우리는 수생 서식지에서 탄화수소 분해 박테리아를 분리, 번식 및 특성화하는 과정을 제시합니다. 이 프로토콜은 박테리아 분리, 16S rRNA 방법에 의한 식별 및 탄화수소 분해 가능성 테스트에 대해 설명합니다. 이 기사는 연구자들이 환경 샘플에서 미생물 생물 다양성을 특성화하고 특히 생물학적 정화 가능성이 있는 미생물을 선별하는 데 도움이 될 것입니다.
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방법 논문
Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats(수생 서식지에서 탄화수소 대사 특성을 가진 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별)
이 논문에서
요약
초록
탄화수소 오염 물질은 분해에 강하기 쉬우며 환경에 축적되면 모든 생명체에 유독합니다. 박테리아는 수많은 촉매 효소를 암호화하고 자연적으로 탄화수소를 대사할 수 있습니다. 과학자들은 수생 생태계의 생물 다양성을 활용하여 생분해 및 생물학적 정화 가능성이 있는 박테리아를 분리합니다. 환경으로부터 분리된 이러한 물질은 풍부한 대사 경로와 효소를 제공하며, 이는 산업적 규모에서 분해 과정을 확장하는 데 추가로 활용될 수 있습니다. 이 기사에서는 수생 서식지에서 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별의 일반적인 과정을 간략하게 설명하고 간단한 기술을 사용하여 시험관 내에서 탄화수소를 유일한 탄소원으로 활용하는 능력을 선별합니다. 본 프로토콜은 16S rRNA 분석을 사용하여 다양한 박테리아 종의 분리 및 후속 식별을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 박테리아 분리주의 탄화수소 분해 가능성을 특성화하기 위한 단계를 제시합니다. 이 프로토콜은 생명 공학 응용을 위해 환경 서식지에서 박테리아 종을 분리하려는 연구자에게 유용할 것입니다.
서론
탄화수소(HC)는 연료와 화학 응용 분야 모두에서 광범위하게 사용됩니다. 벤젠, 톨루엔, 자일렌과 같은 방향족 탄화수소가 용매로 널리 사용된다1. 에틸렌 및 프로필렌과 같은 알켄은 각각 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 중합체의 합성에서 전구체 역할을 합니다. 다른 탄화수소 인 스티렌의 중합은 폴리스티렌을 형성합니다. 인위적 활동은 탄화수소를 생산 및 운송 중에 환경에 도입합니다. 토양과 물의 탄화수소 오염은 환경과 인간의 건강에 심각한 문제를 안겨줍니다. 미생물은 생지화학적 순환을 조절하고 오염 물질과 생체 이물학을 포함한 광범위한 기질을 활용하여 탄소와 에너지원으로 전환함으로써 생태계를 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 미생물에 의한 환경 오염 물질의 해독 과정은 생물학적 정화 3,4,5,6,7로 알려져 있다.
탄화수소를 분해하는 능력을 가진 미생물은 수생 및 토양 서식지에서 발견된다
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프로토콜
1. 시료 채취, 처리 및 분석
참고: 여기에서는 수생 서식지에서 박테리아를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 분리 물 중 일부는 병원성 일 수 있으므로 장갑을 착용하고 사용 전후에 작업 영역을 소독하십시오.
- 수역의 다른 위치에서 5개의 멸균 유리병에 500mL의 물 샘플을 수집합니다. pH 측정기와 온도계를 각각 사용하여 각 샘플의 pH와 온도를 측정합니다.
참고: 이 프로토콜은 현장에 특정되지 않으며 탄화수소로 오염된 수역에서도 유기체를 분리하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. - 무균 조건에서 0.22μm 공극 크기의 필터 시트를 통해 100mL 배치로 샘플을 여과합니다.
알림: 여과지의 직경은 페트리 접시 직경을 초과해서는 안 됩니다. 예를 들어, 직경이 85mm를 초과하지 않는 여과지는 100-120mm 페트리 접시에 최적입니다. - 여과지를 다른 영양 배지 플레이트(PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 및 M2G22) 위에 보관하십시오. 다양한 유형....
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결과
수생 서식지에서 박테리아를 분리 및 스크리닝하고 16S rRNA 분석에 의한 후속 식별을 위한 전체 절차를 요약한 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. 인도 다드리(Dadri)의 습지에서 채취한 물 샘플을 멸균 유리병에 담아 즉시 실험실로 가져가 처리했습니다. 샘플을 0.22 μm 기공 크기의 필터 시트에 통과시키고 여과지를 다른 매체 플레이트와 접촉시켰다. 2시간 후, 여과지를 제거하고, 플레이트를 콜로니 형성을 위해 30°C에서 밤새 배양하였다(도 2). 다음날, 개별 박테리아 콜로니를 선택하고 신선한 배지 플레이트에 줄무늬를 그렸습니다(그림 2). 생성된 순수 배양물을 저장하고, 이어서 추가 분석에 사용하였다. 이 방법을 사용하여 100개 이상의 고유한 박테리아 분리주 라이브러리를 만들 수 있었습니다. 우리는 탄화수소, 특히 일회용 플.......
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토론
지구상의 박테리아 중 약 1%만이 실험실에서 쉽게 배양될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다6. 배양 가능한 박테리아 중에서도 많은 사람들이 특성화되지 않은 채로 남아 있습니다. 분자 방법의 개선은 박테리아 군집의 분석 및 평가에 새로운 차원을 부여했습니다. 그러나 이러한 기술에는 한계가 있지만 문화 분석이 중복되지는 않습니다. 개별 박테리아 종을 분리하기 위한 순수 배양 기술은 생리학적 특성의 특성화를 위한 주요 메커니즘으로 남아 있습니다. 토양 및 수생 서식지에는 생명공학적 용도로 활용할 수 있는 새로운 효소와 경로를 가진 많은 박테리아가 서식하고 있습니다. 이 연구는 생태 샘플에서 박테리아를 분리하고 특성화하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다.
박테리아마다 영양 요구 사항이 다르기 때문에 다양한 박테리아 종을 분리할 확률을 높이기 위해 다양한 성장 배지가 사용되었습니다. 이 방법의 한 가지 주요 한계는 까다로운 성장 요구 사항을 가진.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
유용한 의견과 제안을 해주신 Karthik Krishnan 박사와 RP 연구소 구성원들에게 감사드립니다. DS는 SNU-Doctoral Fellowship과 Earthwatch Institute India Fellowship의 지원을 받고 있습니다. RP 연구소는 Shiv Nadar University의 CSIR-EMR 보조금 및 창업 자금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가로 스 | 시그마 - 알드리치 | A4718 | 젤 전기 영동 |
| 염화 암모늄 (NH 4< / sub>Cl) | 시그마 - 알드리치 | A9434 | 성장 배지 구성 |
| 황산 암모늄 | 시그마 - 알드리치 | A4418 | 성장 배지 구성 |
| 요소 Bacto-Agar | Millipore | 1016141000 | 고체 매체 준비 |
| 염화칼슘 (CaCl2) | MERCK | C4901-500G | 성장 배지 구성 요소 |
| Catechol | Sigma-Aldrich | 135011 | 탄화수소 분해 분석 |
| 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, CTAB | 시그마 알드리치 | H6269 | 게놈 DNA 분리 |
| 클로로포름 | HIMEDIA | MB109 | 게놈 DNA 분리 |
| 인산 나트륨 (Na2< / sub>HPO4< / sub>) | Sigma-Aldrich | S5136 | 성장 배지 구성 요소 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | gDNA 완충 성분 |
| 황산철, 헵타하이드레이트(FeSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | 215422 | 성장 배지 구성 요소 |
| 포도 | Sigma-Aldrich | G7021 | 성장 배지 구성 |
| 요소: 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516 | 성장 배지 성분; 글리세롤 주식 |
| : 이소프로판올 | HIMEDIA | MB063 | 게놈 DNA 분리 |
| LB 한천 | Difco | 244520 | 성장 매체 |
| Luria-Bertani (LB) | Difco | 244620 | 성장 배지 |
| : 황산 마그네슘 (MgSO4< / sub>) | MERCK | M2643 | 성장 배지 구성 요소 |
| 망간(II) 황산염 일수화물(MnSO4. H20) | Sigma-Aldrich | 221287 | 성장 배지 성분 |
| 영양 육수(NB) | Merck (Millipore) | 03856-500G | 성장 배지 |
| 펩톤 | Merck | 91249-500G | 성장 배지 성분 |
| 페놀 | Sigma-Aldrich | P1037 | 게놈 DNA 분리 |
| 인산칼륨, 이염기성(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786 | 성장 배지 성분 |
| 인산칼륨, 일염기성(KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | 성장 배지 성분 |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2546 | 게놈 DNA 분리 |
| QIAquick Gel 추출 키트 | QIAGEN | 160016235 | DNA 정제 |
| QIAquick PCR 정제 키트 | QIAGEN | 163038783 | DNA 정제 |
| R2A 한천 | 밀리포어 | 1004160500 | 성장 매체 |
| SmartSpec Plus 분광 광도계 | BIO-RAD | 4006221 | 흡광도 측정 |
| 아세트산 나트륨 | 시그마-알드리치 | S2889 | 게놈 DNA 분리 |
| 염화나트륨 (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 성장 배지 성분 |
| 도데실황산나트륨(SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | 게놈 DNA 분리 |
| 스티렌 | Sigma-Aldrich | S4972 | 스티렌 생분해 |
| Taq DNA 중합효소 | NEB | M0273X | 16s rRNA PCR |
| Tris-EDTA (TE) | Sigma-Aldrich | 93283 | 게놈 DNA |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Merck | 22092-500G | 성장 배지 |
| 효모 추출물 | : Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | 성장 배지 성분 |
| : 황산 아연 헵타 하이드레이트 (ZnSO4< / sub>.7H 2< / sub >0) | : Sigma-Aldrich | 221376 | 성장 배지 구성 요소 |
참고문헌
- Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
- Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environme....
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