Method Article

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

DOI:

10.3791/63097

⸱

September 15th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 자기 조직에 의하여 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 발달적으로 관련있는 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 만드는 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 발달 단서의 순차적 활성화에 의존하고 매우 복잡하고 기능적으로 관련된 인간 심장 조직을 생성합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

건강과 질병에서 인간의 심장 발달을 연구하는 능력은 체외에서 인간의 심장의 복잡성을 모델링하는 능력에 의해 매우 제한됩니다. 오르가노이드 및 장기 온 칩과 같은 생체 내 표현형에서 복합체를 모델링할 수 있는 보다 효율적인 장기 와 같은 플랫폼을 개발하면 인간의 심장 발달과 질병을 연구하는 능력이 향상됩니다. 이 논문은 인간 만능 줄기 세포를 사용하여 자기 조직에 의해 매우 복잡한 인간 심장 오르가노이드 (hHOs)를 생성하고 작은 분자 억제제를 사용하여 단계별 발달 경로 활성화를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 배아 체(EB)는 둥근 바닥, 초저 부착 우물이 있는 96웰 플레이트에서 생성되어 개별화된 구조의 현탁액 배양을 용이하게 합니다.

EB는 심장 중피 운명을 유도하기 위한 초기 Wnt 통로 활성화, 결정적인 심장 혈통을 만들기 위한 Wnt 억제의 두 번째 단계, 그리고 미원성 장기 조직을 유도하는 세 번째 Wnt 활성화 단계를 포함하는 3단계 Wnt 신호 변조 전략에 의해 hHOs로 분화를 거칩니다. 96웰 형식으로 수행되는 이 단계는 매우 효율적이고 재현 가능하며 실행당 다량의 오르가노이드를 생성합니다. 3일부터 11일까지 11일째에 면역형광 영상에 의한 분석은 심방 및 심실 심근세포의 영역을 가진 심근 조직뿐만 아니라 내시경 조직으로 늘어선 내부 챔버를 포함하여 15일째에 hHOs 내부의 첫 번째 및 두 번째 심장 장 사양 및 매우 복잡한 조직을 보여줍니다. 오르가노이드는 또한 구조 전반에 걸쳐 복잡한 혈관 네트워크와 상피 조직의 외부 안대기를 나타낸다. 기능적 관점에서 hHSo는 플루오-4 라이브 이미징에 의해 결정된 정상 칼슘 활성을 견고하게 이길 수 있습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 장기 같이 심장 조직에 있는 체외 연구를 위한 단단한 플랫폼을 구성합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

선천성 심장 결함 (CHDs)은 인간에 있는 선천적인 결함의 일반적인 모형이고 모든 살아있는 출생의 대략 1%에 영향을 미칩니다1,2,3. 대부분의 상황에서 CHD의 이유는 아직 알려지지 않았습니다. 발달하는 인간 심장과 밀접하게 유사한 실험실에서 인간 심장 모델을 만드는 능력은 대리 동물 모델보다는 인간에서 CHDs의 근본 원인을 직접 연구하는 중요한 단계를 구성합니다.

실험실에서 자란 조직 모델의 전형은 세포 조성 및 생리 기능에 대한 관심기관과 유사한 오르가노이드, 3D 세포 구조입니다. 오르가노이드는 종종 줄기 세포 또는 전구 세포에서 파생되며 성공적으로 뇌4,5, 신장6,7, 장8,9, lung10,11, liver12,13 및 췌장14,15와 같은 많은 장기를 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. , 그냥 몇 가지 이름을 지정합니다. 최근 연구는 체외에서 심장 발달을 연구하기 위해 자기 조립 심장 오르가노이드를 만드는 타당성을 입증 등장했다. 이러한 모델은 마우스 배아 줄기 세포 (mESC)를 사용하여 초기 심장 발달을 모델링16,17 최대 대상반성 사양18 및 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)를 사용하여 다발성 층 심장 엔데데름 오르노이드19 및 매우 복잡한 세포 구성을 가진 챔버 심장 근막 20을 생성합니다.

이 논문은 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 매우 복잡한 hHOS를 생성하는 새로운 3 단계 WNT 변조 프로토콜을 제공합니다. 오가노이드는 96웰 플레이트에서 생성되어 쉽게 자동화할 수 있는 확장 가능한 고처리량 시스템을 생성합니다. 이 방법은 hPSC 골재를 생성하고 심근 및 심장 중구 형성, 제 1 및 두 번째 심장 필드 사양, 미상동맥 기관 형성 및 대상 동맥 사양을 포함한 심장 발생의 발달 단계를 유발하는 데 의존합니다. 분화 후, hHOs는 심장에서 발견 되는 모든 주요 세포 혈통을 포함, 잘 정의 된 내부 챔버, 심방 및 심실 챔버, 그리고 오르가노이드 에 걸쳐 혈관 네트워크. 이 매우 정교하고 재현 가능한 심장 오르가노이드 시스템은 심장 발달, 질병 및 약리학적 스크리닝의 연구에서 구조적, 기능적, 분자 및 전사 적 분석을 조사할 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hPSC 문화 및 유지 보수

참고: 인간 유도 된 PSC (hiPSCs) 또는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)는 분화 또는 추가 극저온 보존을 위해 EB를 생성하는 데 사용되기 전에 해동 후 적어도 2 개의 연속 된 구절을 배양해야합니다. hPSC는 지하 막 세포 매트릭스 (BM-ECM)-코팅 된 6 웰 배양 판에 PSC 배지 ( 재료의 표 참조)에서 배양된다. 6웰 플레이트에서 hPSC에 대한 중간 변화를 수행할 때, 원치 않는 세포 분리 또는 스트레스를 방지하기 위해 세포 위에 직접 붙이지 않고 우물 의 내부 측면에 직접 배지를 추가합니다. 사용자는 37 °C에서 따뜻하게해서는 안되는 사전 온난화 PSC 미디어를 주의해야합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 PSC 미디어는 열불안정이었습니다.

  1. BM-ECM로 잘 플레이트를 코팅하려면 BM-ECM의 알리쿼트 1개(제조업체의 지침에 따라 -20°C에 저장됨)를 얼음에 해동하고 BM-ECM의 0.5 mg을 12mL의 콜드 덜벡코의 수정된 이글 매체(DMEM)/F12 매체(4°C에 저장)로 혼합한다. DMEM/F12-BM-ECM 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰에 분배하고 37°C에서 적어도 2시간 동안 배양한다.
  2. 세포를 해동하려면 먼저, 소량의 얼음만 보일 때까지 37°C 비드 또는 수조에서 hPSC 극저온을 1-2분 동안 해동한다. 해동된 세포를 원심분리기 튜브로 옮기고 록 억제제, 티아조빈(Thiaz) 및 원심분리기를 5분 × 300g 에 2μM로 보충된 PSC 배지의 8-9mL를 천천히 첨가한다. 상체를 제거하고 티아즈의 2 μM으로 보충된 PSC 배지의 세포 펠릿을 다시 분리한다. 배양 배지내의 세포를 37°C에서 극저온 세포 농도 및 배양에 따라 1-2 웰로 분배하고, PSC 배지를 변경하기 전에 24시간 동안 5% CO2 를 한다.
  3. 세포의 배지를 48시간 간격으로 변경합니다. DMEM/F12(1mL/웰) 및 PSC 배지(2mL/웰)를 사용하여 세서및 중간 변화를 각각 수행합니다.
    참고: 세싱은 세포 폐기물과 이물질을 제거하는 데 도움이 되며 신선한 미디어 변화는 세포에 영양분을 새롭게 공급합니다.
  4. 배지를 달아서 소급(60-80% 컨서블)에 세포를 통과한 다음, 덜벡코의 인산염 완충액 1mL(칼슘 없음, 마그네슘 없음)로 각각 잘 세척합니다. DPBS). DPBS를 흡기하고 hPSC에 대한 해리 시약1mL을 추가합니다( 재료표 참조), 10s 이후 시약의 박막을 제외한 모든 사람의 포부를 포부한다.
  5. 세포 간 간격이 형성될 때까지 hPSC용 해리 시약의 박막으로 2-5분 동안 배양한다.
    참고: 해리를 중지하는 시간은 세포 선에 따라 다릅니다.
  6. 티아즈(PSC 매체+티아즈)의 2μM로 보충된 PSC 배지 1mL을 우물에 넣고 부드럽게 플레이트를 눌러 세포 분리를 유도합니다. 배지에서 분리된 세포를 1-2배 배혈하여 임의의 큰 식민지를 분해하고, PSC 배지+티아즈에서 세포를 1:6 의 음비로 재보종(12mL에서 잘 재장매된 12mL의 세포). BM-ECM 코팅 된 우물에 세포를 다시 플레이트.

2. 3D 자체 조립 인간 심장 오르가노이드의 세대

  1. 배아 체 (EB) 형성:
    참고: 배아 체 형성 전에 관찰 가능한 분화 세포를 제한하는 것이 필수적입니다. 60-80%의 합류로 6웰 플레이트의 2~3개의 우물은 단일 96웰 의 오르가노이드 플레이트에 충분한 세포를 산출합니다. 모든 매체는 EB 또는 오르가노이드에 대한 온도 충격을 최소화하기 위해 중간 변화가 일어나기 전에 37°C 비드 또는 수조에서 알리인용 및 따뜻하게 해야 합니다(이것은 세포 해리 시약을 포함하지 않음). 그림 1A, B를 참조하십시오.
    1. 일 -2
      1. EB를 만들려면- 2일째에 DPBS로 서브 컨셀릭 hPSC(60-80% 컨셀)를 세척하여 세포 잔해를 씻고 DPBS를 흡인시합니다.
      2. 세포를 분리하고 단일 셀 상태로 방출하려면 실온 셀 해리 시약 1mL( 재료 표 참조)을 각 웰에 3-6분 동안 추가합니다. 부드럽게 플레이트를 ~5회 탭하여 현미경으로 검사하는 동안 분리를 유도합니다. 반응을 중지PSC 중간 + 티아즈의 1 mL을 추가합니다.
      3. 세포를 수집하고 남은 골재를 분해하기 위해, 미디어를 2-3배 위아래로 피펫하여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. 단일 셀 서스펜션을 원심분리관으로 옮기고 300 ×g에서 5분 동안 회전 합니다.
      4. 원하는 세포 농도를 얻으려면, 상체를 버리고 PSC 배지+티아즈의 1mL에서 세포를 재보선한다. 세포 카운터 또는 혈류계를 사용하여 세포를 계산하고 PSC 배지+티아즈의 세포를 100,000세포/mL 의 농도로 희석시다.
      5. EB 형성을 위해 세포를 분배하려면 멀티채널 파이펫을 사용하여 라운드 바닥 초저 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL(10,000개의 셀)을 추가합니다. 플레이트를 100 × g 에서 3분 동안 원심분리하고 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 배양합니다.
    2. 일 -1
      1. 각 우물에서 50 μL의 매체를 조심스럽게 제거하고 37°C로 데온 신선한 PSC 배지 200 μL을 추가하여 우물당 250 μL의 최종 부피를 달성합니다. 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 세포를 배양한다.
        참고: 우물 하단의 EB가 방해되지 않도록 우물 측면에 매체를 조심스럽게 제거하고 추가합니다. EB의 섬세한 특성과 서스펜션 배양으로 인해, 심계를 변경할 때 소량의 액체를 각 우물에 두어 EB를 방해하지 않도록 해야 합니다.
  2. 인간 심장 오르가노이드 (hHO) 차별화:
    참고: 모든 미디어는 미디어가 변경되기 전에 37°C 비드 또는 수조에서 데워져야 합니다. 웰 의 바닥에 개발 오르가노이드를 방해하지 않도록 우물의 측면에 배지를 조심스럽게 제거하고 추가합니다. 동요를 최소화하고 억제제와 성장 인자의 점진적 제거를 허용하기 위해 미디어 변화 사이에 는 과세가 필요하지 않습니다. 2% B-27 보충제(재료표)를 가진 RPMI는 분화 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되었다. B-27 보충 명시 하지 않는 한 인슐린을 포함 (일 0-5 일에 인슐린 무료). 그림 1C를 참조하십시오.
    1. 0일차
      1. 중피 혈통을 향한 차별화를 시작하려면, 각 우물에서 166 μL의 배지를 제거하고 (총 우물 부피의 ~ 2/3rd ) 인슐린없는 B-27 보충제를 포함하는 RPMI 1640의 166 μL을 추가, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng / mL 뼈 형태 호르몬 4 (BMP4), 및 1.5 ng / mL 법 49 의 최종 CHIM 에 대한 1.5 ng / mL 1.25 ng/mL BMP4, 및 1 ng/mL 액티빈 A. 37°C에서 24시간, 5% CO2에 대한 인큐베이션.
    2. 1일차
      1. 각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 인슐린이없는 B-27 보충제로 신선한 RPMI 1640의 166 μL을 추가하십시오. 37°C에서 24시간, 5% CO2에 대한 배양.
    3. 2일차
      1. 심장 중피 사양을 유도하기 위해 각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 인슐린이 없는 B-27 보충제를 함유한 RPMI 1640의 166 μL과 3μM Wnt-C59의 최종 웰 농도를 37°C에서 48시간 동안 인큐베이트합니다.
    4. 4일차
      1. 각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 인슐린이없는 B-27 보충제로 신선한 RPMI 1640의 166 μL을 추가하십시오. 37°C에서 48시간, 5% CO2에 대한 배양.
    5. 6일차
      1. 각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 B-27 보충제로 RPMI 1640의 166 μL을 추가합니다. 37°C에서 24시간, 5% CO2에 대한 배양.
    6. 7일차
      1. 미원기 분화를 유도하기 위해 각 우물에서 166 μL의 배지를 제거하고 B-27 보충제를 함유한 신선한 RPMI 1640과 3 μM CHIR99021의 최종 웰 농도2 μM CHIR99021을 추가한다. 37°C에서 1시간, 5% CO2에 대한 인큐베이션을 사용할 수 있습니다.
      2. 각 우물에서 166 μL의 매체를 제거하고 B-27 보충제를 함유한 신선한 RPMI 1640의 166 μL을 추가합니다. 37°C에서 48시간, 5% CO2에 대한 배양.
        참고: 오가노이드가 미디어 변경으로 인해 이동하기 쉽기 때문에 7일째에 두 번째 중간 변경사항에 주의해야 합니다.
      3. 7일째부터 분석 또는 실험을 위한 수집 또는 전송까지 각 우물에서 166 μL의 배지를 제거하고 B-27 보충제를 함유한 166μL의 신선한 RPMI 1640을 추가하여 48시간마다 중간 변화를 수행합니다.
        참고: 오르가노이드는 이전 발달 단계가 관심이 없는 한 15일째에 분석 및 실험을 할 준비가 되어 있습니다. 그들은 장기 문화 또는 성숙 실험을 위해 15 일 전을 배양 할 수 있습니다.

3. 오르가노이드 분석

  1. 전체 오르가노이드 전송(라이브 또는 고정)
    참고: 라이브 오가노이드 전송의 경우 사용되는 파이펫 팁이 멸균되었는지 확인합니다.
    1. 팁 개구부에서 P200 파이펫 팁 5-10mm를 잘라 서 직경이 2~3mm 넓어지게 됩니다.
    2. 파이펫이 완전히 수직(플레이트에 수직)되도록 오르가노이드를 포함하는 둥근 바닥에 팁을 직접 삽입합니다. 팁을 매체에 삽입하기 전에 파이펫 플런저가 이미 모든 방법을 누른지 확인합니다.
    3. 파이펫 플런저를 천천히 방출하여 유기체를 수집하기에 충분한 매체(100-200 μL)를 차지합니다.
    4. 표적 대상으로 배지로 오르가노이드를 전송합니다(예: 고정, 라이브 이미징, 전기생리학 기록, 새로운 플레이트 배양).
  2. 오가노이드 고정
    참고: 96웰 배양판 또는 미세원심분리기 튜브에서 유기노이드를 고정하고 염색할 수 있습니다. 파라포름데히드(PFA)는 연기 후드에서만 처리해야 합니다.
    1. 마이크로센티립후이 튜브의 고정을 위해 라이브 오가노이드를 튜브당 1-8개의 오르가노이드로 분리하여 이송합니다.
      참고: 튜브당 8개의 오르가노이드를 초과하지 마십시오.
    2. 유기체를 건드리지 않고 튜브에서 가능한 한 많은 매체를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오.
    3. 각 튜브 또는 웰에 4% PFA를 추가합니다(마이크로센심분리기 튜브당 300-400 μL, 96웰 플레이트의 웰당 100-200 μL). 실온에서 30-45분 동안 배양하십시오.
      참고: 1h 이상의 잠복기에는 항원 검색 단계가 필요할 수 있으며 권장되지 않습니다.
    4. 유기체를 방해하지 않고 PFA를 안전하게 폐기하십시오. 1.5g/L 글리신(DPBS/Gly)으로 보충된 DPBS로 3개의 세차를 수행하여 4% PFA에 사용되는 동일한 부피를 사용하여 세차 사이에 5분 간 대기합니다. DPBS/Gly를 제거하고 면역 염색 또는 기타 분석을 진행하거나 DPBS를 추가하고 4°C에 저장하여 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다.
      참고: 고정 된 오르가노이드를 2 주 이상 보관하면 조직 분해 및 오염이 발생할 수 있으며 권장되지 않습니다.
  3. 전산 면역형광 염색
    1. 블로킹/투과성화 용액 100μL(일반 당나귀 혈청 + 0.5% 소 세럼 알부민(BSA) + 1x DPBS에 0.5% 트리톤 X-100을 각각 웰 또는 고정 오르간로이드를 함유한 튜브에 추가합니다. 셰이커에서 하룻밤 동안 실온에서 배양하십시오.
      참고: 튜브당 8개의 오르가노이드를 초과하지 마십시오.
    2. 오가노이드를 건드리지 않고 가능한 한 많은 차단 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. DPBS로 3번 의 헤이시를 수행하여 5분 간 세동을 대기합니다.
    3. 권장 농도에서 원하는 1차 항체 항체와 함께 1차 항체 용액(1% 정상 당나귀 혈청 + 0.5% BSA + 0.5% Triton X-100 1x DPBS)을 준비한다. 셰이커에서 24시간 동안 4°C에서 배양합니다.
    4. 유기체를 건드리지 않고 가능한 한 많은 항체 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. DPBS로 3번 의 헤이시를 수행하여 5분 간 세동을 대기합니다.
    5. 권장 농도에서 원하는 이차 항체 항체와 함께 이차 항체 용액(일반 당나귀 혈청 + 0.5% BSA + 0.5% Triton X-100 1x DPBS)을 권장농도에서 원하는 이차 항체와 준비한다. 항체가 형광으로 표시되면, 어둠 속에서 4°C에서 배양(예를 들어, 알루미늄 호일로 덮여 있음)에 대해 셰이커에 24시간 동안 배양한다.
    6. 유기체를 건드리지 않고 가능한 한 많은 항체 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. DPBS로 3번 의 헤이시를 수행하여 5분 간 세동을 대기합니다.
    7. 비드(직경 90-300 μm)가 장착된 슬라이드를 슬라이드 가장자리 근처에 장착( 재료 표 참조)하여 오르가노이드로 커버슬립을 배치합니다.
      참고: 진행 하기 전에 구슬 주위 마운팅 매체 건조 를 허용 하는 것이 좋습니다.; 이렇게 하면 구슬이 움직이지 못하게 됩니다. 그림 2를 참조하십시오.
    8. 컷 파이펫 팁을 사용하여 스테인드 오르가노이드를 슬라이드에 옮기고, 비드 사이에, 슬라이드에서 오르가노이드 사이의 접촉을 피하기 위해 간격을 확보합니다. 압연 실험실 닦기의 모서리를 사용하여 유기성 주위의 과도한 액체를 조심스럽게 제거하십시오.
    9. 미끄럼방지 매체(과당-글리세롤 클리어링 액은 60%(vol/vol) 글리세롤과 2.5M 과당)37 을 사용하여 슬라이드당 마운팅 클리어링 매체의 120-150 μL을 사용하여 오르가노이드를 덮는다.
      참고: 매우 점성이 있기 때문에 장착 클리어링 매체로 작업할 때 절단 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.
    10. 마운팅 클리어링 솔루션으로 덮인 오르가노이드로 슬라이드 위에 커버슬립을 마우스로 가져가서 슬라이드 위로 커버슬립을 천천히 눌러 오르가노이드가 장착된 구슬 사이에 있는지 확인합니다.
    11. 탑 코트 네일 바니시를 사용하여 슬라이드의 커버 슬립 둘레를 밀봉하십시오. 1 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 건조할 수 있습니다. 장기간 보관할 수 있는 어둠 속에서 4°C에 보관하십시오.
  4. 살아있는 심장 오르가노이드에 있는 칼슘 과도 화상 진찰
    참고: 제조업체의 지시에 따르면, 플루오4-AM은 디메틸 설산화물(DMSO)으로 재구성되어 최종 재고 용액 농도가 0.5mM로 재구성되었습니다. 플루오4-AM은 96웰 플레이트에서 오르가노이드에 직접 첨가되었다.
    1. RPMI 1640 배지를 사용하여 오르가노이드에 2개의 세차장을 수행합니다.
      1. 우물에서 소비된 매체의 166μL을 제거합니다.
      2. 온난한 RPMI 1640 배지 166 μL을 추가하고, 166 μL의 매체를 제거하고, 신선한 RPMI 1640 배지166 μL을 추가합니다.
        참고: 세정은 폐기물과 세포 이물질을 제거하기 위해 수행됩니다. 배지의 3분의 2는 기능적 분석 전에 우물의 바닥에 있는 오르가노이드를 방해하지 않도록 세차하는 동안 우물에서 제거된다.
    2. 불소4-AM 배지를 오르가노이드에 추가합니다.
      1. 1.5 μM 용액을 준비하기 위해 B-27 보충제를 함유한 RPMI 1640에 DMSO에서 재구성된 플루오4-AM을 추가합니다.
      2. 우물에서 166 μL의 매체를 제거합니다.
      3. RPMI 1640에 1.5 μM 플루오4-AM의 166 μL을 추가하여 B-27 보충제를 함유하여 37°C에서 1μM. 인큐베이션, 30분 동안 5% CO2 의 최종 웰 농도를 제공합니다.
    3. 3.4.1 단계에서와 같이 2 개의 헤이즈를 수행합니다.
    4. 우물에 B-27 보충제를 함유한 RPMI 1640의 166μL을 추가합니다.
    5. P200 파이펫 팁의 컷 팁을 사용하여 오르가노이드를 유리 바닥 페트리 접시(예: #1.5 고성능 커버글래스가 있는 8웰 챔버 커버 글래스)로 전달하여 100-200μL의 중간 크기로 전달합니다.
      참고: 전체 오르가노이드 를 전송할 때 섹션 3.1을 참조하십시오.
    6. 이미지 오르가노이드는 37 °C, 5 % CO2에서 온도 및 CO2 제어 챔버와 현미경 아래에 살고 있습니다.
    7. 오르가노이드 전역의 다양한 위치에서 10-20s 비디오를 여러 번 기록하여 칼슘이 세포로 들어오고 나갈 때 형광 강도 수준이 증가하고 감소함을 보여 주습니다.
      참고: 고해상도 레코딩의 경우 10fps 이상의 속도로 기록하는 것이 좋습니다. 50 fps를 권장합니다.
    8. 관심 영역을 선택하고 시간이 지남에 따라 강도 수준을 측정하여 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 비디오를 분석합니다.
    9. ΔF/F0과 밀리초 및 플롯의 시간을 사용하여 강도 레코딩을 정규화합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시험관 내 자가 조직 hHO를 달성하기 위해, 우리는 이전에 Wnt 통로 변조기를 사용하여 심근 세포21 및 상복부 세포의 2D 단층 분화에 대해 설명된 2D 단층 분화 프로토콜을 수정하고 결합하고 성장 인자 BMP4 및 Activin A. 96 웰 플레이트 EB 및 hHOi 프로토콜을 사용하여 여기에 설명된 피규어 1을 사용하여 설명된 피규어 1 , Wnt 통로 활성제 CHIR99021의 농도 및 노출 지속 시간은 인간 PsC에서 파생된 매우 재현 가능하고 복잡한 hHSo를 산출하도록 최적화되었습니다.

EB는 0일째에 차별화를 시작하기 전에 24시간 이후에 중간 변경으로 48h에 대한 배양이 허용되었습니다. 0일째에, EB는 빛 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근 인간 줄기세포 유래 심근세포 및 심장 기원의 다른 세포에서 의기유는 인간 심장 발달을 모델링하는 데 사용되어 왔으며, 26,27,28및 치료학적 29,30및 독성제를 선별하는 도구로 사용되었습니다31,32 . 여기서는 구현하기 쉽고 재현가능한 프로토콜을 보고하여 EB를 생성하고 매우 복잡한 hHSo로 분화합니다. 이 프로토콜은 hPSC 및 hESCs23<...

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Disclosures

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 수여 번호 K01HL135464 및 R01HL151505 및 수상 번호 19IPLOI34660342에서 미국 심장 협회에 의해 국립 건강 연구소의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 MSU 고급 현미경 검사법과 공초점 현미경, IQ 현미경 코어 및 시퀀싱 서비스에 대한 MSU 유전체학 코어에 대한 액세스에 대한 약리학 및 독성학의 MSU 부서에서 박사 윌리엄 잭슨에게 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 귀중한 의견과 조언에 대한 Aguirre 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스InvitrogenA-212021:200
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 마우스InvitrogenA-212061:200
Alexa Fluor 594 당나귀 안티 마우스InvitrogenA-212031:200
Alexa Fluor 594 당나귀 안티 마우스InvitrogenA-212071:200
Alexa Fluor 647 당나귀 안티 염소InvitrogenA328491:200
HAND1Abcamab196622토끼; 1:200
HAND2Abcamab200040토끼; 1:200
NFAT2Abcamab25916토끼; 1:100
PECAM1DSHBP2B1토끼; 1:50
TNNT2Abcamab8295마우스; 1:200
THY1Abcamab133350토끼; 1:200
TJP1InvitrogenPA5-19090염소; 1:250
VIMAbcamab11256염소; 1:250
WT1Abcamab89901토끼; 1:200
배지 및 시약
AccutaseInnovative Cell TechnologiesNC9464543세포 해리 시약
Activin AR& D Systems338AC010
B-27 보충제(인슐린 제외)GibcoA1895601인슐린이 없는 세포 배양 보충제
B-27 보충제Gibco17504-044세포 배양 보충제
BMP-4GibcoPHC9534
소 혈청 알부민Bioworld50253966
CHIR-99021Selleck442310
D-(-)-과당밀리포어 시그마F0127
DAPIThermo Scientific622481:1000
디메틸 설폭사이드밀리포어 시그마D2650
DMEM/F12Gibco10566016
Essential 8 Flex 배지 키트GibcoA2858501만능 줄기세포(PSC) 배지 1% 함유 페니실린-스트렙토마이신
플루오4-AM인비트로젠F14201
글리세롤밀리포어 시그마G5516
글리신밀리포어 시그마410225
마트리겔 GFR코닝CB40230기저막 세포외 기질(BM-ECM)
노멀 당나귀 혈청밀리포어 시그마S30-100mL
파라포름알데히드MP BiomedicalsIC15014601PBS 완충액에 용해된 분말 – 4%
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122
인산염 완충 용액Gibco10010049
인산염 완충 용액 (10x)Gibco70011044
PolybeadMicrospheres Polysciences, Inc.7315590 &마이크로; m
ReLeSR줄기세포NC0729236hPSC용 해리 시약,
RPMI 1640Gibco11875093
ThiazovivinMillipore SigmaSML1045
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Trypan Blue SolutionGibco1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade
50 mL 시약 저장용기Fisherbrand13681502
6-Well Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning0720083
8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glassCellvisC8-1.5H-N
96-well Clear Ultra Low Attachment MicroplatesCostar07201680
ImageJNIHImage 처리 소프트웨어
KimwipesKimberly-Clark Professional06-666실험실 물티슈
마이크로 커버 유리VWR48393-24124 x 50 mm No. 1.5
현미경 슬라이드Fisherbrand1255015
Moxi 세포 카운터Orflo Technologies  MXZ001
Moxi Z 셀 카운트 카세트 – 타입 MOrflo  기술MXC001
멀티채널 피펫FisherbrandFBE120030030-300 &마이크로; L
올림푸스 cellVivoOlympusCaclium 이미징, Imagej
Sorvall Legend X1 원심분리기ThermoFisher Scientific75004261
써멀 믹서ThermoFisher Scientific13-687-717
탑 코트 네일 VarishSeche Vite모든 슈퍼마켓에서 구입할 수 있습니다
항체에서 사용기술 WNT-C59 Selleck NC0710557 기타 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브를 H170010 매체 벡터 실험실 장착 Fisher Scientific 02682002 15 mL 팔콘 튜브 Fisher Scientific 1495970C 2 mL 극저온 바이알 Corning 13-700-500 .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593(2020).
  3. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  6. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  7. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).
  8. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
  9. Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215(2020).
  10. Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723(2019).
  11. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098(2015).
  12. Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
  13. Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
  14. Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94(2020).
  15. Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4(2020).
  16. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140(2018).
  17. Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
  18. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283(2020).
  19. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
  20. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
  21. Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
  22. Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003(2016).
  23. Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142(2021).
  24. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  25. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  26. Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
  27. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  28. Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
  29. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  30. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
  31. Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
  32. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  33. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
  34. Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538(2019).
  35. Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).
  36. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  37. Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).

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