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오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화 된 산탄총 프로테오믹스 샘플 처리

DOI:

10.3791/63092

⸱

October 28th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

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상세한 프로토콜과 3개의 Python 스크립트는 광원 로봇 액체 처리 시스템을 운영하여 세제 제거, 단백질 소화 및 펩타이드 탈염 단계를 포함하는 대량 분광 실험에 대한 반자동 단백질 샘플 준비를 수행하기 위해 제공됩니다.

Abstract

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질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스 실험은 효소 단백질 소화 및 정리를 포함한 여러 샘플 준비 단계가 필요하며, 이는 상당한 시간의 벤치 노동을 수용하고 배치 대 배치 가변성의 원천을 제시할 수 있습니다. 파이펫팅 로봇을 통한 실험실 자동화는 수동 작업을 줄이고, 처리량을 최대화하며, 연구 재현성을 높일 수 있습니다. 여전히, 표준 자동화 스테이션의 가파른 시작 가격은 많은 학술 실험실에 대한 저렴한 합니다. 이 문서에서는 반자동 단백질 감소, 알킬레이션, 소화 및 정화 단계를 설정하는 지침을 포함하여 저렴한 오픈 소스 자동화 시스템(Opentrons OT-2)을 사용하여 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우에 대해 설명합니다. 뿐만 아니라 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 통해 OT-2 시스템을 프로그래밍하는 오픈 소스 파이썬 스크립트를 동반.

Introduction

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질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스는 생물학적 시료에 많은 단백질의 풍부를 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 생물 정보학 분석을 사용한 프로테오믹스 실험은 일상적으로 생체 마커를 식별하고 병리학 적 메커니즘을 뒷받침하는 관련 생물학적 복합체 및 경로를 발견하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 높은 분석 특이성 및 잠재적 정량적 정확도를 갖춘 산탄총 프로테오믹스는 항체에 의존할 필요 없이 임상 샘플 분석을 위한 연구 시설 및 진단 실험실에서 채택될 수 있는 우수한 잠재력을 가지고 있습니다1,2.

산탄총 프로테오믹스 분석을 위한 단백질 샘플을 준비하려면 생물학적 샘플(예: 세포 및 조직)에서 추출한 단백질은 일반적으로 시료 단백질 농도, 단백질 감소 및 알킬레이션 측정, 펩타이드로효소 소화 를 측정하는 것을 포함하여 긴 프로토콜을 사용하여 처리되어야 합니다. 더욱이, 세제를 함유하는 일반적인 용해 완충제에서 추출된 단백질은 종종 세제가 트립신 소화를 방해하고 다운스트림 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석3의 성능을 현저히 저하시킬 수 있기 때문에 분석 전에 완충교환 또는 세제....

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Protocol

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개발 된 파이썬 스크립트는 GitHub에 입금되었습니다 : https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. 스크립트의 복사본은 보충 파일 1에 제공됩니다. 최신 버전의 GitHub 리포지토리를 참조하십시오.

1. 실험 적 준비

  1. 프로토콜을 시작하기 전에 필요한 하드웨어를 확인합니다.
    참고: OT-2 파이펫, 파이펫 팁, 4-in-1 튜브 랙 세트, 알루미늄 블록 세트, 자기 모듈, 온도 모듈, 96웰 2mL 딥 웰 플레이트( 재료 표 참조)의 하드웨어 구성 요소가 필요합니다.

2. 단일 단백질 소 소 세럼 알부민 (BSA)을 사용하여 질량 분석법 (MS) 샘플 준비

  1. 텍스트 편집기에서 NoSP3_digestion.py 스크립트를 열고 사용자 지정 여기 만 섹션에서 필요에 따라 실험별 변수를 지정합니다.
    참고: 실험별 변수에는 샘플 및 복제 수가 포함됩니다. 샘플 농도; 시약 디티오스리톨의 부피 - DTT, 요오도아세타미드 - IA....

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Results

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3개의 파이썬 스크립트는 OT-2 로봇과 호환되며, 단일 단백질 표준 소 혈청 알부민(기술적으로 복제n = 5 소화)과 세제 함유 인간 심장 리자테 샘플(n= 5 소화)을 사용하여 질량 분광법 프로테오믹스에 대한 샘플 준비를 수행하는 여기에 제공됩니다. 각 다이제스트 제품은 두 개의 펩타이드 정리 반응으로 분할됩니다. BSA 및 심장 샘플의 각 실행에서 확인된 펩티드 스펙트럼 일치(PSM), 펩티드 및 단백질의 수는 도 4 및 도 5로 도시된다. 728PSM과 65펩타이드의 중앙값은 BSA 샘플로 확인되었으며, 각각 5.2%와 3.2%의 변이 계수(CV)가 확인되었다. 복잡한 심장 시료로 9,526PSM, 7,558펩타이드 및 1,336개의 단백질의 중앙값이 7.6%, 5.9%, 변이계 3.6%로 10런중에서 확인되었다. 총 1,935개의 단백질이 심장 샘플의 10개의 실행에서 확인되었으며, 그 중 1,677개의 단백질이 .......

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Discussion

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프로토콜 내의 중요한 단계
최상의 성능을 위해 OT-2와 호환되는 Opentrons 검증 된 labware, 모듈 및 소모품을 사용해야합니다. 사용자 지정 랩웨어는 Reference14에서 Opentrons의 지시에 따라 만들 수 있습니다. 처음으로 사용할 때 OT-2 데크, 파이펫 및 랩웨어를 교정해야 합니다. 또한 펩티드와 단백질 정화를 위한 구슬을 준비하기 위해 SP3 구슬 제조업체의 지침을 따르는 것도 중요합니다. 특히, 비드 및 펩타이드 결합 반응 동안, 결합 반응의 아세토니톨의 부피는 ≥95%여야하며, 비드 농도는 ≥0.1 μg/μL이어야 한다. 여기서 펩티드 클린업 스크립트에서 최적화된 파라미터를 사용하면 아세토닐트릴 부피 비율은 95%, 비드 농도는 0.37 μg/μL이며 펩타이드 농도는 14-37 μg/mL 범위에 있습니다. 펩티드 질량은 우리의 경험에서 소화 반응의 100 μL에서 40-100 μg로 추정된다. SP3 단백질 정화의 .......

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Disclosures

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저자는 선언할 충돌이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 NIH 상 F32-HL149191YH에 의해 부분적으로 지원되었다; R00-HL144829 - EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 - MPL. 도 1, 도 2, 도 3 은 웹 기반 과학 일러스트 도구인 BioRender.com 사용하여 만들어집니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 &마이크로; L 피펫 팁Opentrons
4-in-1 튜브 랙 세트Opentrons각 세트에는 2개의 베이스 스탠드와 4개의 튜브 홀더 상단(1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL 및 50mL)이 포함되어 있습니다. 이 연구에서는 2mL 및 15mL + 50mL 탑스를 사용합니다.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼Thermo Scientific#1645683 μ m 입자; 100 &어링; 기공; 75 &뮤; m x 150 mm
아세토니트릴 LC-MS 등급VWR#JT9829
알루미늄 블록 세트Opentrons이 블록 세트에는 96-well, 2.0 mL 튜브 및 OT-2 온도 모듈과 함께 사용할 수 있는 PCR 스트립과 호환되는 3개의 탑이 포함되어 있습니다. 이 원고에서는 2.0mL 튜브 홀더를 사용합니다.
암모늄 바이카보네이Sigma-Aldrich# A6141
소 혈청 알부민 표준, 2mg/mLThermo Scientific#23210
디메틸설폭사이드(DMSO) LC-MS 등급Thermo Scientific#85190
디티오트레이톨시그마-알드리치#D5545
EASY-Spray HPLC 컬럼Thermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
Ethanol Proof 195-200Fisher#04-355-720
Formic Acid LC-MS gradeThermo Scientific#85178
Human heart lysateNovus BiologicalsNB820-59217
IodoacetamideSigma-Aldrich#I1149
Magnetic tube rackThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 미니 원심분리기Thermo Scientific#75004061빠른 회전을 위한 벤치탑 미니 원심분리기
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V BottomOpentrons
OT-2 마그네틱 모듈OpentronsGEN1
OT-2, P300 단일 채널 피펫Opentrons,GEN1
OT-2, P50, 단일 채널 피펫Opentrons,GEN1
OT-2 로봇 피펫팅 로봇, Opentrons,OT-2
OT-2 온도 모듈Opentrons,GEN1
Pierce, 정량 비색 펩타이드 분석Thermo Scientific#23275
Protein LoBind tubes 2.0 mLEppendorf#022431102
Protein Sequence DatabaseUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20검토됨:yes
Sera-Mag SpeedBead 카르복실레이트 변형 자성 입자, 소수성Cytiva#65152105050250
Sera-Mag SpeedBead 카르복실레이트 변형 자성 입자, HydrophylicCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo Scientific진공 증발기
Thermo Q Exactive HF 질량 분석기Thermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsin MS 등급Thermo Scientific#90057
Water LC-MS 등급VWR#BDH83645.400
트 , , , , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
  2. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue anal....

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