방법 논문

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats(수생 서식지에서 탄화수소 대사 특성을 가진 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별)

DOI:

10.3791/63101

⸱

2021년 12월 7일

 , 
1Department of Life Sciences, School of Natural Sciences, Shiv Nadar University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 수생 서식지에서 탄화수소 분해 박테리아를 분리, 번식 및 특성화하는 과정을 제시합니다. 이 프로토콜은 박테리아 분리, 16S rRNA 방법에 의한 식별 및 탄화수소 분해 가능성 테스트에 대해 설명합니다. 이 기사는 연구자들이 환경 샘플에서 미생물 생물 다양성을 특성화하고 특히 생물학적 정화 가능성이 있는 미생물을 선별하는 데 도움이 될 것입니다.

초록

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탄화수소 오염 물질은 분해에 강하기 쉬우며 환경에 축적되면 모든 생명체에 유독합니다. 박테리아는 수많은 촉매 효소를 암호화하고 자연적으로 탄화수소를 대사할 수 있습니다. 과학자들은 수생 생태계의 생물 다양성을 활용하여 생분해 및 생물학적 정화 가능성이 있는 박테리아를 분리합니다. 환경으로부터 분리된 이러한 물질은 풍부한 대사 경로와 효소를 제공하며, 이는 산업적 규모에서 분해 과정을 확장하는 데 추가로 활용될 수 있습니다. 이 기사에서는 수생 서식지에서 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별의 일반적인 과정을 간략하게 설명하고 간단한 기술을 사용하여 시험관 내에서 탄화수소를 유일한 탄소원으로 활용하는 능력을 선별합니다. 본 프로토콜은 16S rRNA 분석을 사용하여 다양한 박테리아 종의 분리 및 후속 식별을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 박테리아 분리주의 탄화수소 분해 가능성을 특성화하기 위한 단계를 제시합니다. 이 프로토콜은 생명 공학 응용을 위해 환경 서식지에서 박테리아 종을 분리하려는 연구자에게 유용할 것입니다.

서론

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탄화수소(HC)는 연료와 화학 응용 분야 모두에서 광범위하게 사용됩니다. 벤젠, 톨루엔, 자일렌과 같은 방향족 탄화수소가 용매로 널리 사용된다1. 에틸렌 및 프로필렌과 같은 알켄은 각각 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 중합체의 합성에서 전구체 역할을 합니다. 다른 탄화수소 인 스티렌의 중합은 폴리스티렌을 형성합니다. 인위적 활동은 탄화수소를 생산 및 운송 중에 환경에 도입합니다. 토양과 물의 탄화수소 오염은 환경과 인간의 건강에 심각한 문제를 안겨줍니다. 미생물은 생지화학적 순환을 조절하고 오염 물질과 생체 이물학을 포함한 광범위한 기질을 활용하여 탄소와 에너지원으로 전환함으로써 생태계를 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 미생물에 의한 환경 오염 물질의 해독 과정은 생물학적 정화 3,4,5,6,7로 알려져 있다.

탄화수소를 분해하는 능력을 가진 미생물은 수생 및 토양 서식지에서 발견된다 8,9,10. 슈도모나스(Pseudomonas), 아시네토박터(Acinetobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 마리노박터(Marinobacter) 및 올레이박터(Oleibacter)와 같이 알칸과 방향족 HC를 분해할 가능성이 있는 많은 박테리아가 확인되었습니다 11. 기술적으로 진보된 배양 독립적 접근법의 개발은 새로운 HC 분해 미생물 군집을 발견하는 데 도움이 되었습니다12. 소스 샘플에서 직접 분리된 게놈 물질은 차세대 염기서열 분석(NGS)과 같은 고처리량 방법으로 증폭 및 시퀀싱된 후 분석되므로 미생물을 배양할 필요가 없습니다. 메타게놈 분석(metagenome analysis)과 같은 NGS 방법은 비용이 많이 들고 증폭 과정과 관련된 단점이 있다13. 탄화수소 분해 미생물의 분리를 목표로 하는 선택적 농축 배양(selective enrichment culture)14과 같은 배양 기술은 연구자들이 박테리아 분리주에서 대사 경로를 조사하고 조작할 수 있게 해주기 때문에 여전히 유용하다.

게놈 DNA 분리 및 게놈 물질의 후속 시퀀싱은 모든 유기체에 대한 귀중한 정보를 보여줍니다. 전체 게놈 시퀀싱은 항생제 내성, 잠재적 약물 표적, 독성 인자, 수송체, 생체 이물 대사 효소 등을 암호화하는 유전자를 식별하는 데 도움이 됩니다15,16,17. 16SrRNA 인코딩 유전자의 시퀀싱은 박테리아 계통발생을 식별하는 강력한 기술임이 입증되었습니다. 수년에 걸쳐 유전자 서열과 기능을 보존하면 알려지지 않은 박테리아를 식별하고 분리된 균주를 가장 가까운 종과 비교하는 신뢰할 수 있는 도구가 됩니다. 또한, 이 유전자의 길이는 생물정보학 분석에 최적이다18. 범용 프라이머를 사용한 유전자 증폭의 용이성 및 유전자 시퀀싱 기술의 개선과 함께 이러한 모든 기능은 미생물 식별을 위한 황금 표준이 되었습니다.

여기에서는 환경 샘플에서 HC 분해 가능성이 있는 배양 가능한 미생물을 회수하는 절차를 설명합니다. 이하에 기술된 방법은 HC-분해성 박테리아의 수집 및 식별을 개략적으로 설명하며, 5개의 섹션으로 나뉩니다: (1) 물 샘플로부터의 박테리아 수집, (2) 순수 배양물의 분리, (3) 박테리아 분리주의 HC-분해 능력 탐색, (4) 게놈 DNA 분리, 및 (5) 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 BLAST 분석에 기초한 식별. 이 절차는 다양한 생명 공학 응용 분야에서 박테리아를 분리하는 데 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

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1. 시료 채취, 처리 및 분석

참고: 여기에서는 수생 서식지에서 박테리아를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 분리 물 중 일부는 병원성 일 수 있으므로 장갑을 착용하고 사용 전후에 작업 영역을 소독하십시오.

  1. 수역의 다른 위치에서 5개의 멸균 유리병에 500mL의 물 샘플을 수집합니다. pH 측정기와 온도계를 각각 사용하여 각 샘플의 pH와 온도를 측정합니다.
    참고: 이 프로토콜은 현장에 특정되지 않으며 탄화수소로 오염된 수역에서도 유기체를 분리하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.
  2. 무균 조건에서 0.22μm 공극 크기의 필터 시트를 통해 100mL 배치로 샘플을 여과합니다.
    알림: 여과지의 직경은 페트리 접시 직경을 초과해서는 안 됩니다. 예를 들어, 직경이 85mm를 초과하지 않는 여과지는 100-120mm 페트리 접시에 최적입니다.
  3. 여과지를 다른 영양 배지 플레이트(PYE 19, R2A 20,M9, LB, NB, TSB, M63 21 및 M2G22) 위에 보관하십시오. 다양한 유형의 성장 배지를 통해 다양한 미생물을 선택하고 농축할 수 있습니다. 다양한 성장 배지의 조성이 표 1에 열거되어 있다. 각 미디어 플레이트에 용지 한 장을 사용하고 멸균 집게를 사용하여 2시간 후에 떼어냅니다.
  4. 여과되지 않은 물 샘플(10,6 희석)을 멸균된 이중 증류수로 연속 희석하여 수집된 물 샘플 100 μL를 멸균수 900 μL에 첨가합니다. 그 결과 1:10 희석됩니다. 이 샘플에서 100 μL를 취하여 900 μL의 멸균수를 첨가하여 1:100 희석을 얻습니다. 희석 접기가 1:1,000,000이 될 때까지 희석을 반복합니다. 피펫팅으로 혼합합니다. 각 희석액의 최종 부피는 1mL입니다.
  5. 희석된 물 샘플 100μL를 3단계에서 언급한 모든 성장 배지 플레이트에 개별적으로 3회 뿌립니다.
  6. 콜로니의 성장에 따라 플레이트를 30°C에서 24 내지 48시간 동안 인큐베이션한다.
    참고: 대부분의 환경 분리물은 30°C의 최적 온도에서 자랍니다. 극한의 온도를 가진 환경에서 샘플을 분리하는 경우, 수집 장소와 동일한 온도에서 플레이트를 배양하십시오.
  7. 다음으로, 멸균 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 선택하고 사분면 스트리킹을 수행하여 분리된 콜로니를 얻습니다.
  8. 플레이트를 밤새 배양하십시오. 다음 날, 색상, 질감, 모양, 크기, 여백, 고도 등과 같은 형태학적 특징을 기반으로 식민지를 선별합니다. 순수한 문화를 얻기 위해 식민지를 재건하십시오.
  9. 각 순수 배양액(23 )의 그람 염색을 수행하고, 글리세롤 스톡 준비를 진행한다.
  10. 글리세롤 스톡을 제조하기 위해, 3 mL의 적절한 성장 배지에 단일 콜로니를 접종하고 30°C에서 인큐베이션한다. 하룻밤 배양에서 700 μL를 취하여 300 μL의 100 % 글리세롤 (오토 클레이브에 의해 멸균 됨)을 cryovials24에 첨가한다. 장기 보관을 위해 바이알을 -80°C에서 동결합니다.

2. 탄화수소의 분해

알림: 아래 예는 스티렌을 분해할 수 있는 분리물을 선별하기 위한 것입니다. 이는 이전 보고서25에서 채택된 방법을 약간 수정한 것입니다. 무균 상태에서 단계를 따르십시오.

  1. 갓 줄무늬가 있는 접시에서 집락을 선택하고 5mL의 트립신 콩 국물(TSB)/영양 국물(NB)에 접종합니다. 흡광도가 ~2에 도달할 때까지 200rpm으로 진탕하면서 30°C에서 밤새 배양액을 성장시킵니다.
    참고: TSB/NB 외에 박테리아가 높은 세포 밀도에 도달하는 모든 성장 배지를 선택할 수 있습니다.
  2. 다음날, 세포를 4°C에서 5분 동안 2862 x g 로 펠렛화하고 상청액을 버린다.
  3. 2mL의 오토클레이브 식염수(0.9% NaCl)로 펠릿을 2회 세척하고 4°C에서 5분 동안 2862 x g 에서 회전합니다.
    참고: 식염수는 등장성이므로 박테리아 세포 내부의 삼투압을 유지합니다.
  4. 펠릿을 2mL의 액체 무탄소 기저 배지(LCFBM)에 재현탁합니다. 흡광도(OD600)를 측정한다.
  5. 대조군과 실험군을 위해 150mL 용량의 멸균 삼각 플라스크 2개를 취합니다. A와 B로 레이블을 지정합니다.
  6. 접종하지 않은 그룹/대조군(플라스크 A)에 LCFBM 40mL와 스티렌(5mM)을 추가합니다.
  7. 플라스크 B에 35mL의 LCFBM과 스티렌을 추가합니다(스티렌의 최종 농도를 5mM로 조정). 세포의 최종OD600 ≈ 0.1로 세포 현탁액을 추가하고 최대 40mL의 LCFBM으로 나머지 부피를 구성합니다. 플라스크를 30°C에서 30일 동안 200 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션한다.
    알림: 과량의 탄화수소는 미생물에 유독할 수 있으므로 낮은 농도에서 시작하여 점차 증가시킵니다.
  8. 탄화수소 분해에 대해 평가해야 하는 각 추가 변형에 대해 위의 내용을 반복합니다.
  9. 5일마다 각 플라스크의OD600 을 측정하고 성장 곡선을 그립니다. 박테리아가 스티렌을 사용할 수 있는 경우 배양을 최대 45일까지 늘립니다. OD600 의 증가는 박테리아가 스티렌을 대사 할 수 있음을 나타냅니다.

3. 박테리아 분리주에 의한 카테콜 분해 스크리닝

참고: 스티렌, 벤젠, 자일렌, 나프탈렌, 페놀 등과 같은 방향족 탄화수소의 분해는 반응 중간체로 카테콜을 생성합니다. 카테콜은 각각 ortho- 및 meta-cleavage 경로를 통해 catechol 1,2-dioxygenase 및 catechol 2,3-dioxygenase 효소의 도움으로 박테리아에 의해 추가로 대사된다26. 이 효소는 또한 클로로벤젠27과 같은 다른 탄화수소의 분해에도 관여합니다. 아래에 언급된 프로토콜은 카테콜 2, 3-디옥시게나제 효소 분석28을 위해 전체 세포 용해물을 사용합니다. 동일한 용해 방법을 사용하여 카테콜 1, 2-디옥시게나제의 활성을 스크리닝할 수 있습니다. 그러나, 반응 혼합물의 조성은 변할 것이다. 두 효소 모두 본질적으로 유도 가능하며 성장 배지에 페놀을 첨가하여 유도 할 수 있습니다.

  1. 멸균 루프의 도움으로 갓 줄무늬가 있는 플레이트의 박테리아 콜로니를 1-4mM 페놀이 보충된 미네랄 소금 배지(MSM)에 접종합니다. 배양물을 30°C 및 200 rpm에서 배양한다. OD600 이 1.4-1.6 사이(즉, 후기 지수 단계)에 도달할 때 4500 x g 에서 20분 동안 회전하여 4°C에서 배양물을 수확합니다.
  2. 세포 펠릿을 인산염 완충액(0.5 M, pH 7.5)으로 세척한다.
  3. 세포를 상술한 인산염 완충액에 재현탁하고 최종 OD600 ≈ 1.0으로 조정한다.
  4. 1.5 분 동안 펄스 초음파 처리로 세포를 용해하고, 각 펄스의 지속 시간은 15 초입니다. 이 단계 후에 서스펜션은 깨끗하거나 덜 탁해야합니다. 그렇지 않은 경우 펄스 수를 늘리고 서스펜션이 깨끗한지 확인하십시오. 각 맥박 후, 단백질 분해를 방지하기 위해 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
  5. 세포 파편 및 깨지지 않은 세포를 저온 (4°C)을 유지하면서 30분 동안 9,000 x g 에서 원심분리하여 제거하였다.
  6. 투명한 상층액을 조심스럽게 피펫팅합니다. 이 분획에는 효소 분석용 조 추출물이 있습니다.
  7. Bradford 또는 Lowry의 방법29,30에 의해 조 추출물의 단백질 농도를 결정하십시오.
  8. 카테콜 2,3-디옥시게나제의 활성을 결정하기 위해 분광 광도계로 반응 최종 생성물(2-하이드록시점원산 세미알데히드)의 형성을 측정합니다.
  9. 20 μL의 카테콜 (50 mM), 960 μL의 인산염 완충액 (50 mM, pH 7.5) 및 20 μL의 조 추출물을 첨가하여 반응 혼합물을 준비한다.
  10. 음성 대조군의 경우 조추출물을 인산염 완충액으로 교체하고 최종 부피를 1mL로 조정합니다.
  11. 반응 혼합물을 30분 동안 인큐베이션한다. 설정된 시간 간격으로 375nm에서 흡광도를 측정합니다. 흡광도의 증가는 반응 최종 생성물인 2-하이드록시뮤콘산 세미알데히드(2-HMS)의 형성을 나타낸다. 실험을 세 번 수행합니다.
    알림: 카테콜은 빛과 산소에 민감합니다. 반응 혼합물을 어두운 곳에 보관하고 튜브를 단단히 닫아 카테콜의 자연적인 분해를 방지하십시오.

4. 순수 배양액의 게놈 DNA 분리

참고: 이것은 게놈 DNA의 분리를 위한 일반적인 프로토콜입니다. 그람 염색은 샘플 수집, 처리 및 분석 단계 동안 수행되었다. 그람 양성균과 그람 음성균의 세포벽 두께의 변화로 인해 세포 용해 방법이 그에 따라 수정됩니다. 뉴클레아제가 DNA를 분해하는 것을 방지하기 위해 작업대를 격리하고 70% 에탄올로 소독하는 동안 장갑을 착용하십시오. 아래에 언급된 화학 물질 중 일부는 피부에 심각한 화상을 입힐 수 있으므로 취급 시 적절한 주의를 기울여야 합니다.

  1. 그람 음성 박테리아에서 게놈 DNA 분리31.
    1. 단일 콜로니를 선택하고 멸균 시험관의 신선한 성장 배지에 접종합니다.
    2. 튜브를 200rpm의 인큐베이터 셰이커에 넣고 박테리아가 30°C에서 밤새 자라도록 합니다.
    3. 다음날, 12,400 x g 에서 하룻밤 동안 배양한 1.5 mL의 펠렛을 3분 동안 배양하였다.
    4. 상층액을 제거하고 200μL의 용해 완충액(40mM 트리스-아세테이트, pH 7.8, 20mM 아세트산나트륨, 1mM EDTA, 1% SDS)에 펠렛을 재현탁합니다.
    5. 66 μL의 NaCl 용액 (5 M)을 넣고 잘 섞는다.
    6. 얻어진 혼합물을 12,400 x g 에서 10분 동안 펠렛화한다(4°C).
    7. 신선한 미세 원심 분리기 튜브에서 맑은 상청액을 피펫팅하고 동일한 부피의 클로로포름을 첨가하십시오.
    8. 유백색 용액이 관찰될 때까지 용액을 여러 번 뒤집습니다.
    9. 12,400 x g 에서 3분 동안 회전하고 상청액을 깨끗한 바이알에 옮깁니다.
    10. 얼음처럼 차가운 100% 에탄올 1mL를 넣습니다. DNA의 흰색 가닥이 침전될 때까지 반전으로 혼합합니다.
    11. 침전된 DNA를 4°C에서 10분 동안 2,200 x g 로 원심분리하고 상층액을 버린다.
    12. DNA 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 세척하고 DNA 펠릿을 실온에서 5분 동안 건조시킵니다.
    13. 건조되면 펠릿을 1x Tris-EDTA(TE) 완충액 100μL에 재현탁하고 DNA를 -20°C에서 보관합니다.
    14. 분광광도계를 사용하여 농도(A260/280)를 측정하고 아가로스 겔(1%)에서 DNA를 실행하여 DNA24의 품질을 평가합니다.
  2. 그람 양성균주에서 게놈 DNA 분리32
    1. 단일 콜로니를 선택하고 멸균 시험관의 신선한 성장 배지에 접종합니다.
    2. 튜브를 200rpm의 인큐베이터 셰이커에 넣고 박테리아가 적절한 성장 온도에서 밤새 자랄 수 있도록 합니다.
    3. 다음날, 성장한 배양액 1.5mL를 취하여 8,600 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 상청액을 제거하고 세포를 TE 완충액에 재현탁합니다.
    5. TE 버퍼로 OD600 = 1.0을 조정하고 740μL의 세포 현탁액을 깨끗한 마이크로퍼지 튜브로 옮깁니다.
    6. 20 μL의 라이소자임(100 mg/mL stock)을 첨가하고 피펫팅으로 잘 섞습니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다(건조에서).
    7. 40 μL의 10 % SDS를 첨가하고 잘 섞는다.
    8. 8μL의 프로테이나제 K(10mg/mL)를 추가합니다. 잘 섞고 56 °C에서 1-3 시간 동안 배양합니다 (건조에서). 현탁액은 이제 점도가 증가하여 투명해져 효율적인 세포 용해를 표시해야 합니다.
      알림: 세포가 제대로 용해되지 않으면 현탁액을 밤새 방치할 수 있습니다.
    9. CTAB/NaCl 혼합물을 65°C(건조에서)로 예열하고 이 혼합물 100μL를 세포 현탁액에 추가합니다. 잘 섞다.
    10. 65°C에서 10분 동안 배양합니다(건조에서).
    11. 500 μL의 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)을 넣고 잘 섞는다. 25°C에서 16,900 x g 로 10분 동안 회전합니다.
    12. 수성상을 유기상을 피하는 신선한 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다(바닥의 점성상).
    13. 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)의 500 μL를 조심스럽게 첨가하고 잘 섞는다. 25°C에서 16,900 x g 로 10분 동안 회전합니다.
    14. 신선한 미세 원심분리기 튜브에서 수상을 채취합니다. 500 μL의 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)을 넣고 잘 섞는다.
    15. 수성상을 옮기고 0.6 부피의 이소프로판올을 첨가한다 (-20°C에서 예냉).
    16. 침전된 DNA 가닥은 실 모양의 형태로 보여야 합니다. -20°C에서 2시간 동안 하룻밤 동안 배양합니다.
    17. 4°C에서 15분 동안 16,900 x g 에서 원심분리하여 DNA를 펠릿화합니다.
    18. 이소프로판올을 조심스럽게 디캔팅하고 펠릿을 차가운 70% 에탄올 1mL(-20°C에서 예냉)로 세척하여 불순물을 제거합니다.
    19. 4 °C에서 5분 동안 16,900 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
    20. 펠릿을 실온에서 20분 동안 건조시키거나 튜브를 37°C로 유지하십시오. 펠릿이 과도하게 건조되지 않았는지 확인하십시오.
    21. 1x TE 완충액 100μL에 재현탁하고 DNA를 -20°C에서 보관합니다.
      참고: 펠릿이 과도하게 건조되어 재현탁이 어려운 경우 미세 원심분리기 튜브를 DNA 펠릿과 뉴클레아제가 없는 물과 함께 37°C에서 15-20분 동안 배양하고 피펫팅으로 다시 현탁합니다.
    22. 1x TE 완충액에서 1:100으로 희석한 후 분광광도계를 사용하여 농도(A260/280)를 측정하고 DNA를 아가로스 겔(1%)에 실행하여 DNA24의 품질을 평가합니다.

5. 16S rRNA 시퀀싱

참고: 아래에 설명된 프로토콜은 박테리아 식별을 위한 16S rRNA의 증폭 및 시퀀싱을 위한 것입니다. 16S rRNA 염기서열에서 파생된 정보는 알려지지 않은 유기체를 식별하고 서로 다른 유기체 간의 관련성을 찾는 데 사용됩니다.

  1. 균주를 확인하기 위해 박테리아에 대한 16S rRNA 서열을 표적으로 하는 범용 프라이머를 사용하여 PCR로 순수 박테리아 배양에서 분리된 DNA를 증폭합니다: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
  2. 18μL의 오토클레이브/뉴클레아제가 없는 물, 2.5μL의 10x 완충액, 0.5μL의 정방향 및 역방향 프라이머(100μM 스톡), 2μL의 dNTP 혼합물(100μM 스톡), 1μL의 DNA 템플릿(2-15ng/μL) 및 1U의 Taq 중합효소로 얼음 위에서 PCR 믹스(25μL 반응)를 준비합니다.
  3. 16S rRNA 유전자 증폭을 위해 다음의 사이클링 조건을 사용한다: 94°C에서 10분 동안 초기 변성, (94°C에서 40초 동안 최종 변성, 56°C에서 1분 동안 프라이머 어닐링, 74°C에서 2분 동안 연장) x 30 사이클, 74°C에서 10분 동안 최종 연장.
  4. 주기가 끝나면 5μL의 샘플과 1μL의 5x DNA 로딩 염료를 혼합합니다. 증폭을 검증하기 위해 1% 아가로스 겔 상에서 실행한다. PCR 산물을 4°C에서 단기간 보관하거나 추가 사용이 가능할 때까지 -20°C에서 동결합니다.
  5. 16S rRNA 유전자 시퀀싱의 경우 더 높은 부피(100μL)에 대해 위에서 언급한 것과 동일한 반응을 설정합니다.
  6. PCR product purification kit를 사용하여 Sanger sequencing24,34용 앰플리콘을 정제하거나 전체 샘플을 DNA 로딩 염료와 혼합하고 아가로스 겔에 로드하여 겔 추출법을 수행합니다.
  7. 시퀀싱이 완료되면 결과 파일을 FASTA 형식으로 변환하고 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35의 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST)를 사용하여 시퀀스 유사성을 확인합니다.

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결과

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수생 서식지에서 박테리아를 분리 및 스크리닝하고 16S rRNA 분석에 의한 후속 식별을 위한 전체 절차를 요약한 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. 인도 다드리(Dadri)의 습지에서 채취한 물 샘플을 멸균 유리병에 담아 즉시 실험실로 가져가 처리했습니다. 샘플을 0.22 μm 기공 크기의 필터 시트에 통과시키고 여과지를 다른 매체 플레이트와 접촉시켰다. 2시간 후, 여과지를 제거하고, 플레이트를 콜로니 형성을 위해 30°C에서 밤새 배양하였다(도 2). 다음날, 개별 박테리아 콜로니를 선택하고 신선한 배지 플레이트에 줄무늬를 그렸습니다(그림 2). 생성된 순수 배양물을 저장하고, 이어서 추가 분석에 사용하였다. 이 방법을 사용하여 100개 이상의 고유한 박테리아 분리주 라이브러리를 만들 수 있었습니다. 우리는 탄화수소, 특히 일회용 플...

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토론

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지구상의 박테리아 중 약 1%만이 실험실에서 쉽게 배양될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다6. 배양 가능한 박테리아 중에서도 많은 사람들이 특성화되지 않은 채로 남아 있습니다. 분자 방법의 개선은 박테리아 군집의 분석 및 평가에 새로운 차원을 부여했습니다. 그러나 이러한 기술에는 한계가 있지만 문화 분석이 중복되지는 않습니다. 개별 박테리아 종을 분리하기 위한 순수 배양 기술은 생리학적 특성의 특성화를 위한 주요 메커니즘으로 남아 있습니다. 토양 및 수생 서식지에는 생명공학적 용도로 활용할 수 있는 새로운 효소와 경로를 가진 많은 박테리아가 서식하고 있습니다. 이 연구는 생태 샘플에서 박테리아를 분리하고 특성화하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다.

박테리아마다 영양 요구 사항이 다르기 때문에 다양한 박테리아 종을 분리할 확률을 높이기 위해 다양한 성장 배지가 사용되었습니다. 이 방법의 한 가지 주요 한계는 까다로운 성장 요구 사항을 가진...

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공개 사항

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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유용한 의견과 제안을 해주신 Karthik Krishnan 박사와 RP 연구소 구성원들에게 감사드립니다. DS는 SNU-Doctoral Fellowship과 Earthwatch Institute India Fellowship의 지원을 받고 있습니다. RP 연구소는 Shiv Nadar University의 CSIR-EMR 보조금 및 창업 자금으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로 스시그마 - 알드리치A4718젤 전기 영동
염화 암모늄 (NH 4< / sub>Cl)시그마 - 알드리치A9434성장 배지 구성
황산 암모늄시그마 - 알드리치A4418성장 배지 구성
요소 Bacto-AgarMillipore1016141000고체 매체 준비
염화칼슘 (CaCl2)MERCKC4901-500G성장 배지 구성 요소
CatecholSigma-Aldrich135011탄화수소 분해 분석
세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, CTAB시그마 알드리치H6269게놈 DNA 분리
클로로포름HIMEDIAMB109게놈 DNA 분리
인산 나트륨 (Na2< / sub>HPO4< / sub>)Sigma-AldrichS5136성장 배지 구성 요소
EDTASigma-AldrichE9884gDNA 완충 성분
황산철, 헵타하이드레이트(FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422성장 배지 구성 요소
포도Sigma-AldrichG7021성장 배지 구성
요소: 글리세롤시그마-알드리치G5516성장 배지 성분; 글리세롤 주식
: 이소프로판올HIMEDIAMB063게놈 DNA 분리
LB 한천Difco244520성장 매체
Luria-Bertani (LB)Difco244620성장 배지
: 황산 마그네슘 (MgSO4< / sub>)MERCKM2643성장 배지 구성 요소
망간(II) 황산염 일수화물(MnSO4. H20)Sigma-Aldrich221287성장 배지 성분
영양 육수(NB)Merck (Millipore)03856-500G성장 배지
펩톤Merck91249-500G성장 배지 성분
페놀Sigma-AldrichP1037게놈 DNA 분리
인산칼륨, 이염기성(K2HPO4)Sigma-AldrichP3786성장 배지 성분
인산칼륨, 일염기성(KH2PO4)Sigma-AldrichP9791성장 배지 성분
Proteinase KThermoFisher ScientificAM2546게놈 DNA 분리
QIAquick Gel 추출 키트QIAGEN160016235DNA 정제
QIAquick PCR 정제 키트QIAGEN163038783DNA 정제
R2A 한천밀리포어1004160500성장 매체
SmartSpec Plus 분광 광도계BIO-RAD4006221흡광도 측정
아세트산 나트륨시그마-알드리치S2889게놈 DNA 분리
염화나트륨 (NaCl)Sigma-AldrichS9888성장 배지 성분
도데실황산나트륨(SDS)Sigma-AldrichL3771게놈 DNA 분리
스티렌Sigma-AldrichS4972스티렌 생분해
Taq DNA 중합효소NEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283게놈 DNA
Tryptic Soy Broth (TSB)Merck22092-500G성장 배지
효모 추출물: Sigma-AldrichY1625-1KG성장 배지 성분
: 황산 아연 헵타 하이드레이트 (ZnSO4< / sub>.7H 2< / sub >0): Sigma-Aldrich221376성장 배지 구성 요소
요소 : 당 의 재현탁

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sirotkin, A. V. Reproductive effects of oil-related environmental pollutants. Encyclopedia of Environmental Health. , 493-498 (2019).
  2. Li, C., Busquets, R., Campos, L. C. Assessment of microplastics in freshwater systems: A review. Science of The Total Environment. 707, 135578(2020).
  3. Siddiqa, A., Faisal, M. Microbial degradation of organic pollutants using indigenous bacterial strains. Handbook of Bioremediation. , 625-637 (2021).
  4. Hossain, F., et al. Bioremediation potential of hydrocarbon degrading bacteria: isolation, characterization, and assessment. Saudi Journal of Biological Sciences. , (2021).
  5. Wongbunmak, A., Khiawjan, S., Suphantharika, M., Pongtharangkul, T. BTEX biodegradation by Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W1 and its proposed BTEX biodegradation pathways. Scientific Reports. 10 (1), 17408(2020).
  6. Bodor, A., et al. Challenges of unculturable bacteria: environmental perspectives. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19 (1), 1-22 (2020).
  7. Phale, P. S., Sharma, A., Gautam, K. Microbial degradation of xenobiotics like aromatic pollutants from the terrestrial environments. Pharmaceuticals and Personal Care Products: Waste Management and Treatment Technology. , 259-278 (2019).
  8. Brooijmans, R. J. W., Pastink, M. I., Siezen, R. J. Hydrocarbon-degrading bacteria: the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. 2 (6), 587-594 (2009).
  9. Sorkhoh, N. A., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Stretton, R. J., Radwan, S. S. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait. Environmental Pollution. 65 (1), 1-17 (1990).
  10. Chaillan, F., et al. Identification and biodegradation potential of tropical aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Research in Microbiology. 155 (7), 587-595 (2004).
  11. Bôto, M. L., et al. Harnessing the potential of native microbial communities for bioremediation of oil spills in the Iberian Peninsula NW coast. Frontiers in Microbiology. 12, 879(2021).
  12. Wang, Y., et al. A culture-independent approach to unravel uncultured bacteria and functional genes in a complex microbial community. PloS One. 7 (10), 47530(2012).
  13. Jovel, J., et al. Characterization of the gut microbiome using 16S or shotgun metagenomics. Frontiers in Microbiology. 7, 459(2016).
  14. Spini, G., et al. Molecular and microbiological insights on the enrichment procedures for the isolation of petroleum degrading bacteria and fungi. Frontiers in Microbiology. 0, 2543(2018).
  15. Pightling, A. W., et al. Interpreting whole-genome sequence analyses of foodborne bacteria for regulatory applications and outbreak investigations. Frontiers in Microbiology. , 1482(2018).
  16. Salipante, S. J., et al. Application of whole-genome sequencing for bacterial strain typing in molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology. 53 (4), 1072-1079 (2015).
  17. Lovley, D. R. Cleaning up with genomics: applying molecular biology to bioremediation. Nature Reviews Microbiology. 1 (1), 35-44 (2003).
  18. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  19. Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group. Bacteriological Reviews. 28 (3), 231-295 (1964).
  20. Reasoner, D. J., Geldreich, E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (1), 1-7 (1985).
  21. Pardee, A. B. The genetic control and cytoplasmic expression of “Inducibility” in the synthesis of β-galactosidase by E. coli. Journal of Molecular Biology. 1 (2), 165-178 (1959).
  22. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods in Enzymology. 204, 372-384 (1991).
  23. R, C. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  24. Green, M. R., Hughes, H., Sambrook, J., MacCallum, P. Molecular cloning: a laboratory manual. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 1890(2012).
  25. Chauhan, D., Agrawal, G., Deshmukh, S., Roy, S. S., Priyadarshini, R. Biofilm formation by Exiguobacterium sp. DR11 and DR14 alter polystyrene surface properties and initiate biodegradation. RSC Advances. 8 (66), 37590-37599 (2018).
  26. Takeo, M., Nishimura, M., Shirai, M., Takahashi, H., Negoro, S. Purification and characterization of catechol 2,3-Dioxygenase from the aniline degradation pathway of Acinetobacter sp. YAA and its mutant enzyme, which resists substrate inhibition. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 71, 70079-70080 (2007).
  27. Nguyen, O. T., Ha, D. D. Degradation of chlorotoluenes and chlorobenzenes by the dual-species biofilm of Comamonas testosteroni strain KT5 and Bacillus subtilis strain DKT. Annals of Microbiology. 69 (3), 267-277 (2019).
  28. Hupert-Kocurek, K., Guzik, U., Wojcieszyńska, D. Characterization of catechol 2, 3-dioxygenase from Planococcus sp. strain S5 induced by high phenol concentration. Acta Biochimica Polonica. 59 (3), (2012).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  30. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  31. Chen, W. P., Kuo, T. T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Research. 21 (9), 2260(1993).
  32. William, S., Feil, H., Copeland, A. Bacterial genomic DNA isolation using CTAB. Sigma. 50 (6876), (2012).
  33. Frank, J. A., et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 74 (8), 2461-2470 (2008).
  34. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  35. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 5-9 (2008).
  36. Harayama, S., Rekik, M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15328-15333 (1989).
  37. Li, X., et al. Efficiency of chemical versus mechanical disruption methods of DNA extraction for the identification of oral Gram-positive and Gram-negative bacteria. The Journal of International Medical Research. 48 (5), 300060520925594(2020).
  38. Coico, R. Gram staining. Current Protocols in Microbiology. , Appendix 3 (2005).
  39. Clarridge, J. E. III Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17 (4), 840(2004).
  40. Dereeper, A., et al. Phylogeny. fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Research. 36, suppl 2 465-469 (2008).
  41. Wadowsky, R. M., Wolford, R., McNamara, A. M., Yee, R. B. Effect of temperature, pH, and oxygen level on the multiplication of naturally occurring Legionella pneumophila in potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49 (5), 1197-1205 (1985).
  42. du Toit, W. J., Pretorius, I. S., Lonvaud-Funel, A. The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology. 98 (4), 862-871 (2005).
  43. Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  44. Kim, E., et al. Design of PCR assays to specifically detect and identify 37 Lactobacillus species in a single 96 well plate. BMC Microbiology. 20 (1), 1-14 (2020).
  45. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and limitations of 16S rRNA gene amplicon sequencing in revealing temporal microbial community dynamics. PLoS ONE. 9 (4), (2014).
  46. Johnson, B. H., Hecht, M. H. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Bio/Technology. 12 (12), 1357-1360 (1994).
  47. Rodríguez-Carmona, E., Cano-Garrido, O., Seras-Franzoso, J., Villaverde, A., García-Fruitós, E. Isolation of cell-free bacterial inclusion bodies. Microbial Cell Factories. 9 (1), 71(2010).
  48. Hoiczyk, E., Hansel, A. Cyanobacterial cell walls: News from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182 (5), 1191(2000).
  49. Erstad, S. M., Sakuragi, Y. Easy and efficient permeabilization of cyanobacteria for in vivo enzyme assays using B-PER. Bio-Protocol. 8 (1), (2018).

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