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방법 논문

오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화 된 산탄총 프로테오믹스 샘플 처리

3.6K 조회수

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DOI:

10.3791/63092

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2021년 10월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

이 논문에서

요약

상세한 프로토콜과 3개의 Python 스크립트는 광원 로봇 액체 처리 시스템을 운영하여 세제 제거, 단백질 소화 및 펩타이드 탈염 단계를 포함하는 대량 분광 실험에 대한 반자동 단백질 샘플 준비를 수행하기 위해 제공됩니다.

초록

질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스 실험은 효소 단백질 소화 및 정리를 포함한 여러 샘플 준비 단계가 필요하며, 이는 상당한 시간의 벤치 노동을 수용하고 배치 대 배치 가변성의 원천을 제시할 수 있습니다. 파이펫팅 로봇을 통한 실험실 자동화는 수동 작업을 줄이고, 처리량을 최대화하며, 연구 재현성을 높일 수 있습니다. 여전히, 표준 자동화 스테이션의 가파른 시작 가격은 많은 학술 실험실에 대한 저렴한 합니다. 이 문서에서는 반자동 단백질 감소, 알킬레이션, 소화 및 정화 단계를 설정하는 지침을 포함하여 저렴한 오픈 소스 자동화 시스템(Opentrons OT-2)을 사용하여 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우에 대해 설명합니다. 뿐만 아니라 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 통해 OT-2 시스템을 프로그래밍하는 오픈 소스 파이썬 스크립트를 동반.

서론

질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스는 생물학적 시료에 많은 단백질의 풍부를 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 생물 정보학 분석을 사용한 프로테오믹스 실험은 일상적으로 생체 마커를 식별하고 병리학 적 메커니즘을 뒷받침하는 관련 생물학적 복합체 및 경로를 발견하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 높은 분석 특이성 및 잠재적 정량적 정확도를 갖춘 산탄총 프로테오믹스는 항체에 의존할 필요 없이 임상 샘플 분석을 위한 연구 시설 및 진단 실험실에서 채택될 수 있는 우수한 잠재력을 가지고 있습니다1,2.

산탄총 프로테오믹스 분석을 위한 단백질 샘플을 준비하려면 생물학적 샘플(예: 세포 및 조직)에서 추출한 단백질은 일반적으로 시료 단백질 농도, 단백질 감소 및 알킬레이션 측정, 펩타이드로효소 소화 를 측정하는 것을 포함하여 긴 프로토콜을 사용하여 처리되어야 합니다. 더욱이, 세제를 함유하는 일반적인 용해 완충제에서 추출된 단백질은 종종 세제가 트립신 소화를 방해하고 다운스트림 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석3의 성능을 현저히 저하시킬 수 있기 때문에 분석 전에 완충교환 또는 세제 제거의 추가 단계가 필요합니다. 펩타이드는 전형적으로 효소 소화에 따른 LC-MS/MS 호환 용매에서 더 탈염, 건조 및 재구성된다. 이러한 단백질 생화학 절차는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 따라서 프로테오믹스 워크플로우의 처리량을 계속 제한하고 획득한 data4,5의 가변성에 기여합니다. 인간의 오류와 편견은 데이터 분산 및 재현성에 영향을 미치는 중요한 요인으로 인식되어 왔습니다6,7. 대량 분광샘플 준비 워크플로우에서 인간의 오류를 최소화하기 위해, 자동화된 파이펫팅 로봇 시스템은 산탄총 프로테오믹스및 표적 질량 분광분석에서 단백질 식별 및 정량화의 처리량 과 재현성을 개선하기 위해 활용되었으며, 이러한 발전은 연구 및 임상 설정에서 중요한 프로테오믹스 기술의 광범위한 채택을 계속하는 데 중요한 역할을 해왔습니다. 9,10,11,12,13. 그러나 대부분의 기존 프로토콜은 상당한 투자와 교육이 필요한 로봇 액체 처리 플랫폼을 활용하여 학업 환경이나 제한된 예산으로 많은 실험실에서 유틸리티를 제한합니다.

이 문서에서는 일반적인 산탄총 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 반 자동화하기 위해 저렴한 오픈 소스 로봇 액체 처리 시스템인 OT-2를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. OT-2는 다른 많은 로봇 액체 처리 시스템보다 비용이 낮으며 작성 시 약 5,000 달러의 비용이 듭니다. 다른 모듈 과 labware의 가격을 고려할 때, 쓰기 의 시간에이 프로토콜에 실험을 설정하는 총 비용은 약 $10,000, 이는 더 비싼 옵션을 통해 실험실의 상당히 넓은 세트에 더 저렴 렌더링. OT-2는 파이썬 스크립트를 통한 오픈 소스 프로그래밍과 호환되며 사용자 정의 DIY 프로토콜 설계에서 뛰어난 유연성을 제공합니다. 사내 개발된 3개의 스크립트를 사용하여, 아래 프로토콜은 정형 단백질 표준(소 혈청 알부민)을 가진 OT-2 스테이션에서 전형적인 산탄총 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 실행한다. BSA) 및 정상적인 인간 심장 리자테의 복잡한 단백질 샘플(도 1). (1) BSA 샘플 및 (2) 복잡한 심장 용해 샘플을 처리하는 절차는 각각 프로토콜 섹션 1, 2, 5, 6 및 3, 4, 5, 6에 상세합니다. 세라-매그 카복틸레이트 변형 마그네틱 비즈는 단백질 및 펩타이드 샘플에서 세제 및 염을 제거하기 위해 단일 냄비 고체 상 강화 시료 제제(SP3)에 활용된다. 소 세럼 알부민과 인간의 심장 단백질의 트립틱 소화는 SP3 구슬에 의해 더 세척되고 LC-MS/MS 분석을 위해 제출됩니다. 질량 스펙트럼은 펩티드 및 단백질 식별을 위한 MaxQuant 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 당사가 수행한 대표적인 결과는 프로토콜이 벤치 시간을 절약하면서 우수한 기술적 계수(CV)를 달성하고 손다이에 열등하지 않은 것으로 나타났습니다.

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프로토콜

개발 된 파이썬 스크립트는 GitHub에 입금되었습니다 : https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. 스크립트의 복사본은 보충 파일 1에 제공됩니다. 최신 버전의 GitHub 리포지토리를 참조하십시오.

1. 실험 적 준비

  1. 프로토콜을 시작하기 전에 필요한 하드웨어를 확인합니다.
    참고: OT-2 파이펫, 파이펫 팁, 4-in-1 튜브 랙 세트, 알루미늄 블록 세트, 자기 모듈, 온도 모듈, 96웰 2mL 딥 웰 플레이트( 재료 표 참조)의 하드웨어 구성 요소가 필요합니다.

2. 단일 단백질 소 소 세럼 알부민 (BSA)을 사용하여 질량 분석법 (MS) 샘플 준비

  1. 텍스트 편집기에서 NoSP3_digestion.py 스크립트를 열고 사용자 지정 여기 만 섹션에서 필요에 따라 실험별 변수를 지정합니다.
    참고: 실험별 변수에는 샘플 및 복제 수가 포함됩니다. 샘플 농도; 시약 디티오스리톨의 부피 - DTT, 요오도아세타미드 - IAA 및 트립신; DTT 및 IAA 인큐베이션 시간 및 파이펫 P20/P50 및 P300용 시작 팁).
    1. Opentrons 앱을 열고 Opentrons 앱의 프로토콜 탭에 스크립트를 업로드합니다.
      참고: Opentrons 앱은 참조14 에서 로컬 컴퓨터로 다운로드할 수 있습니다. 글을 쓰는 시점에서 Opentrons P50 전자 파이펫은 Opentrons 매장에서 구입할 수 없습니다. 프로토콜에 지정된 볼륨과 호환되는 P20 단일 채널 전자 파이펫으로 대체되었습니다. P50 파이펫을 P20 파이펫으로 대체하기 위해 스크립트에서 메모와 지침이 작성되었습니다. 사용자는 Opentrons API 명령에 따라 특정 파이펫과 이 프로토콜의 호환성을 테스트하고 확인해야 할 수 있습니다.
  2. Opentrons 앱에서 단계별 화면 지침에 따라 로봇 탭에서 로봇 데크 교정 보정 데크를 엽니다.
    참고: 이 단계는 이전에 구현되지 않았거나 로봇이 최근에 배분된 경우에만 필요합니다.
  3. PIPETTES 관리 버튼을 클릭하여 팁 길이 보정을 수행한 다음 파이펫 오프셋 보정을 수행하여 기본 팁과 파이펫 조합 위치를 보정합니다.
    참고: 파이펫을 처음 사용하는 경우 이 단계가 필요합니다.
  4. 파이썬 스크립트에 지정된 OT-2 데크의 해당 위치에 필요한 랩웨어와 파이펫을 놓습니다(그림 2).
    참고: 온도 모듈이 연결되어 전원이 켜지고 알루미늄 블록이 온도 모듈 위에 배치되었는지 확인합니다.
  5. 캘리브레이 탭을 열고 이 파이썬 스크립트에 필요한 랩웨어와 파이펫의 조합에 대한 보정을 수행합니다.
    참고 : Opentrons 응용 프로그램은 동일한 labware 및 파이펫과 미래의 응용 프로그램에 필요하지 않은 교정 매개 변수를 기록합니다.
  6. 100mM 암모늄 중탄산염(ABC)(pH ~8.0) 용액 5mL을 15mL 원문튜브에서 총 5mL의 질량 분광등급 수에서 39.53 mg의 ABC를 용해시킴으로써 준비한다. 15mL + 50mL 튜브 홀더 상단이 있는 4-in-1 튜브 랙의 A1 웰에 암모늄 중탄산염 버퍼를 놓습니다.
  7. 2.0mL 단백질 저결합 튜브에 소 세럼 알부민(BSA) 단백질 1mL를 준비 한다(재료의 표 참조). 샘플을 4-in-1 튜브 랙의 A1 웰에 2mL 튜브 홀더 상단으로 놓습니다.
  8. A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2 등의 우물에 2.0mL 단백질 저결합 튜브를 온도 모듈 위에 알루미늄 블록에 수동으로 배치합니다.
    참고: 로봇 파이펫은 기본적으로 마지막 샘플까지 A1(첫 번째 샘플)부터 수직 순서로 샘플을 분배합니다. 수평 디스펜싱을 지정할 수 있습니다. 자세한 내용은 15 를 참조하십시오. 준비해야 하는 튜브의 총 수는 총 시료 수(즉, 샘플당 기술 복제 수를 곱한 생물학적 샘플 수)와 같아야 합니다.
  9. 질량 분석 등급물에 9.26 mg의 DTT 고형물을 용해하여 총 1mL의 1mL로 60mM DTT의 1mL를 준비한다. 2mL 튜브 홀더 상단이 있는 4-in-1 튜브 랙의 A6 웰에 DTT를 배치합니다.
    주의: DTT는 인간의 눈, 피부 및 호흡기에 해롭습니다. PPE를 착용하고 화학 후드 에서 처리합니다. 적절한 절차를 위해 제조업체의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
  10. 로봇이 적절한 양의 ABC 버퍼를 알루미늄 블록의 샘플 튜브로 전송하는 동안 관찰하십시오.
    참고: 각 튜브의 ABC 및 단백질 믹스의 총 부피는 100 μL이며, ABC 버퍼의 부피는 스크립트에서 계산됩니다(V = 100 μL은 단백질 샘플의 100 μg의 부피를 뺀 값).
  11. 로봇이 ABC 버퍼를 사용하여 각 튜브에 BSA 단백질 100 μg를 전송하도록 합니다.
    참고: 일반적인 실험은 단백질 소화, 즉 이 BSA 샘플에 대해 최대 100μg의 단백질을 사용할 수 있습니다.
  12. 로봇 프로그램이 일시 중지되었는지 수동으로 확인하고 메시지를 표시합니다: 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 4에 있는 2mL 튜브 랙의 A6에 DTT가 로드되었는지 확인합니다. DTT 튜브가 A6에 잘 배치되어 캡을 열어야 합니다. Opentrons 앱의 이력서 버튼을 클릭하여 계속합니다. 로봇이 각 샘플에 DTT 솔루션 10μL을 잘 전송하고 5개의 혼합 라운드를 전달합니다.
  13. 로봇 프로그램이 일시 중지되어 있는지 확인하고 메시지를 표시합니다: 샘플 튜브에서 캡을 닫아야 합니다. 튜브의 캡을 수동으로 닫고 다시 시작 하려면 클릭합니다. 로봇의 온도 모듈이 온도가 55°C에 도달할 때까지 알루미늄 블록을 가열하기 시작하고 5분 배양하여 시료가 55°C까지 도달할 때까지 기다립니다.
    참고: 로봇은 인큐베이션 중에 DTT에 의한 단백질 감소를 허용하기 위해 30분 동안 55°C의 온도를 유지합니다.
  14. DTT 인큐베이션 30분 동안 ABC 버퍼에서 34.68 mg의 IAA를 1mL로 용해하여 187.5 mM Iodoacetamide(IAA)의 1mL을 준비한다. IAA 용액을 알루미늄 호일로 수동으로 감싸빛에 노출되지 않도록 합니다.
    주의: IAA는 심한 눈과 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다. 적절한 PPE를 착용 화학 후드에서 처리합니다.
  15. 30분 DTT 인큐베이션 단계를 완료하면 로봇의 온도 모듈이 식어지 도록 하십시오.
    참고: 모듈의 온도가 22°C에 도달하면 모듈은 5분 동안 온도를 유지하여 샘플을 완전히 식힙니다.
  16. 로봇의 프로그램이 일시 중지될 때 샘플 튜브를 언캡을 풀고 경고 메시지가 표시됩니다: 샘플 튜브에서 캡을 열어야 합니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다.
  17. 수동으로 로봇의 프로그램이 경고 메시지와 함께 일시 중지되었는지 확인: IAA가 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 4에 있는 2mL 튜브 랙의 B6에 로드되었는지 확인합니다. IAA 튜브의 랙 위치를 확인하고 튜브 캡을 엽니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다. 로봇이 IAA 의 10 μL을 각 샘플 튜브로 전송한 다음 5개의 혼합 라운드를 전송해야 합니다.
  18. 로봇의 프로그램이 일시 중지될 때 샘플 튜브를 캡하고 메시지를 표시합니다: 샘플 튜브의 캡을 닫고 호일로 샘플 튜브를 덮습니다. 깨끗한 호일로 알루미늄 블록 전체를 덮습니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다. 샘플이 22°C에서 30분 동안 배양될 때까지 기다립니다. IAA 인큐베이션이 완료되면 로봇의 온도 모듈이 비활성화되는지 확인합니다.
  19. 0.2 μg/μL의 최종 농도에서 IAA 인큐베이션(Step 2.19) 동안 트립신 용액의 혼합물을 준비: MS 급 수의 100 μL에서 질량 분석법/시퀀싱 급 트립신 20 μg를 용해하십시오.
  20. 로봇의 프로그램이 일시 중지될 때 튜브 캡이 열리는 2mL 튜브 랙의 C6 웰에 트립신 솔루션을 배치하고 경고 메시지가 표시합니다: 트립신이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2mL 튜브 랙의 C6에 로드되었는지 확인합니다. 계속하려면 다시 시작하려면 클릭합니다.
  21. 로봇의 프로그램이 일시 중지되어 경고 메시지가 표시되는지 확인합니다: 온도 모듈의 샘플 튜브에 캡을 엽니다. 샘플 튜브의 캡을 풀고 다시 시작 하려면 계속 합니다. 로봇이 각 샘플 튜브에 트립신 10 μL을 전송하는 동안 대기하고 다섯 개의 혼합 라운드가 있습니다.
  22. 샘플 튜브 캡을 파라핀 필름으로 감싸고, 모든 샘플을 온도 제어 믹서로 옮기고, 37°C에서 600 rpm 흔들림으로 16-20h로 배양합니다.
    참고: 트립신 소화는 또한 37°C에서 온도 모듈에서 직접 수행될 수 있다.

3. SP3 파라자성 구슬을 사용하여 펩타이드 청소

  1. 하룻밤 트립신 소화 후 다음 날, 벤치탑 미세 원심 분리기 (≤2,000 x g)를 사용하여 샘플을 잠시 회전하고 자기 튜브 랙에 샘플을 배치합니다. 샘플을 2 분 동안 방치하십시오.
    1. 파이펫으로 상체를 새로운 단백질 저결합 마이크로센심분리기 튜브로 조심스럽게 전달합니다. 샘플을 냉장고에 보관하고 3.2-3.9 단계로 진행하십시오.
      참고: 장기 보관을 위해 샘플을 -80°C에 저장합니다.
  2. 텍스트 편집기에서 SP3_peptide_cleanup.py Python 스크립트를 열고 사용자 지정 여기 만 섹션에서 필요에 따라 지정합니다.
    참고: 실험별 변수에는 시료 및 복제수, 전송되는 펩타이드의 부피, 시약의 부피(구슬, 아세토나이트, DMSO), P20/P50 및 P300 파이펫의 시작 팁, 자기 모듈의 딥웰 플레이트에서 잘 시작하는 것이 포함됩니다. 각 BSA 다이제스트 샘플에는 약 120μL의 소화부피가 포함되어 있으며, 이는 각 복제에 55μL로 두 개의 기술적 복제물로 알리인용됩니다. 다이제스트의 절반을 정리하려면 복제 번호 변수를 1로 변경합니다.
  3. Opentrons 앱의 프로토콜 탭에 스크립트를 업로드합니다.
  4. 파이썬 스크립트에 지정된 OT-2 데크의 해당 위치에 필요한 랩웨어와 파이펫을 놓습니다(그림 3). 자기 모듈이 켜져 있고 로봇에 연결되어 있는지 확인합니다. 마그네틱 모듈 상단에 새로운 2mL 96 웰 딥 웰 플레이트( 재료 표 참조)를 놓습니다.
  5. 캘리미터 탭을 열고 이 파이썬 스크립트에 필요한 랩웨어와 파이펫의 조합에 대한 보정을 수행합니다.
    참고: 동일한 labware 및 파이펫 조합에 대한 교정은 한 번만 수행되어야 하며 Opentrons 앱은 교정 매개 변수를 기록합니다.
  6. 소화된 샘플(3.1단계에서 수집된 수퍼네티트)을 2.0mL 튜브 랙에 수직 순서로 A1, B1....
  7. 50mL 원문 튜브에 LC-MS/MS 호환 아세토닐릴 15mL을 준비하고 15mL + 50mL 튜브 홀더 상단이 있는 4-in-1 튜브 랙에 튜브를 웰 A3에 배치합니다.
  8. 15mL 원문관에 4.9mL 질량 분광법 급 수의 100 μL DMSO를 추가하여 2% DMSO의 5mL를 준비하십시오. 튜브를 15mL + 50mL 튜브 랙에 우물 A1에 놓습니다.
  9. 빈 50mL 원추형 튜브를 폐기물로 라벨로 지정하고 15mL + 50mL 튜브 랙의 웰 B3에 놓습니다.
  10. 참조16 다음에 SP3 구슬을 준비합니다.
    1. 2.0 mL 마이크로센심분리기 튜브에 적절한 양의 혼합 구슬을 준비합니다.
      참고: 각 펩타이드 정화 반응은 혼합 구슬의 10 μL이 필요합니다. 예를 들어 4개의 정화 반응을 위해 최소 40μL의 혼합 구슬을 준비하십시오.
    2. 비드 혼합물이 자기 스탠드에 2 분 동안 앉게하십시오. 피펫으로 상체를 조심스럽게 제거하고 파이펫으로 상체의 부피를 측정합니다.
    3. 구슬의 나머지 부피를 계산하고 질량 분광등급의 물(예: 구슬의 20μL에 100-200 μL 물) 및 10s의 소용돌이(속도 10)를 5-10배 추가합니다. 마그네틱 스탠드에 구슬을 2분 동안 앉습니다.
    4. 총 세정제를 위해 물 세척 단계를 반복합니다.
    5. MS 급 수의 최종 구슬을 50 μg/μL의 최종 농도로 재차 놓습니다.
      참고: 구슬은 10 μg/μL16 의 농도로 다시 중단하는 것이 좋습니다. 현재 최적화 노력에서, 최종 농도는 비드 펩타이드-아세토닐릴 혼합물의 총 부피를 최소화하기 위해 50 μg/μL로 수정되었다.
  11. 로봇이 소화된 시료의 55μL을 자기 모듈의 깊은 우물의 우물로 전송하도록 합니다.
  12. 로봇 프로토콜이 일시 중지되어 메시지를 표시했는지 확인: 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 4에 있는 2mL 튜브 랙의 A6에 준비된 구슬이 로드되었는지 확인합니다. 구슬을 소용돌이, 다음 잠시 아래로 회전 5 미니 벤치 탑 원심 분리기에 모자와 함께 2 mL 튜브 랙의 A6 우물에 구슬을 배치. 로봇이 구슬을 5라운드 동안 10번 혼합하는 동안 위아래로 파이프를 섞어 대기하십시오.
    참고: 로봇은 10μL의 구슬을 깊은 음질 플레이트의 각 소화된 샘플로 옮기고 5번 혼합합니다.
  13. 로봇이 각 우물에 아세토닐릴의 1,292 μL을 전송하고 즉시 펩티드와 구슬 바인딩을 용이하게하기 위해 위아래로 파이프하여 10 번 혼합해야합니다.
    참고: P300 파이펫은 한 번에 최대 300μL까지만 전송할 수 있기 때문에 각 전송은 여러 라운드에서 완료됩니다.
  14. 로봇이 깊은 접시에서 위아래로 파이프를 사용하여 모든 샘플을 5번 혼합하도록 하십시오.
  15. 마그네틱 모듈이 관여하고 샘플이 모듈에서 2분 동안 배양될 때까지 기다립니다.
  16. 파이펫팅 포부 및 디스펜스 속도가 150 μL/s의 기본값에서 25 μL/s로 느려지는 동안 대기하십시오.
    참고: 로봇은 각 우물에서 상체를 천천히 제거하고 마그네틱 모듈이 관여하는 동안 폐기물 튜브에 폐기합니다.
  17. 파이펫팅 포부및 디스펜스 속도가 기본 설정으로 반환될 때까지 기다립니다. 자기 모듈이 분리되는 것을 관찰합니다.
  18. 로봇의 프로그램이 일시 중지되었는지 확인하고 메시지가 표시됩니다: ACN 튜브 캡이 꺼져 있는지 확인합니다. 아세토닐레 튜브를 수동으로 풀고 튜브 랙에 다시 놓습니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다. 로봇이 1mL의 아세토나이트를 전송하여 각 샘플을 세척하고 즉시 10번 혼합되도록 합니다.
  19. 로봇이 모든 샘플을 10회 혼합하여 샘플을 세척하도록 합니다.
  20. 자기 모듈이 종사하는 동안 대기하고 2 분 동안 샘플을 배양합니다.
  21. 로봇이 파이프팅 포부 속도를 변경하여 체퍼를 천천히 제거하고 폐기물 튜브에 분배할 때까지 기다립니다.
  22. 로봇이 60s의 마그네틱 모듈의 샘플을 배양하여 잔류 아세토니얼이 증발할 수 있도록 관찰한 다음 파이펫팅 포부 속도를 기본값으로 변경합니다. 자기 모듈이 분리되는 것을 관찰합니다.
  23. 로봇의 프로그램이 일시 중지되었는지 확인하고 메시지가 표시됩니다: 소용돌이 DMSO를 다시 열고 캡을 엽니다. 수동으로 10 s에 대한 2 % DMSO를 소용돌이하고 15 mL-50 mL 튜브 랙에 잘 A1에 다시 배치합니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다.
  24. 로봇이 2% DMSO의 80 μL을 각 우물로 전송하고 즉시 10번 혼합되도록 합니다.
  25. 로봇이 모든 샘플을 10회 혼합하여 추가로 5라운드를 혼합해야 합니다.
  26. 자기 모듈이 종사하는 동안 대기하고 2 분 동안 샘플을 배양합니다.
  27. 로봇이 파이펫 포부 속도를 느리게(25 μL/s)로 변경하고 상체를 천천히 전달하여 깊은 우물의 빈 우물로 천천히 전송하는 동안 관찰하십시오.
  28. 로봇이 자기 모듈에 샘플을 배양하여 2분 동안 샘플을 큐베이션할 때까지 기다립니다.
  29. 로봇의 프로그램이 일시 중지되어 메시지를 표시했는지 확인: 2mL 튜브 랙에 새로운 2mL 튜브를 배치하고 튜브 수가 총 샘플 수와 일치하는지 확인합니다.
  30. 최종 BSA 다이제스트 샘플 직후에 처음 2mL 마이크로센심분리기 튜브를 잘 배치합니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다.
    참고: 예를 들어, 이 프로토콜에서 테스트된 6개의 BSA 다이제스트 샘플은 우물 A1, B1, C1, D1, A2 및 B2에 있습니다. 따라서, 2.0 mL 튜브의 새로운 세트는 우물 B3, C3, D3, 에 배치됩니다 ... 등등.
  31. 로봇이 깊은 우물의 우물에서 2.0 mL 튜브의 새로운 세트로 샘플88 μL을 전송하는 동안 관찰하십시오.
    참고: 프로토콜의 전송된 부피(1.1 x 80 μL)는 샘플의 전체 부피가 파이펫 팁으로 흡류되도록 최적화됩니다.
  32. 로봇이 파이펫 포부 속도를 기본값으로 변경하고 자기 모듈을 분리하는 동안 대기하십시오.
  33. 진공 증발기( 재료 표 참조)에서 세척된 펩티드를 수동으로 건조시키고 5항으로 진행하거나 건조시 를 -20°C로 저장한다.

4. SP3 파라자성 구슬이 있는 인간 심장(5 mg/mL)의 단백질 용해로 MS 샘플 준비

  1. SP3_digestion.py 파이썬 스크립트를 열고 사용자 지정 여기만 지정 섹션에서 변수값을 지정합니다.
    참고: 변수에는 시료 및 복제, 샘플 농도, 시약의 부피(DTT, IAA, 트립신, 구슬, 100% 및 80% 에탄올), DTT 및 IAA 인큐베이션 시간, 파이펫 P20/P50 및 P300에 대한 시작 팁, 자기 에 의 한 깊은 플레이트에서 잘 시작.
  2. DTT 및 IAA 인큐베이션을 위한 단일 단백질 소 세럼 알부민을 사용하여 MS 샘플 준비를 위해 2.2-2.23항에 2.2-23단계를 수행하십시오. 해당 단계의 로봇 데크 설정에 대한 그림 1 을 참조하십시오.
  3. DTT 및 IAA 인큐베이션 단계(단계 2.15 및 2.19)에서 단백질 정화(3.10단계에서 지정)를 위한 신선한 SP3 구슬 믹스(정리 반응당 20 μL 비드)를 준비한다. 2mL 튜브 랙에 구슬을 D6에 잘 놓습니다.
  4. 로봇의 프로그램이 일시 중지되었는지 확인합니다: 오픈 튜브 캡. 온도 모듈 위에 있는 알루미늄 블록의 샘플 튜브를 수동으로 풀고 Resume 를 클릭하여 계속합니다.
  5. 로봇이 모든 샘플을 2.0mL 튜브에서 자기 모듈 위에 있는 새로운 심층 플레이트로 전송하도록 합니다.
  6. 로봇의 프로그램이 일시 중지되어 메시지를 표시하는지 확인합니다: 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 4에 있는 2mL 튜브 랙의 D6에 준비된 구슬이 로드되었는지 확인합니다. 구슬 튜브 캡을 열고 다시 시작 하려면 클릭합니다.
  7. 로봇이 구슬을 5라운드, 시료 비드 혼합물의 5라운드혼합으로 깊은 우물판에 각각 20μL의 구슬을 옮기는 동안 관찰한다.
  8. 로봇의 프로그램이 일시 중지되어 메시지를 표시하는지 확인합니다: 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 5에 있는 15mL-50 mL 튜브 랙의 A3에 100% 에탄올이 로드되었는지 확인합니다. 50mL 원문 튜브에 10-20 mL의 100% 에탄올(즉, 200 개의 증거 에탄올, 재료 표 참조)을 50 mL 원문 튜브에 준비하고 랙의 A3 웰에 놓습니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다.
  9. 로봇이 100% 에탄올의 140 μL을 플레이트의 각 우물로 옮기고 10라운드의 혼합을 통해 구슬에 펩티드의 결합을 용이하게 합니다.
  10. 로봇이 각 샘플을 10회 위아래로 파이프로 혼합하여 총 5라운드의 믹싱을 할 수 있도록 합니다.
  11. 자기 모듈이 종사하는 동안 대기하고 모듈의 샘플을 2 분 동안 배양합니다.
  12. 로봇이 파이프팅 속도를 느리게(25 μL/s)로 변경하고 각 우물에서 슈퍼네티를 흡인하여 폐기물 튜브에 분배하는 동안 관찰합니다.
  13. 로봇이 파이펫팅 속도를 다시 기본값으로 변경하고 자기 모듈을 분리할 때까지 기다립니다.
  14. 로봇의 프로그램이 일시 중지되어 메시지를 표시하는지 확인합니다: 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 5에 있는 15mL-50 mL 튜브 랙의 A4에 80%의 에탄올이 로드되었는지 확인합니다. MS급 물 4mL과 100% 에탄올(즉, 200 증거)을 혼합하여 80% 에탄올20mL를 수동으로 준비한다. 튜브 랙에 A4에 80% 에탄올을 잘 놓습니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다. 로봇이 각 우물에 80 % 에탄올의 1 mL을 전송하고 즉시 10 번 혼합있는지 확인합니다.
  15. 로봇이 파이프팅 속도를 느리게(25 μL/s)로 변경하는 동안 관찰하고, 각 우물에서 슈퍼네티를 흡인하고, 폐기물 튜브로 분배합니다. 로봇이 파이펫팅 속도를 다시 기본값으로 변경하고 자기 모듈을 분리할 때까지 기다립니다.
  16. 로봇의 프로그램이 일시 중지될 때 ABC 솔루션의 캡을 열고 ABC 튜브에서 캡을 엽니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다. 로봇이 자기 모듈을 분리하고 ABC의 250 μL을 각 우물로 옮기고 즉시 10 번 혼합하는 동안 대기하십시오.
    참고: 이 단계는 ABC로 샘플을 세척하는 것입니다.
  17. 로봇이 자기 모듈을 참여하고 모듈의 샘플을 2분 동안 배양하도록 하십시오.
  18. 로봇이 파이프팅 속도를 느리게(25 μL/s)로 변경하고 상체를 각 우물에서 폐기물 튜브로 전송하는 동안 관찰하십시오. 로봇이 ABC 버퍼 100 μL을 각 우물로 전송하고 즉시 10 번 혼합 될 때까지 기다립니다.
  19. 로봇의 프로그램이 일시 중지되었는지 확인하고 메시지를 표시합니다: 프로토콜을 다시 시작하기 전에 2.0mL 알루미늄 블록에 새로운 수집 튜브가 배치되었는지 확인합니다. 마지막 샘플 튜브 직후 알루미늄 블록에 저단백질 보존 마이크로센심분리기 튜브를 새로운 세트를 배치합니다. 계속하려면 다시 시작 하려면 클릭합니다. 로봇이 ABC 버퍼의 각 샘플을 새로운 2.0 mL 튜브로 전송하는 동안 대기하십시오.
    참고: 우물을 검사하고 필요한 경우 잔여 샘플을 튜브로 수동으로 전송합니다.
  20. 로봇의 프로그램이 일시 중지될 때 MS 급 식 트립신 20 μg를 0.2 μg/μL의 최종 농도로 용해하여 적절한 양의 MS 급 트립신(샘플당 10 μL)을 준비하여 메시지를 표시합니다: 트립신(0.2 μg/μL)이 2mL 의 C6에 적재되었는지 확인하십시오. 로봇이 트립신 10μL을 각 샘플 튜브로 전송하고 5차례의 혼합을 수행하도록 합니다.
  21. 샘플 튜브 캡을 파라핀 필름으로 감싸고, 모든 샘플을 온도 제어 믹서로 옮기고, 37°C에서 1,000rpm 흔들림으로 16-20h로 배양한다.
    참고: 1,000rpm 흔들림으로 소화를 수행하면 하룻밤 동안 구슬의 강수량을 최소화하는 것이 좋습니다.

5. SP3 파라자성 구슬을 사용하여 펩타이드 청소

  1. SP3 파라자성 구슬을 사용하여 단계별 지침을 2단계, 펩타이드 청소에 따르십시오.

6. 액체 크로마토그래피 및 질량 분석

  1. MS 물에 1mL LC-MS 등급 99%의 포름산을 1L의 총 부피에 추가하여 BSA(2-3단계) 및 심장 용액(Step 4) 펩타이드를 0.1% 포름산으로 재차축한다.
    주의: 포믹산은 강한 산입니다. 눈, 피부 및 호흡기에 매우 부식성이 있습니다. PPE를 착용 하는 화학 후드 에서 주의 하 고 핸들.
  2. 정량적 펩티드 분석 키트17 을 사용하여 소화 후 펩티드 농도를 정량화하고 LC-MS/MS 분석을 위해 BSA 다이제스트의 0.5 μg및 1.5 μg의 심장 다이제스트를 주입한다.
  3. LC-MS/MS 분석을 위한 액체 크로마토그래피 프로그램을 설정합니다.
    참고: 일반적인 설정에서 펩타이드 다이제스트는 보충 파일 2에 제공된 매개 변수를 사용하여 반전 단계 C18 컬럼(3 μm 입자; 100 Å 모공; 75 μm x 150mm; 재료 표 참조)에 로드될 수 있다.
  4. 보충 파일 3에 제공된 매개 변수를 사용하여 질량 분광계(재료 표 참조)를 사용하여 산탄총 프로테오믹스 데이터를 획득합니다.
  5. 단백질 식별을 위해 단백질 데이터베이스를 검색합니다.
    1. 다운로드 하고 필요한 소프트웨어, 맥스 콴트를 설치합니다.
      참고: MaxQuant 소프트웨어(v.1.6.10.43)는 다음 단계( 재료 표 참조)에 사용되었습니다.
    2. 고품질 단백질 서열 데이터베이스(UniProt/SwissProt)에서 선별된 인간 프로테오메 데이터베이스를 다운로드 하세요(재료표 참조). 다운로드 버튼을 클릭하고 FASTA(표준)를 선택합니다.
      참고: 선택적으로, FASTA(비정식)를 다운로드하여 원하는 경우 데이터베이스에 각 유전자의 단백질 동소형을 포함합니다.
    3. MaxQuant 소프트웨어 인터페이스에서 글로벌 매개 변수 패널로 이동하여 단백질 데이터베이스로 사용할 FASTA 파일을 지정하고 시퀀스 탭을 클릭합니다. 그런 다음 추가 버튼을 클릭하여 FASTA 파일에 대한 파일 경로를 지정합니다.
    4. MaxQuant 소프트웨어 인터페이스에서 원시 데이터 패널로 이동하여 로드 버튼을 클릭하여 분석할 획득된 원시 질량 스펙트럼 파일을 지정하고 원시 파일을 선택합니다.
    5. 표 1에 표시된 대로 검색 매개 변수를 설정합니다. 필요한 경우 라벨없는 정량화(LFQ)를 활성화합니다.
    6. 검색이 완료될 때까지 기다렸다가 MSMS의 FDR 1% 임계값.txt을 통과하는 펩티드 스펙트럼 일치(PSM) 수를 /결합/txt 폴더에서 찾습니다.
      참고: 대표적인 결과 섹션에 대해 여기에서 수행된 비교에서, 여러 단백질에 매핑된 PSM은 필터링되었고, 하나의 독특한 단백질에 매핑된 PSM은 PSM, 펩티드 및 단백질의 수를 계산하기 위해 유지되었다(도 4 및 도 5).

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결과

3개의 파이썬 스크립트는 OT-2 로봇과 호환되며, 단일 단백질 표준 소 혈청 알부민(기술적으로 복제n = 5 소화)과 세제 함유 인간 심장 리자테 샘플(n= 5 소화)을 사용하여 질량 분광법 프로테오믹스에 대한 샘플 준비를 수행하는 여기에 제공됩니다. 각 다이제스트 제품은 두 개의 펩타이드 정리 반응으로 분할됩니다. BSA 및 심장 샘플의 각 실행에서 확인된 펩티드 스펙트럼 일치(PSM), 펩티드 및 단백질의 수는 도 4 및 도 5로 도시된다. 728PSM과 65펩타이드의 중앙값은 BSA 샘플로 확인되었으며, 각각 5.2%와 3.2%의 변이 계수(CV)가 확인되었다. 복잡한 심장 시료로 9,526PSM, 7,558펩타이드 및 1,336개의 단백질의 중앙값이 7.6%, 5.9%, 변이계 3.6%로 10런중에서 확인되었다. 총 1,935개의 단백질이 심장 샘플의 10개의 실행에서 확인되었으며, 그 중 1,677개의 단백질이 ...

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토론

프로토콜 내의 중요한 단계
최상의 성능을 위해 OT-2와 호환되는 Opentrons 검증 된 labware, 모듈 및 소모품을 사용해야합니다. 사용자 지정 랩웨어는 Reference14에서 Opentrons의 지시에 따라 만들 수 있습니다. 처음으로 사용할 때 OT-2 데크, 파이펫 및 랩웨어를 교정해야 합니다. 또한 펩티드와 단백질 정화를 위한 구슬을 준비하기 위해 SP3 구슬 제조업체의 지침을 따르는 것도 중요합니다. 특히, 비드 및 펩타이드 결합 반응 동안, 결합 반응의 아세토니톨의 부피는 ≥95%여야하며, 비드 농도는 ≥0.1 μg/μL이어야 한다. 여기서 펩티드 클린업 스크립트에서 최적화된 파라미터를 사용하면 아세토닐트릴 부피 비율은 95%, 비드 농도는 0.37 μg/μL이며 펩타이드 농도는 14-37 μg/mL 범위에 있습니다. 펩티드 질량은 우리의 경험에서 소화 반응의 100 μL에서 40-100 μg로 추정된다. SP3 단백질 정화의 ...

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공개 사항

저자는 선언할 충돌이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH 상 F32-HL149191YH에 의해 부분적으로 지원되었다; R00-HL144829 - EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 - MPL. 도 1, 도 2, 도 3 은 웹 기반 과학 일러스트 도구인 BioRender.com 사용하여 만들어집니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
300 &마이크로; L 피펫 팁Opentrons
4-in-1 튜브 랙 세트Opentrons각 세트에는 2개의 베이스 스탠드와 4개의 튜브 홀더 상단(1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL 및 50mL)이 포함되어 있습니다. 이 연구에서는 2mL 및 15mL + 50mL 탑스를 사용합니다.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼Thermo Scientific#1645683 μ m 입자; 100 &어링; 기공; 75 &뮤; m x 150 mm
아세토니트릴 LC-MS 등급VWR#JT9829
알루미늄 블록 세트Opentrons이 블록 세트에는 96-well, 2.0 mL 튜브 및 OT-2 온도 모듈과 함께 사용할 수 있는 PCR 스트립과 호환되는 3개의 탑이 포함되어 있습니다. 이 원고에서는 2.0mL 튜브 홀더를 사용합니다.
암모늄 바이카보네이Sigma-Aldrich# A6141
소 혈청 알부민 표준, 2mg/mLThermo Scientific#23210
디메틸설폭사이드(DMSO) LC-MS 등급Thermo Scientific#85190
디티오트레이톨시그마-알드리치#D5545
EASY-Spray HPLC 컬럼Thermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Ethanol Proof 195-200Fisher#04-355-720
Formic Acid LC-MS gradeThermo Scientific#85178
Human heart lysateNovus BiologicalsNB820-59217
IodoacetamideSigma-Aldrich#I1149
Magnetic tube rackThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 미니 원심분리기Thermo Scientific#75004061빠른 회전을 위한 벤치탑 미니 원심분리기
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V BottomOpentrons
OT-2 마그네틱 모듈OpentronsGEN1
OT-2, P300 단일 채널 피펫Opentrons,GEN1
OT-2, P50, 단일 채널 피펫Opentrons,GEN1
OT-2 로봇 피펫팅 로봇, Opentrons,OT-2
OT-2 온도 모듈Opentrons,GEN1
Pierce, 정량 비색 펩타이드 분석Thermo Scientific#23275
Protein LoBind tubes 2.0 mLEppendorf#022431102
Protein Sequence DatabaseUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20검토됨:yes
Sera-Mag SpeedBead 카르복실레이트 변형 자성 입자, 소수성Cytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead 카르복실레이트 변형 자성 입자, HydrophylicCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo Scientific진공 증발기
Thermo Q Exactive HF 질량 분석기Thermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsin MS 등급Thermo Scientific#90057
Water LC-MS 등급VWR#BDH83645.400
트 , , , , , , ,

참고문헌

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