Method Article

자가형광을 이용한 Neural Stem Cell Activation State In Vitro 분류

DOI:

10.3791/63110

⸱

April 12th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 i) 컨포칼 현미경, ii) 강도 이미징을 수행하기 위한 형광 활성화 세포 분류기 또는 iii) 형광 수명 이미징을 수행하기 위한 다광자 현미경을 사용하여 자가형광 이미징을 통해 1차 성체 마우스 신경 줄기 세포 배양에서 세포 상태를 식별하고 강화하는 전략을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 줄기 세포(NSC)는 성인 신경 발생이라는 과정을 통해 성인 뇌에서 신생아 뉴런을 분열하고 생성합니다. 성체 NSC는 주로 정지 상태로, 세포 주기(G0)를 벗어났지만 환경에 계속 반응하는 가역적 세포 상태입니다. 성인 신경 발생의 첫 번째 단계에서 정지 NSC(qNSC)는 신호를 수신하고 활성화하여 정지 상태를 벗어나 세포 주기로 다시 진입합니다. 따라서 NSC 정지 및 정지 종료의 조절 요인을 이해하는 것은 성인 신경 발생을 목표로 하는 미래 전략에 매우 중요합니다. 그러나 NSC 정지에 대한 우리의 이해는 정지 NSC(qNSC) 및 활성화된 NSC(aNSC)를 식별하는 데 있어 기술적 제약으로 인해 제한됩니다. 이 프로토콜은 NSC 자가형광을 이미징하여 in vitro culture에서 생성된 qNSC 및 aNSC를 식별하고 강화하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 먼저, 이 프로토콜은 컨포칼 현미경을 사용하여 qNSC 및 aNSC의 자가형광 마커를 식별하여 자가형광 강도를 사용하여 NSC 활성화 상태를 분류하는 방법을 설명합니다. 둘째, 이 프로토콜은 FACS(Fluorescent Activated Cell Sorter)를 사용하여 NSC 활성화 상태를 분류하고 자가형광 강도를 사용하여 qNSC 또는 aNSC에 대한 샘플을 농축하는 방법을 설명합니다. 셋째, 이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 단일 세포 분해능에서 형광 수명 이미징(FLIM)을 수행하고, NSC 활성화 상태를 분류하고, 자가형광 강도와 형광 수명을 모두 사용하여 정지 출구의 역학을 추적하는 방법을 설명합니다. 따라서 이 프로토콜은 NSC 정지 및 정지 종료를 연구하기 위한 라이브 셀, 레이블이 없는 단일 셀 분해능 툴킷을 제공합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

비소세포항(NSC)은 성인 신경발생(adult neurogenesis) 1,2이라고 하는 과정을 통해 많은 유기체에서 일생 동안 신생아 뉴런을 생성합니다. 신생아 뉴런을 생산하기 위해서는 먼저 qNSC가 활성화되어야 하며, 세포주기에 들어가 개체군을 확장하고 신경 전구 세포를 생산해야 합니다 3,4,5,6. NSC 정지에 대해 많이 알려져 있지만, NSC 정지의 동인과 레귤레이터를 완전히 식별할 수 있는 능력은 qNSC와 활성화로의 전환을 격리 및 식별하기 위해 존재하는 기술적 제한으로 인해 제한됩니다. 자가형광 이미징은 이전에 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NAD(P)H) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)7,8와 같은 자가형광 대사 보조인자의 광학적 특성에 영향을 미치는 대사 리모델링을 해결함으로써 미세아교세포 및 T 세포와 같은 다양한 세포 유형의 세포 상태 변화를 연구하는 데 성공했습니다. NSC는 정지 출구 9,10,11,12,13,14를 겪으면서 대사 네트워크를 실질적으로 리모델링합니다. 따라서, 이러한 차이점을 활용하기 위해, NSC가 정지상태(15)를 벗어날 때 발생하는 대사 리모델링에 기인한 자가형광의 변화를 감지함으로써 NSC 활성화 상태를 식별하고 강화하는 데 최근 NSC 자가형광이 사용되었다. 이미징 자가형광은 몇 가지 기술적 이점을 제공합니다: i) 세포 행동에 영향을 줄 수 있는 외인성 라벨을 추가할 필요가 없습니다. ii) NSC 활성화 상태에 대한 고해상도 단일 셀 데이터를 제공할 수 있습니다. iii) 셀 7,16의 파괴를 요구하지 않습니다. 이 프로토콜은 NSC 정지 및 활성화된 세포 상태를 연구하기 위해 NSC 자가형광을 활용하기 위한 세 가지 전략을 간략하게 설명합니다15.

최근에, 해마의 하입계 영역에서 6주 된 수컷 마우스에서 분리한 NSC를 배양하고 가역적으로 시험관 내 10,13,17,18,19,20,21 정지시킨 결과, 400-600nm 사이에서 여기하고 500-700nm 사이를 방출하는 반점 자가형광(PAF) 수치가 증가한 것으로 밝혀졌습니다. 이 신호는 활성화된 순환 NSC15와 비교하여 qNSC에 특정했습니다. 추가 항체 마커 또는 리포터를 사용하지 않고 이 두 집단을 시각적으로 분리할 수 있는 기능은 qNSC 및 정지 출구의 특성에 대한 많은 실험적 질문에 유용합니다. 따라서 먼저 이 프로토콜은 NSC 활성화 상태를 식별하는 데 사용할 수 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 qNSC에서 PAF를 이미지화하는 전략을 설명합니다. 둘째, 이 프로토콜은 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)를 사용하여 PAF를 검출하는 전략을 설명하고 이 신호를 기반으로 정렬하여 qNSC 또는 aNSC를 강화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전략은 셀 상태에 따라 NSC를 클러스터링하고 분리하는 데 사용할 수 있는 하나의 측정값을 제공합니다.

NSC를 별개의 상태뿐만 아니라 정지 출구를 통해 완전 활성화로 전환하는 과정에서도 NSC를 분리하는 고해상도 방법을 개발하기 위해 다광자 현미경을 사용하여 형광 수명 이미징(FLIM)을 수행하여 NAD(P)H(채널 1이라고 함) 및 녹색 자가형광(채널 2라고 함, qNSC에서 FAD 자가형광 및 PAF를 모두 감지함) 수명과 강도를 함께 이미징했습니다. 이 접근법은 세포 내 분자의 광학적 특성이 물리적 특성16,22에 따라 달라진다는 사실을 이용합니다. 예를 들어, NAD(P)(NAD 및 NADP는 광학적으로 구별할 수 없으므로 NAD(P)는 두 종을 모두 지칭하는 데 사용됨)는 산화된 상태에서는 자가형광이 아니지만 환원된 상태(NAD(P)H)23에서는 자가형광입니다. 또한, 효소에 대한 결합 상태와 같은 자가형광 분자의 추가적인 물리적 특성은 형광 수명 이미징 7,22,24를 수행하여 외삽할 수 있습니다. 예를 들어, NAD(P)H는 효소22에 결합하지 않을 때 형광 수명이 더 짧습니다. 수백 가지의 대사 반응에 관여하는 NAD(P)H와 같은 자가형광 분자는 세포가 다른 상태나 세포 거동을 진행하면서 다르게 사용되므로, 이러한 변화는 자가형광 수명을 감지하는 다광자 현미경을 사용하여 검출하고 정량화할 수 있습니다23. 자가형광의 풍부함 또는 강도와 함께 이러한 측정은 NSC를 한 세포 상태 또는 다른 세포 상태로 분리하고 상태 간의 동적 전이를 통해 다차원 정보를 제공합니다. 셋째, 이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 채널 1(NAD(P)H) 및 채널 2(PAF) 신호의 FLIM 및 강도 측정을 수행, 분석 및 해석하는 방법을 설명합니다. 요약하면, 이 프로토콜은 NSC 상태에 대한 고해상도 단일 셀 데이터를 제공하는 NSC 정지를 연구하기 위한 라이브 셀, 레이블이 없는 툴킷을 설명합니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 모든 절차는 위스콘신-매디슨 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 컨포칼 현미경을 사용하여 qNSC 및 aNSC의 PAF를 이미지화하여 NSC 세포 상태를 식별합니다.

  1. 1차 NSC 배양에서 in vitro 에서 qNSC 및 aNSC를 생성합니다.
    1. 팽창을 위한 증식 배지에서 성인 마우스 뇌에서 정제된 배양 NSCs(표 1)18,20,21. 따라서 기본적으로 in vitro NSC 배양은 aNSC입니다.
    2. qNSC를 생성하려면 다음 프로토콜을 사용하여 코팅된 유리 제품에 aNSC를 도금한 다음 qNSC 배지로 처리하여 3일 동안 정지를 유도합니다.
    3. 먼저 접시 바닥을 덮기에 충분한 폴리-L-오르니틴(PLO, 플라스틱의 경우 물 10mg/mL, 유리의 경우 물 50mg/mL) 용액(1cm2 이미징 큐벳 웰의 경우 ~150μL 사용)으로 코팅하여 NSC를 부착하기 위한 오일 이멀젼 대물렌즈에 적합한 굴절률이 있는 유리 제품을 준비합니다.
    4. PLO 용액을 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척합니다.
    5. 접시 바닥을 덮기에 충분한 라미닌 용액(5mg/mL)을 PBS에 코팅하고(1cm2 이미징 큐벳 웰의 경우 ~150μL 사용) 37°C에서 최소 3시간 동안 또는 밤새 배양합니다.
    6. 라미닌 용액을 제거한 다음 접시 바닥을 덮을 수 있는 충분한 배양 배지를 추가합니다(1cm2 이미징 큐벳의 경우 ~150μL 사용).
    7. 실온(RT, ~25°C)에서 120 x g 에서 4분 동안 aNSC(단층 또는 신경구로 시작할 수 있음)를 원심분리하여 트립신화를 위해 세포를 준비합니다.
    8. 이전 단계에서 펠릿화된 aNSC를 37°C에서 5분 동안 100μL의 트립신 혼합물에 트립신화한 다음 200μL의 트립신 억제제 혼합물로 트립신화를 퀀칭합니다(표 1).
    9. NSC를 2분 동안 그대로 둔 다음 10회 위아래로 피펫팅하여 기계적으로 분류합니다.
    10. 5mL의 aNSC 배지를 추가하고 120 x g 에서 4분 동안 세포를 회전시킵니다.
    11. NSC 배지 1mL에 NSC를 재현탁하고 세포를 NSC 배지에 10%-20% 합류하도록 플레이트합니다. 예를 들어, ~5,000개의 세포를 150μL 배지가 있는 1cm2 이미징 큐벳 웰의 한 웰에 플레이트합니다.
    12. aNSC가 접시 표면에 부착되도록 24시간 동안 기다린 후 aNSC 매체를 제거하고 접시 바닥을 덮을 수 있는 충분한 qNSC 매체로 교체합니다(1cm2 이미징 큐벳의 경우 ~150μL 사용; 표 1- 앞서 설명한 바와 같이 10,13,17,18)에서 정지가 유도될 우물에서.
    13. 최소 2일에 한 번씩 aNSC 및 qNSC 매체를 교체합니다. qNSC 매질에서 3일이 지나면 NSC는 정지 상태이며 이미징 실험에 사용할 수 있습니다.
  2. 컨포칼 현미경을 사용하여 in vitro에서 실시간 qNSC 및 aNSC를 이미징할 수 있습니다.
    알림: 각 현미경에는 독점 소프트웨어가 있습니다. 따라서 유사한 작업을 수행하여 특정 현미경을 구성하여 다음 단계를 수행하십시오. 이 프로토콜은 NIS-Elements에서 작업하기 위한 지침을 제공합니다.
    1. 자가형광 이미징을 위해 컨포칼 현미경을 구성합니다.
      1. 405 레이저를 클릭하고 405 레이저 메뉴의 방출 창에 입력합니다. TD를 클릭하여 투과광 이미지를 수집하고 HV 값을 설정하여 샘플을 시각화합니다.
      2. 레이저 출력을 3.5%로 설정하고 게인을 75로 설정합니다. 확대/축소를 2로 설정합니다. 컨포칼 스캐닝 매개변수를 설정하고, Pixel Dwell을 0.5로 설정하고, 해상도를 2048 x 2048 픽셀로 설정합니다.
    2. brightfield를 사용하여 초점을 맞추는 ~60x 오일 이멀젼 대물렌즈 아래에 세포에 초점을 맞춥니다.
    3. 아이 포트(Eye Port)를 클릭하여 컨포칼 스캐닝 모드로 전환하여 광 경로가 이제 스캔 헤드로 이동하고 광 경로에 필터 큐브가 없는지 확인합니다.
    4. PAF는 qNSC에서 풍부하며 널리 여기될 수 있고 방출할 수 있습니다( 그림 1 참조). 그림 1 을 가이드로 사용하여 시스템의 기능에 따라 최상의 광학 구성을 선택하십시오. 가장 강력하고 깨끗한 신호를 얻으려면 ~400-500nm 사이의 레이저로 여기하고 ~580-620nm를 수집하고 ~60x 오일 이멀젼 대물 렌즈를 사용하십시오.
      참고: 자가형광 이미징은 일반적인 이미징 실험에 필요한 것보다 더 높은 레이저 출력이 필요합니다. PAF와 함께 다른 자가형광 분자 또는 다른 라벨을 이미징하는 경우, 자가형광 채널로의 블리드스루(bleed-through)를 방지하기 위해 광학 구성을 신중하게 설계하십시오.
    5. qNSC 및 aNSC에서 자가형광 이미지를 획득합니다. Scan(스캔)을 클릭하고 이미지에 초점을 맞춘 다음 Capture(캡처)를 클릭합니다. 최상의 이미지를 얻으려면 세포의 세포질(세포 전체에 확산된 희미한 자가형광 기반)에 초점을 맞춘 단면 이미지를 수집하여 각 세포의 대표 단면을 얻을 수 있습니다.
    6. 서로 다른 이미지를 직접 비교하려는 경우 동일한 광학 구성(예: 동일한 레이저 출력)과 이미지 샘플을 같은 날에 사용하십시오.
    7. 레이저와 검출기의 정확한 출력은 각 특정 시스템에 따라 다릅니다. 낮은 레이저 출력을 사용하여 시작한 다음 신호가 포화되지 않고 감지될 때까지 천천히 출력을 높입니다.
  3. 생체 내 실시간 qNSC 및 aNSC 에서 PAF를 분석합니다.
    1. qNSC 또는 aNSC에서 자가형광 이미지를 획득한 후 ImageJ25에서 파일을 열어 이미지를 정량화합니다.
    2. qNSC/aNSC 자동 형광 이미지에서 Process > Filters > Gaussian Blur (Sigma: 2) 옵션을 사용하여 고르지 않은 픽셀을 매끄럽게 만듭니다.
    3. Image > Adjust > Threshold를 사용하여 PAF를 나타내는 픽셀을 선택하고(배경 픽셀 제거) Apply를 클릭합니다. 직접 비교할 모든 이미지에 대해 동일한 임계값 매개변수를 사용합니다.
    4. Process > Binary > Watershed를 사용하여 가까운 공간적 근접성에서 PAF를 분리합니다.
    5. 컴퓨터 마우스를 사용하여 명시야 이미지를 보거나 세포의 세포질 전체에 균일하게 존재하는 미만성 자가형광을 확인하여 결정된 세포 주변의 관심 영역(ROI)을 그립니다.
      참고: 일반적으로 얇은 주변 돌기를 제외하고 핵을 포함하는 것이 좋으며, 이러한 위치에는 자가형광이 일반적으로 존재하지 않으므로 분석을 방해하지 않습니다.
    6. 입자 분석 > 분석을 사용하십시오 (크기 : 0.1-무한대 μm; Circularity: 0-1) summarize가 선택되어 있습니다.
      참고: 그런 다음 ImageJ는 관심 영역의 입자에 대한 데이터가 포함된 출력 창을 생성하여 각 셀의 PAF 수를 표로 만들 수 있습니다. 다른 형광 분자는 이미징 PAF와 쌍을 이룰 수 있습니다. 그러나 PAF는 상대적으로 희미한 신호이므로 다른 형광단이 PAF 채널로 블리딩되지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 일반적으로 600+ nm를 흡수하고 650+ nm를 방출하는 형광단은 LipidSpot 610과 같은 이미징 PAF와 쌍을 이룰 수 있습니다.

2. FACS를 사용하여 자가형광을 기반으로 배양된 NSC에서 NSC 활성화 상태를 강화합니다.

  1. 섹션 1에 설명된 대로 qNSC 및 aNSC를 생성합니다.
  2. 자가형광을 기반으로 실시간 qNSC와 aNSC의 혼합물을 분류합니다.
    참고: 예를 들어, 이 프로토콜은 qNSC와 aNSC를 1:1 비율로 혼합하여 생성된 샘플에서 aNSC 또는 qNSC를 강화하는 방법에 대해 설명합니다.
    1. 트립신화 및 세포 분류에 앞서 10μM 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU, 세포 주기의 S상과 같이 DNA를 합성하는 세포에 통합되는 티미딘 유사체)을 세포 배양 배지에 1시간 동안 첨가하여 S상을 통해 진행되는 세포를 라벨링합니다.
    2. 1.1.8단계에서 설명한 대로 qNSC 및 aNSC를 트립시화하고 0.5mL의 FACS 완충액(표 1)에 재현탁한 다음 얼음 위에 놓습니다.
      참고: qNSC는 접시에 강하게 부착됩니다. 상대적으로 더 높은 합류점에서 qNSC는 접시에서 기계적으로 분리될 수 있습니다. 그러나 qNSC가 상대적으로 낮은 합류점에 있거나 피펫팅으로 기계적으로 접시에서 제거하기 어려운 경우 trypsin을 사용하여 접시에서 제거합니다.
      1. qNSC에서 배양 배지를 제거하고 접시 바닥을 덮기에 충분한 0.25% 트립신을 추가하고(1cm2 이미징 큐벳 웰의 경우 ~150μL 사용) 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
      2. 배양 후, 첨가된 트립신의 부피와 동일한 각 세포 유형에 해당하는 배지를 첨가하여 트립신 반응을 소멸시킵니다. 수집 및 원심분리 전에 접시에서 세포를 기계적으로 분리합니다.
    3. ~130μm 노즐을 사용하여 유세포 분석기 또는 FACS를 사용하여 기기의 기능을 기반으로 하는 광학 조건으로 qNSC 및 aNSC를 분석하고 그림 1과 같이 PAF를 감지합니다. 예를 들어, 405nm 레이저를 사용하여 샘플을 여기시키고 580-620nm 필터를 사용하여 검출합니다.
    4. 데이터 파일에서 최소 10,000개의 singlet qNSC 및 aNSC를 수집한 다음 이를 사용하여 qNSC 또는 aNSC를 강화하기 위한 게이트를 설계합니다. 예를 들어, aNSC:qNSC(1:1) 혼합 샘플에서 자가형광 강도를 기반으로 NSC의 상위 25% 또는 하위 25%를 수집하도록 게이트를 설정합니다.
    5. 위에서 설명한 대로 더 밝거나 더 어두운 자가형광으로 단일항을 분류하도록 게이트를 설정한 후 세포를 NSC 배지(10,000 cells/cm2, 1.1.3단계 참조)로 채워진 PLO, 라미닌 코팅 웰로 분류합니다.
    6. FACS에 따라 NSC가 인큐베이터에서 3시간 동안 그대로 두십시오. 접시 바닥을 덮기에 충분한 4% 파라포름알데히드로 처리하여 세포를 고정합니다(1cm2 이미징 큐벳 웰의 경우 ~150μL 사용). RT에서 15분 동안
      참고: 세포에서 EdU를 시각화하려면 EdU 검출을 위한 상용 키트를 구하고 제조업체에서 권장하는 프로토콜을 따르는 것이 가장 쉽습니다.
    7. 먼저 RT에서 15분 동안 PBS에서 0.25% 트리톤으로 처리하여 세포를 투과시킵니다.
    8. 다음으로, EdU 염색액으로 실온에서 30분 동안 세포를 처리합니다.
      참고: EdU 염색 용액의 정확한 조성은 시약의 출처에 따라 다르지만 대략적으로 반응 완충액, 반응 완충액 첨가제, 황산구리, 알킨 또는 아지드 개질 분자로 구성됩니다. 권장 키트에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
    9. EdU를 시각화하기 위해 염색 한 후 PBS로 샘플을 10 분 동안 3 번 세척합니다.

3. 다광자 현미경을 사용하여 채널 1 및 채널 2 자가형광을 검출하고 시험관 내 NSC에 대해 FLIM을 수행하여 NSC 세포 상태 집단 및 전이를 식별합니다.

알림: 각 현미경에는 독점 소프트웨어가 있습니다. 따라서 유사한 작업을 수행하여 특정 현미경을 구성하여 다음 단계를 수행하십시오. 이 프로토콜은 Prairie View에서 작업하기 위한 지침을 제공합니다.

  1. 섹션 1에 설명된 대로 qNSC 및 aNSC를 생성합니다.
  2. 형광 수명 이미징을 위해 다광자 현미경을 설정합니다.
    1. 배율이 40x 이상(~1.15NA)인 대물렌즈를 사용하십시오.
    2. 다광자 현미경을 조정 가능한 극초단 레이저, 720nm 장역 통과 이색성, 갈륨 비소 인화물(GaAsP) 광전자 증배관(PMT), 시간 상관 단일 광자 계수 전자 장치 및 아날로그 전력계와 함께 사용하십시오.
    3. 채널 1 이미징의 경우 조정 가능한 레이저를 750nm로 설정하고 440/80nm 방출 필터 큐브를 사용합니다. 채널 2를 이미징하려면 레이저를 890nm로 설정하고 550/100nm 방출 필터 큐브를 사용합니다.
      알림: PMT를 켜기 전에 실내 조명을 끄십시오.
  3. 기기 응답 기능
    1. 측정된 붕괴에서 기기의 시간적 반응을 설명하기 위해 분쇄된 요소 결정을 이미징하여 기기 응답 함수(IRF)를 캡처합니다.
      참고: IRF는 감쇠 맞춤 곡선을 정확하게 계산하기 위해 감쇠와 컨볼루션됩니다. 획득을 위해 레이저는 890nm로 설정되고 440/80nm 방출 필터 큐브가 사용됩니다. GaAsP PMT는 800의 게인으로 설정되고 포켈(레이저 출력)은 초기에 일반적으로 1로 매우 낮게 설정됩니다.
    2. 결정질 요소가 있는 시야를 선택하고 포켈을 약간 늘립니다(최대 15개까지).
    3. 다음으로, 세포 이미징에 사용되는 것과 동일한 매개변수(CFD) 1 x 104 - 1 x 105, 256 x 256 해상도, 4.8μs로 설정된 체류 시간, 1.5x로 설정된 광학 줌 및 60s 통합 시간을 사용하여 이미지를 획득합니다.
  4. in vitro에서 라이브 qNSC 및 aNSC에서 Channel 1 및 Channel 2 자가형광을 위한 형광 수명 이미징 및 강도 이미징 수행
    1. 이미징할 시야 찾기: 접안렌즈를 사용하여 적합한 시야를 찾고 이미징을 가능하게 하도록 현미경의 샘플에 대한 광 경로를 변경합니다.
      참고: 채널 1 이미지가 먼저 획득된 다음 동일한 시야의 채널 2 이미지가 획득됩니다.
    2. 채널 1 이미지 수집을 위한 설정: Power/Gain 탭을 클릭하고 PMT의 게인을 800으로 설정하고, 2-P Laser 탭을 클릭하고 레이저에 대해 750nm 를 선택하고, 적절한 필터 큐브(440/80nm)가 사용되었는지 확인합니다.
    3. 채널 1 이미지를 수집합니다.
      1. Power/Gain 탭으로 이동하여 Pockels를 30으로 설정한 다음 해당 화면의 Scanning 섹션으로 이동하여 Live Scan을 클릭하여 미리보기 모드를 시작합니다.
      2. 낮은 레이저 출력(3.6mW 미만)에서 좋은 시야를 찾으려면 Pockels를 높입니다. 시야가 발견되면 파워 미터가 포켈 셀 이후의 전력에서 ~3.6mW를 읽고 카운트 레이트 탭의 CFD(Constant Fraction Discriminator)가 1 x 104 - 1 x 105를 측정하도록 Pockels를 조정합니다.
    4. Scanning(스캔) 섹션으로 이동하여 해당 매개변수가 충족되면 Single Scan(단일 스캔)을 클릭합니다. 이렇게 하면 60초에 걸쳐 채널 1 이미지가 획득됩니다.
    5. 채널 2 이미지를 수집하려면 2-P 레이저 탭을 클릭하고 레이저로 890nm 를 선택하고 필터 큐브를 채널 2 방출 큐브(550/100nm)로 교체합니다.
    6. 3.4.3에 설명된 대로 미리보기 모드를 시작하고 파워 미터가 ~7mW를 읽을 때까지 Pockels 를 늘리고 CFD 카운트가 다시 한 번 1 x 104 -1 x 105가 됩니다.
    7. Scanning(스캔) 섹션으로 이동하여 해당 매개변수가 충족되면 Single Scan(단일 스캔)을 클릭합니다. 이렇게 하면 60초에 걸쳐 채널 2 이미지를 획득합니다.
    8. 더 많은 이미지 획득 - 채널 1 및 채널 2 이미지를 획득한 후 새 시야를 찾아 3.4.2 - 3.4.4 단계를 반복합니다. 일반적으로 50~100개의 세포를 이미지화하기 위해 4-6개의 시야를 수집하는 것은 실험의 한 가지 조건에 충분합니다.
      알림: mCherry는 채널 1 및 채널 2 채널로의 블리드 스루 없이 추가 형광 라벨로 사용할 수 있습니다.
  5. 형광 수명 이미지를 분석합니다.
    1. 3.5.2-3.1.14 단계에 따라 SPCImage에서 형광 수명 이미지에 대한 붕괴 매트릭스를 생성합니다.
      참고: 추가 정보는 온라인에서 무료로 제공되는 업데이트된 핸드북26을 참조하십시오.
    2. SPCImage를 열고 섹션 3.3에 수집된 IRF FLIM 이미지를 엽니다.
    3. 히스토그램의 검은색 세로 막대를 IRF 감쇠 곡선으로 제한하도록 조정합니다. 상단 메뉴 표시줄에서 IRF > Copy to Clipboard(클립보드에 복사)를 클릭합니다.
    4. 섹션 3.4에서 얻은 분석할 데이터 세트 내에서 FLIM 이미지 파일을 엽니다.
    5. 상단 메뉴 표시줄에서 IRF > 클립보드에서 붙여넣기를 클릭합니다.
    6. 소프트웨어의 오른쪽 하단에서 구성 요소를 2로 설정합니다.
    7. 소프트웨어의 상단 메뉴 표시줄에서 Options > Model을 클릭합니다. 그런 다음 Fit Method에 대해 MLE, Spatial Binning을 to Square, Threshold to Peak에 대해 MLE를 선택하고 Settings에서 Multiexponential Decay를 선택합니다.
    8. 소프트웨어의 왼쪽 하단에서 excitation 직후 광자 수의 피크에서 대표 세포질 픽셀에서 광자 수가 100 이상이 될 때까지 Bin 을 늘립니다.
    9. 소프트웨어의 왼쪽 하단에서 임계값을 설정합니다. 채널 1의 경우 임계값 "50"을 사용합니다. 채널 2의 경우 임계값 "0"을 사용합니다.
    10. 소프트웨어의 상단 메뉴 표시줄(이 프로토콜은 버전 8.3 작동 방법을 설명함)에서 Calculate > Decay Matrix를 클릭합니다.
      참고: 이미지 전체에서 Chi2 값이 ~0.8-1.2인지 확인합니다. 이는 이분급수적 붕괴 모델링을 검증하여 데이터가 견고하다는 것을 확인합니다.
    11. 상단 메뉴 표시줄에서 File > Save를 클릭합니다.
    12. 소프트웨어의 상단 메뉴 표시줄에서 File > Export를 클릭하고 다음을 내보냅니다.
      색상 코드 값, T1, T2, Chi2, 픽셀 강도, A1[%], A2[%] 및 색상 코드 이미지(범례 포함)
      참고: 이제 SPCImage는 지정된 채널의 모든 이미지를 분석하는 일괄 처리를 수행하도록 설정됩니다(채널 1 FLIM 이미지를 함께 분석한 다음 채널 2 FLIM 이미지에 대해 3.5.2단계부터 반복).
    13. 일괄 처리를 수행하려면 계산 > 일괄 처리를 클릭하고 처리할 FLIM 이미지를 선택합니다.
    14. 상단 메뉴 모음에서 File > Export > Batch Export 를 클릭하고 내보낼 감쇠 매트릭스(이전 단계에서 생성됨)를 선택합니다.
    15. CellProfiler를 사용하여 3.5.16-3.5.24단계에 따라 세포질 마스크를 만듭니다.
      참고: 이렇게 하기 위해 핵은 수동으로 채널 1 강도 이미지 주변에 있으며, 여기서 핵은 검은색이고 명확하게 볼 수 있습니다. 그런 다음 CellProfiler 파이프라인 manual_segmentation.cpproj27 (보충 파일 1)은 핵 마스크의 지시에 따라 전체 세포 및 세포질 마스크를 자동으로 생성합니다. 또는 mCherry로 핵을 라벨링하고 채널 1 및 채널 2 자가형광과 함께 이미징하여 핵 식별을 자동화할 수 있는 기능을 제공할 수 있습니다. 그러나 많은 기존 핵 염료는 자가형광 채널로 스펙트럼 블리딩되므로 이 기술과 호환되지 않습니다.
    16. R Studio에서 R_ASCtoTIFF.rmd27 (보조 파일 2)을 사용하여 X_photons.asc 파일을 변환합니다. 여기서 X는 채널 1 이미지 집합에서 획득한 이미지의 이름을 TIF 파일로 변환합니다.
    17. Cell Profiler를 열고 manual_segmentation.cpproj를 엽니다.
    18. 파이프라인 상단의 이미지 단계에서 3.5.16단계에서 생성된 채널 1 광자 TIF를 로드합니다.
    19. SaveImages라는 파이프라인의 아래쪽 3단계에서 CellProfiler가 생성할 마스크의 저장 경로를 설정합니다.
    20. CellProfiler의 왼쪽 하단에 있는 테스트 모드 시작 을 클릭합니다.
    21. CellProfiler의 왼쪽 하단에 있는 실행 을 클릭합니다. CellProfiler가 IdentifyObjectsManually 단계에 도달하면 현재 처리 중인 채널 1 이미지를 표시하는 창이 나타납니다.
    22. 키보드에서 F 키를 클릭한 다음 마우스 왼쪽 클릭 버튼을 누른 상태에서 한 세포의 핵 추적을 수동으로 그립니다. 핵을 추적한 후 마우스의 왼쪽 클릭 버튼을 놓습니다. 이미지의 모든 셀에 대해 이 단계를 반복합니다.
    23. 강도 이미지가 있는 팝업 창의 오른쪽 하단에 있는 Done(완료 )을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 이제 파이프라인을 완료하고 세포질, 핵 및 전체 세포 마스크를 내보냅니다.
    24. 왼쪽 하단에서 다음 이미지 세트를 클릭하고 모든 채널 1 TIF 이미지에 대해 3.5.21-3.5.23단계를 반복합니다.
    25. R 스크립트(Integrate decay matrixs and cytoplasmic masks.rmd)를 사용하여 3.5.2-3.5.14단계에서 생성된 붕괴 매트릭스와 3.5.15-3.5.24단계에서 생성된 세포질 마스크를 통합하여 3.5.26-3.5.30단계에 따라 각 세포의 세포질에 대한 평균 형광 수명 이미징 변수를 얻습니다.
    26. 스프레드시트(예: Microsoft Excel)를 사용하여 3개의 열이 있는 test_key27 [예: 보충 파일 3]이라는 .csv 문서를 만듭니다.
    27. 열의 제목을 Folder, NADH 및 FAD로 지정합니다. 표를 작성하여 폴더의 폴더 위치를 나열한 다음 NADH 및 FAD의 이미지 제목 접두사를 각각 나열하여 각 채널 1 이미지를 각 채널 2 이미지에 연결합니다(예제 데이터 - 표 2 참조).
  6. R Studio에서 Integrate decay matrixs and cytoplasmic masks.rmd27(Supplementary File 4)을 엽니다.
    1. 스크립트에 주석이 추가된 대로 작업 디렉토리 설정, 채널 1 파일 위치, FAD 파일 위치, 마스크 파일 위치, 출력 파일 위치 및 이름 파일 경로를 설정합니다.
    2. 전체 스크립트를 실행합니다. 스크립트가 성공적으로 완료되면 메타데이터 및 평균 FLIM 변수를 포함한 출력 파일이 생성됩니다.
    3. 자가형광 FLIM data.rmd27 (보충 파일 5)을 사용하거나 다른 분석 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행합니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NSC 세포 상태를 분리하기 위한 공초점 자가형광 이미징(그림 1)
NSC 활성화 상태를 해결하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하기 위해, 앞서 설명한 바와 같이 활성화 매체 또는 정지 매체를 사용하여 시험관에서 qNSC 및 aNSC를 생성했습니다 10,13,17,18. NSC에서 PAF를 검출하기 위해 실시간 qNSC 및 aNSC를 컨포칼 현미경(예: 405nm, Em: 580-620nm)에서 동일한 노출을 사용하여 이미징했습니다. qNSC는 aNSC에 비해 PAF 수가 더 많았습니다(그림 1A,B). 이 결과는 자가형광 특성을 qNSC 및 aNSC의 세포 상태를 식별하기 위한 마커로 사용하는 방법을 보여줍니다.

자가형광을 사용한 NSC 세포 상태의 FACS 농축(그림 2)
FACS를 사용하여 세포 주기 상태를 농축하기 위해 이 프로토콜에 설명된 대로 in vitro 10,13,17,18,19를 생성하고 유세포분석기에서 트립신화 및 분석 전에 1시간 동안 EdU로 사전 라벨링하여 S상을 통해 진행되는 세포를 라벨링했습니다. 그런 다음 qNSC와 aNSC를 유세포 분석으로 개별적으로 또는 1 qNSC:1 aNSC의 비율로 혼합하여 분석했습니다(그림 2


figure-results-1

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 NSC에서 자가형광 신호의 이미징을 통해 시험관 내에서 NSC 세포 상태를 분류할 수 있는 살아있는 세포, 무표지, 비파괴, 단일 세포 분해능 기술을 설명합니다. 이 접근법은 NAD(P)H와 같은 대사 보조인자의 광학적 특성에 영향을 미치는 NSC 정지 종료 중에 발생하는 대사 변화를 감지하고 NSC 정지를 연구하기 위해 기존 기술에 비해 많은 이점을 제공합니다. 예를 들어, EdU와 같은 세포 주기 마커를 사용한 라벨링과 같이 qNSC 및 aNSC를 연구하기 위한 많은 기존 기술에는 샘플 고정이 필요합니다. 현재 살아있는 NSC를 연구할 수 있는 방법은 일반적으로 형광 단백질 인코딩 전이유전자를 생성하는 외인성 표지의 도입을 필요로 하기 때문에 더욱 제한적입니다. 이러한 도구는 생성하는 데 필요한 리소스와 많은 기술적 주의 사항이 모두 제한되어 있습니다. 예를 들어, 중간 필라멘트 단백질인 nestin 및 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)는 일반적으로 qNSC 및 aNSC의 마커로 사용됩니다(12,13,18,28,29). 그러나, nestin과 GFAP는 qNSC와 aNSC 간에 차등적으로 발현되는 것으로 알려져 있다(12,13,18,28,29). 또한 자가형광 이미징은 고해상도 단일 세포 데이터를 제공하여 세포 집단의 대량 분석으로 마무리되는 실험에서 해석하기 어렵거나 손실되는 단일 세포 이질성을 밝힐 수 있습니다.

그러나 자가형광 이미징에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 많은 자가형광 신호는 세포 고정 시 손실됩니다. 따라서 자가형광 이미징은 주로 살아있는 세포에 대한 연구로 제한됩니다. 또한 자가형광 이미징은 자가형광 채널로 출혈할 수 있는 외인성으로 도입된 형광단의 부족에 의존합니다. 많은 fluorophores가 특정 상황에서 autofluorescence 이미징과 호환될 수 있지만, autofluorescence 이미징을 많은 기존 도구와 결합하는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다. 살아있는 세포 이미징도 광독성을 유발할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용한 이미징의 한 반복은 NSC 생존율을 감소시키기에 충분한 광독성을 유도하지 않습니다. 그러나 하루에 여러 번 더 빈번한 간격으로 시간 경과에 따라 세포를 반복적으로 이미징하면 상당한 광독성이 발생할 수 있으므로 NSC 정지를 연구하기 위한 실행 가능한 전략이 아닙니다. 마지막으로, 자가형광 이미징을 사용하여 해마 또는 측심실에서 6주 된 수컷 마우스의 NSC를 연구할 수 있지만, 이 기술이 다른 출처, 연령 또는 기타 줄기세포 유형의 NSC를 연구하는 데 얼마나 광범위하게 사용될 수 있는지는 불분명합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 또한 이전에 확립된 프로토콜 10,13,17,18,19를 사용하여 qNSC 및 aNSC의 시험관 내 정확한 생산을 가정합니다. 이 프로토콜의 결과를 재현하기 어려운 경우 앞에서설명한 대로 10,13,17,18,19와 같이 qNSC 및 aNSC의 다양한 마커의 존재 여부를 조사하여 qNSC 및 aNSC가 올바르게 생성되고 있는지 확인합니다. 종합하면, 자가형광 이미징은 qNSC 및 aNSC를 식별하고 NSC 정지 출구를 연구하기 위한 새로운 기술적 접근 방식을 제공합니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UW-Madison 유세포 분석 코어(P30 CA014520 및 1S10RR025483-01)와 Moore 연구소 및 UW-Madison 커뮤니티 구성원의 의견에 감사드립니다. NIH T32 T32GM008688(C.S.M.에), AFAR의 Diana Jacobs Kalman Fellowship(C.S.M.에), Wisconsin Graduate Fellowship(C.S.M.에), DP2 NIH New Innovator Award(1DP2OD025783, D.L.M.에), Vallee Scholar Award(D.L.M.에), NIH 1R56NS130450(D.L.M 및 M.C.S.에), R01 CA185747 (MCS에), R01 CA205101 (MCS에), R01 CA211082 (MCS에) 및 National Science Foundation Grant No. CBET-1642287 (MCS에).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40x 물 대물 렌즈NikonMRD77410Part 3의 다광자 현미경에 사용되는 대물 렌즈
8 웰 큐벳Ibidi80826-90aNSC / qNSC 이미징 용
아날로그 파워 미터ThorlabsPM100APart 3의 다광자 현미경에 사용
항생제 - 항진균제 (100X) (PSF)Thermo Fisher15240062NSC 배지 용 항생제
B-27Invitrogen17504044NSC 매체 용 영양 보충제
BMP4Fisher Scientific5020BP010정지 유도
인자 소 혈청 알부민시그마A4919-25GBMP4
카멜레온 초고속 레이저CoherentN/A에서 다광자 현미경
에 사용Part 1
DMEM/F-12에 사용되는 Nikon C2 현미경(GlutaMAX 제외)NSC용Invitrogen11320033
DNAseSigmaD5025-15KU는 트립신 억제제에 추가
됨 EdU 분석 키트세포 배양을 위한InvitrogenC10337
EGFPeproTechAF-100-15-500UGNSC 배지용 성장 인자
FGFPeproTech100-18BNSC 매체용 성장 인자
형광 활성화 세포 분류기BDFACSAriaFluorescent Activated Cell Sorter Part 2에 사용
HeparinSigmaH3149-50KUNSC 매체용 첨가제
L-15Invitrogen21083027트립신 억제제 용액 준비용
LamininSigmaL2020-1MG유리 제품 코팅용
Nikon TiE 도립 현미경NikonN/A에 사용되는 현미경 프레임
유리 제품
SPC-150 단일 광자 계수 전자 장치Becker 및 Hickl코팅용 N/A다광자 현미경에 사용
(구 또는 단층으로 성장하는 aNSC의 펠릿을 트립신화하는 경우)Gibco15090046신경구 또는 부착성 aNSCs
트립신(qNSCs 트립신화용)Gibco25200072부착성 qNSCs
트립신 억제제SigmaT6522-100MGaNSC 요소 결정의 트립신화 억제용
SigmaU5128-5GIRF
VerseneThermo Fisher를 수집하는 데 사용됩니다.15040066트립신 준비
레이저 만들기 위해 Part 3 컨포칼 현미경 기본 배지, 증식 분석 Part 3 PLO Sigma P3655-100MG Part 3 Trypsin의 트립신화

References

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