 진단 도구로 확립되었습니다. 낭포 성 섬유증 (CF)에서 CF 막 횡단 전도도 조절기 (CFTR) 염화물 채널의 기능 장애는기도 표면 액체의 탈수 및 점액 섬모 클리어런스 손상2을 유발합니다. 섬모 기능은 CFTR 채널 활성의 지표로서 일차 기도 세포 모델에서 시험관내에서 조사되었다3. 그러나, 동일한 CFTR 돌연변이를 가진 환자의 경우에도, CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 CBF에 상당한 환자 대 환자 가변성이 존재한다3. 또한, 기능 장애 CFTR 조절 염화물 분비가 섬모 기능에 미치는 영향은 잘 이해되지 않았습니다. 현재 체 외 기도 모델의 샘플 준비, 이미지 획득 및 CBF 분석을 입증하는 포괄적 인 프로토콜은 없습니다.
비강 점막 칫솔질로부터 분리 된 비강 상피 시트는 PCD 진단4을위한 섬 모체 기능의 측정에 직접 사용된다. 그러나, 수득된 비강 상피 시트의 크기 또는 ....
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프로토콜
연구 승인은 Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120)로부터 받았다. 생체 표본을 수집하기 전에 모든 참가자(또는 참가자의 보호자)로부터 서면 동의를 받았습니다.
1. 기도 상피세포 모델 구축을 위한 준비
- 80% Dulbecco의 변형 독수리 배지와 20% 태아 소 혈청을 결합하여 비강 세포 수집 배지를 준비합니다. 1 μL/mL의 페니실린/스트렙토마이신을 보충하십시오. 4°C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오.
- 플라스크 또는 투과성 지지체 삽입물을 1.2.1-1.2.4단계에 따라 필요에 따라 콜라겐 용액으로 코팅합니다. 콜라겐이 코팅된 용기를 장기간 보관하지 마십시오.
- I형 콜라겐 용액(3mg/mL 스톡)을 인산완충식염수(PBS)로 1:100 희석하여 0.03mg/mL의 최종 농도로 만듭니다. 잘 섞는다.
- 준비된 콜라겐 용액의 세포 배양 플라스크(섹션 4)를 160μL/cm2(즉, T25 플라스크당 4mL) 및 투과성 지지체 삽입물(섹션 5)을 455μL/cm2(즉, 6.5mm 삽입물당 150μL)로 코팅합니다.
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결과
CBF를 정량화하는 데 있어 이 프로토콜의 효율성을 입증하기 위해, CF를 가진 3명의 참가자와 3명의 건강한 대조군 참가자로부터 유래된 기도 상피 세포 ALI 모델에서 측정된 CBF의 결과가 제시된다. 배양 분화 14일째에 박동섬모가 존재했습니다(그림 6). 배양 분화 14일째부터 21일째까지, 두 코호트 모두에서 통계적으로 유의한(P < 0.0345) CBF 증가가 관찰되었다. 배양 분화 21일차에 건강한 대조군 참가자(7.61 ± 0.11Hz)의 평균 CBF는 CF(6.7±5 0.17Hz)를 가진 참가자의 평균 CBF보다 유의하게 높았습니다. 점액 축적 및 제거가 CBF에 영향을 미치는 정도를 이해하기 위해, CBF는 점액 제거 후 동일한 세포 모델에서 이미징되었다. 건강한 개인과 CF를 가진 사람 모두의 ALI 모델에서 점액을 제거했을 때 CBF가 통계적으로 유의하게 증가했습니다(P < 0.0001).<.......
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토론
비강 상피 시트에서 CBF의 정량화를 모호하게 할 수있는 여러 요인이 있습니다. 상피 시트는 이 시간 동안 섬모 기능이 가장 안정적이기 때문에 샘플 수집 후 3-9시간 이내에 이미지화되어야 합니다(37). 적혈구와 파편이 적을수록 데이터 수집을 방해하기 때문에 이미징에 가장 적합합니다. 이미징을 위한 ROI를 선택할 때, 이러한 변수가 CBF5에 영향을 미치는 것으로 입증되었기 때문에 샘플 수집 중에 가장자리가 손상되거나 중단되지 않은 상피 시트를 선택하는 것이 중요하며, 부착되지 않은 단일 상피 세포가 아닙니다. 또한 움직임이 데이터 수집을 가릴 수 있기 때문에 상피 시트가 정지되어 있어야합니다. 매체의 상피 시트는 종종 다른 방향으로 향합니다27. 파괴된 상피 가장자리와 같은 샘플 품질의 차이가 CBF5에 영향을 미친다는 것이 이전에 입증되었기 때문에 상피.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다고 선언합니다.
감사의 글
연구 참가자와 그 가족의 기여에 감사드립니다. 환자 생체 표본의 조직 및 수집에 대한 시드니 아동 병원 (SCH) 랜드 윅 호흡기 부서의 도움에 감사드립니다 - 존 위저 박사, 이본 벨레시스 박사, 리앤 플러시, 아만다 톰슨, 론다 벨에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 UNSW 시드니의 Mark Wainwright Analytical Centre 내의 Katharina Gaus Light Microscopy Facility의 Iveta Slapetova와 Renee Wan의 도움을 인정합니다. 이 작업은 NHMRC(National Health and Medical Research Council) Australia(GNT1188987), CF Foundation Australia 및 Sydney Children's Hospital Foundation의 지원을 받습니다. 저자는 Luminesce Alliance - 어린이 건강을위한 혁신의 기여와 지원에 대해 인정하고 싶습니다. Luminesce Alliance - 어린이 건강을위한 혁신은 시드니 어린이 병원 네트워크, 어린이 의학 연구소 및 어린이 암 연구소 간의 비영리 협력 합작 투자입니다. 소아과 연구를 조정하고 통합하기 위해 NSW 정부의 지원으로 설립되었습니다. Luminesce Alliance는 University of Sydney 및....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아데닌 | 시그마-알드리치 | A2786 | 10 mg/mL |
| 고급 DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| 알라닐-글루타민 | 시그마-알드리치 | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | 옥스포드 기기 | 빠른 프레임 속도(>100 Hz) 과학 카메라 | |
| 보틀탑 진공 필터 시스템 | Sigma-Aldrich | ||
| 세프타지딤 수화물 | 시그마-알드리치 | A6987 | 50mg/mL |
| 세포 배양 현미경 | 올림푸스 | CKX53 | |
| CFI S 계획 형광 ELWD 20XC | 니콘 기기 Inc. | MRH08230 | 긴 작동 거리 대물 렌즈. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| 콜레라 독소 | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µ g/mL |
| 코닝 젤 여과기 40 UM | 시그마-알드리치 | CLS431750 | 기공 크기 40 μ m |
| 코닝 마트리겔 매트릭스 (페놀 레드 프리) | 코닝 | 356231 | 세포외 매트릭스 (ECM) |
| 코닝 보틀탑 진공 필터 시스템 | 시그마-알드리치 | CLS431098 | |
| 코닝 쿨셀 LX 세포 냉동 용기 | 시그마-알드리치 | CLS432002 | |
| 코닝 트랜스웰 폴리에스테르 멤브레인 세포 배양 인서트 | 시그마-알드리치 | CLS3470 | 투과성 지지대 인서트. 6.5mm 트랜스웰(0.4 &mu) M 모공 폴리 에스테르 멤브레인 인서트. |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
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| 세포학 브러시 | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′ s 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | 라이브 셀 이미징 현미경. | |
| 소 태아 혈청, 인증, 열 비활성화, 미국 | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific 15290018 | 250 µ g/mL | |
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| Graphpad Prism | Graphpad | 과학 분석 소프트웨어 | |
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| HEPES 용액 | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| 인큐베이터 NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | 현미경 환경 챔버. 따뜻한 공기 배양 및 국소 CO2 및 O2 가스 허용 | |
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| Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
| Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
| MATLAB | MathWorks | 컴퓨팅 소프트웨어 | |
| Microsoft Excel | Microscoft | 스프레드시트 소프트웨어 | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | 방사선 조사, NIH-3T3, 마우스 배아 공급 |
| NIS-Elements, AR | Nikon Instruments, Inc. | 이미지 수집 소프트웨어 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마-알드리치 | P4333 | 10,000 단위 페니실린 및 10 mg 스트렙토마이신/mL |
| 둘베코&프라임; s 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult 기도 오가노이드 키트 | StemCell Technologies | 5060 | 기도 오가노이드 키트 |
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| Y-27632 2HCl(ROCK 억제제) | Selleckchem | S1049 | 10mM |
| 토브라마이신 | Sigma-Aldrich | T4014 | 100mg/mL |
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| UNO 스테이지 상단 인큐베이터 | Okolab | 현미경 인큐베이터. 온도, 습도 및 CO2 조절 가능 |
참고문헌
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Cutting, G. R. Cystic....
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재인쇄 및 허가
