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방법 논문

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

4.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63111

⸱

2022년 5월 6일

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

이 논문에서

요약

당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.

초록

당뇨병성 망막병증과 같은 후부 절편 안구 질환은 망막의 생리학을 변화시킵니다. 당뇨병성 망막병증은 망막 박리, 혈액-망막 장벽(BRB)의 붕괴, 및 망막 혈관신생을 특징으로 한다. 생체 내 쥐 모델은 망막의 구조와 기능의 변화를 조사하는 데 유용한 실험 도구입니다. 우리는 망막 세포, 망막 혈관 구조 및 손상된 BRB의 형태 학적 변화를 확인하기 위해 쥐 모델에서 세 가지 실험 기술을 제안합니다. 망막 조직학은 다양한 망막 세포의 형태를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 정량적 측정은 망막 세포 수 및 상이한 망막층의 두께 측정에 의해 수행된다. BRB 분해 분석은 BRB의 분해로 인한 혈장에서 유리체 조직으로의 안구 외 단백질의 누출을 결정하는 데 사용됩니다. 형광 혈관 조영술은 FITC-덱스트란 염료를 사용하여 망막 혈관 구조를 시각화하여 혈관 신생 및 혈관 누출을 연구하는 데 사용됩니다.

서론

당뇨병성 망막병증(DR)은 진성 당뇨병의 가장 복잡한 이차적 합병증 중 하나이다. 또한 전 세계 노동 연령 인구에서 예방 가능한 실명의 주요 원인이기도합니다. 32.4 만 명의 시각 장애인에 대한 최근의 메타 분석에서 830,000 (2.6 %)의 사람들이 DR1로 인해 시각 장애인이었습니다. 당뇨병으로 인한 시력 손실의 비율은 2015 년 전 세계적으로 1.06 % (0.15-2.38)로 7 위를 차지했습니다 2,3.

당뇨병성 망막병증은 후부 안구 조직의 혈관 이상에 의해 진단된다. 임상적으로, 망막에서의 혈관화에 기초한 비증식성 DR (NPDR) 및 증식성 DR (PDR)의 두 단계로 나뉘어진다. 고 혈당증은 망막의 신경 변성4,5, 염증6,7 및 미세 혈관 구조8에 관련된 여러 경로를 암시하기 때문에 DR의 강력한 조절제로 간주됩니다. 고혈당증으로 인해 유도되는 다중 대사 합병증에는 고급 당화 최종 생성물 (AGEs), 폴리올 경로, 헥소사민 경로 및 단백질 키나아제-C 경로의 축적이 포함된다. 이러한 경로는 당뇨병성 망막병증의 여러 단계에 기초한 세포 증식(내피 세포), 이동(혈관주위세포) 및 아폽토시스(신경 망막 세포, 혈관주위세포 및 내피 세포)를 담당한다. 이러한 대사 변화는 망막 박리, 망막 세포의 손실, 혈액 망막 장벽 (BRB)의 붕괴, 동맥류 및 혈관신생9과 같은 생리적 변화를 일으킬 수 있습니다.

스트렙토조토신 (STZ) 유도 제1형 당뇨병은 당뇨병 발병기전과 그 합병증을 평가하기 위한 쥐에서 잘 정립되고 잘 받아들여지는 관행이다. STZ의 당뇨병 유발 효과는 췌장섬 β 세포의 선택적 파괴에 기인한다10. 결과적으로, 동물들은 인슐린 결핍, 고혈당증, 폴리 딥시아 및 다뇨증을 겪을 것이며, 이들 모두는 인간 유형 1 당뇨병의 특징입니다 11. 심한 당뇨병 유발의 경우, STZ는 성인기에 정맥 내 또는 복강 내 40-65 mg / kg 체중으로 투여됩니다. 약 72 시간 후,이 동물들은 250 mg / dL10,12 이상의 혈당 수치를 나타냅니다.

신경 퇴행, 염증 및 혈관신생으로 인한 망막의 생리적 변화를 이해하려면 실험 동물 모델에서 다양한 기술을 최적화해야합니다. 망막 세포 및 망막 혈관의 구조적 및 기능적 변화는 조직학, BRB 분해 분석 및 형광 혈관조영술과 같은 다양한 기술에 의해 연구될 수 있다.

조직학은 현미경 수준에서 세포, 조직 및 기관의 해부학 연구를 포함합니다. 그것은 세포 / 조직의 구조와 기능 사이의 상관 관계를 수립합니다. 조직 구조의 미세한 변화를 시각화하고 식별하기 위해 몇 가지 단계가 수행되어 건강한 상대와 병든 상대물을 비교합니다13. 따라서 조직학의 각 단계를 세심하게 표준화하는 것이 필수적입니다. 망막 조직학에 관여하는 다양한 단계는 시편의 고정, 표본 트리밍, 탈수, 클리어링, 파라핀 함침, 파라핀 임베딩, 절편화 및 염색 (Hematoxylin and Eosin staining)13,14입니다.

건강한 망막에서, 망막을 가로지르는 분자의 수송은 BRB에 의해 조절되며, 내피 세포와 내측의 혈관주위세포, 그리고 바깥쪽의 망막 색소 상피 세포로 구성됩니다. 그러나, 내부 BRB 내피 세포 및 혈관주위세포는 병든 상태 동안 퇴화하기 시작하고, BRB도 또한 손상된다15. 이러한 BRB 분해로 인해 많은 저분자량 분자가 유리체 및 망막 조직으로 누출됩니다16. 질병이 진행됨에 따라 많은 다른 단백질 분자 (저분자량 및 고분자량)도 항상성 장애로 인해 유리체 및 망막 조직으로 누출됩니다17. 그것은 다양한 다른 합병증과 궁극적으로 황반 부종과 실명으로 이어집니다. 따라서 유리체의 단백질 수준을 정량화하고 건강한 상태와 당뇨병 상태를 비교하면 BRB가 손상되었습니다.

형광 혈관 조영술은 형광 염료를 사용하여 망막과 맥락막의 혈액 순환을 연구하는 데 사용되는 기술입니다. 정맥 내 경로 또는 심장 주사를 통해 플루오레세인 염료를 주입하여 망막과 맥락막의 혈관 구조를 시각화하는 데 사용됩니다18. 염료가 주입되면 먼저 망막 동맥에 도달하고 망막 정맥에 도달합니다. 염료의 이러한 순환은 일반적으로 염료19의 주입으로부터 5 내지 10분 이내에 완료된다. 당뇨병성 망막증과 맥락막 신생혈관화를 포함한 다양한 후부 절편 안구 질환을 진단하는 것은 중요한 기술이다20. 그것은 정상 및 병든 상태에서 크고 사소한 혈관 구조 변화를 감지하는 데 도움이됩니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 기관 동물 윤리위원회, BITS-Pilani, 하이데라바드 캠퍼스에서 제공하는 모든 동물 보호 지침을 따릅니다.

1. 망막 조직학

  1. 눈의 핵형성 및 고정
    1. 복강내 경로를 통해 주사된 고용량의 펜토바르비탈(150mg/kg)을 사용하여 연령 일치 대조군(14~15주령)과 함께 2~3개월 된 당뇨병성 위스타 수컷 쥐를 안락사시킨다. 감지 가능한 심장 박동은 2-5 분 이내에 사망을 확인하지 못합니다.
    2. 눈의 비강 및 측두엽 부위에 메스 블레이드를 사용하여 절개를하여 눈을 에핵화하십시오. 그런 다음 포셉과 마이크로 가위를 사용하여 가장자리를 따라 자르면 오비탈 소켓에서 눈을 제거합니다.
      참고 : 쥐를 희생하기 전에 고정 솔루션을 준비하십시오.
      주의: 포름알데히드는 피부, 눈, 코 및 호흡기를 자극합니다. 또한 강력한 피부 감작제이기 때문에 암을 유발할 수 있습니다. 장갑을 끼고 후드 아래에서 다루십시오21.
    3. 페트리 접시에 인산완충식염수(PBS) 용액 10mL로 눈을 깨끗이 씻어 혈액을 제거한다. 고정 용액의 쉬운 침투를 위해 눈 주위의 과도한 지방을 제거하십시오.
    4. 포셉의 도움으로 즉시 5mL의 고정 용액에 눈을 넣고 유리 바이알 벽에 붙어 있지 않은지 확인하십시오. 몇 초 동안 부드럽게 저어주고 뚜껑을 적절한 라벨로 교체하십시오. 실온에서 어두운 조건에서 24 내지 48 시간 동안 고정 용액에서 눈을 인큐베이션한다.
  2. 조직의 트리밍
    1. 고정 후, 고정 용액으로부터 눈을 제거하고, PBS 10 mL로 세척하고, 이를 4°C에서 냉각된 PBS 10 mL를 함유하는 페트리 디쉬에 넣는다.
    2. 마이크로 포셉을 사용하여 시신경으로 눈을 잡고 마이크로 가위의 도움으로 파 플라나 에서 닉을 만드십시오. 각막의 전체 여백을 잘라 눈의 앞쪽 컵을 분리하십시오. 포셉을 사용하여 렌즈를 부드럽게 선택하고 버리고 시신경을 자릅니다.
    3. 곡선 마이크로 가위를 사용하여 후부 아이컵의 세로 부분을 만들어 광학 디스크를 통과하여 두 개의 반으로 나눕니다. 카세트 바닥에 놓고 조직에 방해가되지 않고 뚜껑을 올바르게 닫으십시오. 카세트에 조직 샘플 이름과 날짜에 레이블을 지정합니다.
  3. 조직의 탈수, 제거 및 파라핀 함침
    1. 80 mL의 50%, 70%, 90%, 및 100% 에탄올 중에서 점진적으로 전달함으로써 트리밍된 조직을 탈수시킨다. 카세트를 한 농도에서 다른 농도로 옮기는 동안 오염을 최소화하기 위해 깨끗한 티슈 페이퍼에 카세트를 담그십시오.
      참고: 조직이 각 전사에 30분 동안 서 있게 하십시오(두 번). 이 단계에 소요되는 총 시간은 약 4시간입니다.
    2. 탈수시, 카세트를 80 mL의 자일렌에 30 분 (두 번) 동안 옮겨 에탄올을 자일렌으로 교체하십시오.
      참고 : 자일렌과 함께 배양 한 후 조직은 반투명이됩니다.
      주의: 자일렌은 벤젠 고리가 있는 방향족 화합물입니다. 그것은 눈과 점막을 자극하고 또한 우울증을 일으킬 수 있습니다.
    3. 마지막으로, 조직을 60°C에서 예열된 파라핀으로 함침시켜 조직 내의 크실렌을 대체한다. 자일렌 함량을 최소화하기 위해 카세트를 티슈 페이퍼 상에 여러 번 담그고 파라핀 200 mL (60°C에서 액체)에 2 h (1 h x 2) 동안 놓는다.
      주의: 녹은 파라핀은 호흡기 불편을 유발할 수 있는 작은 지질 방울을 생성하므로 흡입하지 마십시오.
  4. 파라핀 임베딩
    1. 파라핀을 녹이고 스테이션이 원하는 온도에 도달하기 위해 사용하기 전에 적어도 1 시간 전에 파라핀 임베딩 기계를 켭니다. 용융 된 파라핀 왁스로 강철 몰드를 뜨거운 표면에 놓아 채운 다음 파라핀 용기에서 한 번에 하나의 카세트를 제거하십시오.
    2. 강몰드를 뜨거운에서 차가운 표면(4°C)으로 옮깁니다. 이 시점에서 금형의 왁스가 응고되기 시작합니다. 완전히 응고되기 전에 포셉의 도움으로 조직을 왁스에 넣고 후부 컵의 광학 디스크 부분이 금형의 바닥을 향하도록 조직의 방향을 조정하십시오.
      참고: 조직이 움직이지 않고 원하는 방향을 유지하는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 전체 파라핀이 액화 될 때까지 몰드를 따뜻한 작업 표면에 다시 놓은 다음 1.4.2 단계로 다시 시작하십시오.
    3. 금형의 왁스가 응고되기 시작하면 즉시 카세트베이스를 몰드 위에 놓습니다. 카세트의 상단 가장자리 위에 파라핀으로 몰드를 조심스럽게 채우고 천천히 차가운 표면 (-20 °C 근처)으로 옮겨 빠른 응고를 받으십시오. 고형화 될 때까지 1.4.2 단계의 다른 카세트로 프로세스를 반복하십시오.
    4. 모든 금형이 응고되면 강철 몰드를 카세트에서 분리하십시오. 힘들면 조금 더 기다렸다가 다시 시도하십시오 (강제로 제거하지 마십시오). 분리는 완전한 응고시 더 쉬워집니다. 이제 카세트는 마이크로톰에 의해 절편화되는 동안 유지되는 파라핀 블록의 염기가 된다.
      참고: 이 블록은 추가 사용을 위해 실온에서 보관할 수 있습니다. 이 시점에서 프로세스를 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다(필요한 경우).
  5. 단면화
    1. 블레이드 홀더에 일회용 마이크로톰 블레이드를 설치합니다. 카세트 주위에 과도한 파라핀 왁스를 제거하여 블록의 윗부분과 아래쪽 부분이 나이프와 평행하게 유지되도록하십시오. 블록을 카세트 홀더에 맞춥니다.
    2. 블록의 표면이 나이프의 가장자리와 닿을 때까지 핸드 휠을 잠금 해제하여 전진시킵니다. 조직이 블록의 표면에서 시각화 될 때까지 블록에 과량의 파라핀 왁스를 트림하십시오. 단면 두께를 5 μm로 설정하고 다섯 개 내지 여섯 개의 섹션으로 리본을 자릅니다.
    3. 포셉을 사용하여 리본을 미리 예열 된 수조 (약 50 ° C)의 표면에 부드럽게 옮겨 리본을 펼칩니다. 메이어의 알부민으로 코팅된 유리 슬라이드에 슬라이드를 섹션 아래로 잡고 섹션을 수집합니다. 섹션을 부드럽게 들어 올리고 슬라이드를 37°C에서 하룻밤 동안 수평으로 건조시킵니다.
      참고: 슬라이드는 실온에서 몇 달 동안 드라이 박스에 보관할 수 있습니다. 이 단계에서는 프로세스를 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다.
  6. 얼룩
    1. 염색될 슬라이드를 파라핀이 녹이는 것을 사용하기 전에 60°C의 열풍오븐에서 1시간 동안 가열하고, 표 1에 언급된 바와 같은 단계를 따른다.
      주의: 헤마톡실린과 에오신 얼룩은 흡입하거나 섭취할 때 독성이 있습니다. 그들은 발암 성으로보고되었습니다.
시약서 있는 시간반복(횟수)
자일렌5 분2
100% 에탄올5 분2
90% 에탄올5 분2
70% 에탄올5 분2
50% 에탄올5 분2
물5 분2
헤마톡실린4 분1
물 세척
70% 에탄올에 있는 1% 산성 알콜30초1
물 세척
스콧의 물1 분1
물 세척
50% 에탄올1 분1
95% 에탄올1 분1
0.25% 에오신5초1
물 세척
물2 분1
95% 에탄올1 분1
100% 에탄올1 분1
자일렌5 분2
마운던트 및 커버슬립

표 1. 헤마톡실린과 에오신 염색 절차

2. 혈액-뇌 장벽 파괴 분석

  1. 혈액과 유리체 수집
    1. 케타민 (80 mg / kg)과 자일라진 (8 mg / kg)을 사용하여 연령 일치 대조군 (14 ~ 15 주)과 함께 2 ~ 3 개월 된 당뇨병 성 Wistar 수컷 쥐를 마취하십시오. 페달 철수 반사 (발가락 꼬집음)로 마취 상태를 확인합니다. 즉시 1 mL의 혈액을 심장 천공으로 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 코팅 튜브에 넣어 전혈에서 혈장을 분리하십시오.
    2. 복강 내 경로를 통해 주사 된 고용량의 펜토바르비탈 (150 mg / kg)을 사용하여 쥐를 안락사시킵니다. 감지 가능한 심장 박동은 2-5 분 이내에 사망을 확인하지 못합니다. 눈을 핵을 띠고 즉시 드라이 아이스 위에 놓습니다.
    3. 드라이 아이스 위의 깨끗한 페트리 접시에 눈을 넣고 (권장) 1.2.2 단계에서 언급 한 것처럼 눈을 해부하기 시작하십시오.
    4. 렌즈를 제거하고 마이크로 포셉을 사용하여 후부 컵에서 유리체를 조심스럽게 당겨 세 개에서 네 개의 유리 비드 (2-4mm)가 들어있는 균질화 튜브에 넣으십시오.
      참고: 드라이 아이스에 대한 해부술은 렌즈를 제거하고 유리체는 동결 조건에서 더 쉽기 때문에 권장됩니다.
  2. 시료의 제조
    1. 비드 균질화기에서 유리체 유머를 중간 속도로 10초 동안 균질화하십시오.
    2. 혈액(1 mL) 및 유리체 샘플(10-20 μL)을 미세원심분리 튜브에 옮기고 두 샘플 모두를 4°C에서 10분 동안 5200 x g 에서 원심분리한다.
      참고 : 성공적인 균질화의 경우, 유리체는 원심분리 후 균일 한 일관성을 갖는다. 그러나, 유리체의 불균일한 일관성의 경우, 단계 2.2.1부터 균질화 시간이 증가하면서 반복한다.
    3. 두 샘플 모두로부터 상청액을 수집하고, 유리체 유머 및 혈장 샘플을 PBS로 각각 1:10 및 1:20 비율로 희석한다.
  3. 단백질 정량화 및 유리체-혈장 단백질 비율
    1. 유리체 유머 및 혈장 샘플에서 단백질 농도를 정량하기 위해, 희석된 샘플 5 μL를 브래드포드 시약 250 μL에 첨가하고, 잘 혼합하고, 40분 이내에 590 nm에서 흡광도를 판독한다.
      참고: 샘플의 흡수 값이 1.0 이상이면 샘플을 더 희석하고 2.2.3 단계의 절차를 반복하십시오.
    2. 유리체 단백질 수준을 동일한 랫트의 혈장 단백질 수준으로 정상화하고 건강한 쥐와 당뇨병 쥐 사이의 접이식 차이를 측정합니다.

3. 형광혈관조영술

  1. FITC-dextran70000 염료 주입
    1. 2 내지 3개월령의 당뇨 수컷 위스타 수컷 래트를 3% 이소플루란을 사용하여 연령 일치 대조군(14 내지 15주)과 함께 마취시키고 페달 금단 반사(발가락 핀치)를 확인하였다. 꼬리를 따뜻한 물(37-40°C)을 함유하는 비이커에 담그십시오. 염료를 주입하기 전에 꼬리를 70 % 에탄올로 닦으십시오. 꼬리의 측면 정맥을 찾아 꼬리의 아래 부분에 주입 위치를 표시하십시오.
      참고: 바늘 삽입에 실패하면 현재 위치 위의 다른 위치(꼬리 밑 팁)에 삽입해 보십시오. 그러나 반복적 인 찌르기가 쥐의 스트레스 발달로 이어질 수 있으므로 한 번 주사하는 것이 좋습니다.이 주사는 혈관 수축을 일으킬 수 있습니다.
    2. 꼬리 정맥을 통해 50 mg/mL FITC-dextran70000 염료 용액 1 mL를 주입하고 염료가 5분 동안 순환하도록 하십시오. 복강 내 경로를 통해 주사 된 고용량의 펜토바르비탈 (150mg / kg)으로 쥐를 안락사시킵니다. 감지 가능한 심장 박동은 2-5 분 이내에 사망을 확인하지 못합니다. 단계 1.1.1에서 언급된 바와 같이 눈을 핵화시킨다.
      참고 : 필요한 경우 눈을 4 % 포름 알데히드 용액으로 30 분 이상 고정 할 수 있습니다.
  2. 플랫 마운트 준비
    1. 플랫 마운트를 준비하려면 슬라이드 및 커버슬립과 함께 해부 도구를 준비하십시오. 차가운 PBS로 채워진 페트리 접시에 눈을 넣고 1.2.2 단계에서 언급 한 바와 같이 눈을 해부하기 시작하십시오.
    2. 이제 공막과 망막 사이에 뾰족한 집게의 끝을 놓습니다. 컵의 테두리를 따라 부드럽게 움직여 망막이 어느 시점에서도 공막에 부착되지 않도록하십시오. 장애물이있는 경우 곡선 마이크로 가위를 사용하여 림을 따라 그 부분을 천천히 자릅니다.
    3. 망막이 어느 쪽에서나 공막에 부착되지 않은 것이 확인되면 시신경 디스크 근처에서 잘라 망막이 공막에서 완전히 분리되도록 작은 구멍을 만듭니다. 망막을 PBS 용액으로 천천히 밀어 넣고 주걱이나 포셉의 도움으로 깨끗한 평평한 슬라이드에 놓습니다.
    4. 마이크로 가위 또는 메스 블레이드를 사용하여 망막 조직을 약간 자르고 네 개의 사분면으로 나눕니다. 그림 1과 같이 컷이 중앙에 있는 광학 디스크가 남긴 구멍에서 최소 2mm 이상 떨어져 있는지 확인합니다.
    5. 평평한 마운트를 방해하지 않고 0.2 mL 팁을 사용하여 조직의 측면에서 과도한 PBS를 제거하십시오.
    6. 페이딩 방지 장착 배지(50μL ~ 100μL)를 평평한 마운트에 한 방울 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮은 다음 공초점 현미경으로 즉시 시각화합니다.
      주: 전체 절차 동안 최소 조명을 유지하십시오.
  3. 플랫 마운트의 시각화
    1. 공초점 현미경의 10x 목표 하에서 플랫 마운트를 시각화하십시오. 타일 스캔을 수행하여 플랫 마운트 전체를 단일 이미지로 캡처합니다. 타일의 수는 망막 플랫 마운트의 크기에 따라 다릅니다. 또한 Z 스태킹을 수행하여 서로 다른 초점의 정맥과 동맥을 시각화합니다 (Z 스택의 기본 크기는 Z 스택 단계 수에 따라 5 μm입니다).
    2. % 이득에서 PMT 및 HyD 검출기를 각각 700-900 및 100-150으로 사용하십시오. FITC-덱스트란 염료에 대해 510-530 nm 사이의 방출 범위를 선택하십시오.

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결과

망막 조직학
당뇨병성 망막에서 망막 세포는 변성을 겪습니다. 또한, 부종으로 인해 망막층의 두께가 증가합니다.22. Hematoxylin 및 Eosin 염색 후에 얻어진 이미지는 ImageJ를 사용하여 도 2 에 도시된 바와 같이 세포 수 및 상이한 층의 두께의 측정에 사용될 수 있다.

혈액-망막 장벽 파괴 분석
BRB가 당뇨병 쥐에서 손상됨에 따라 누출이 두드러지며 혈장에서 망막 및 유리체로 생체 분자가 축적됩니다. 당뇨병 쥐에서 혈장에서 유리체로의 단백질 누출은 건강한 쥐와 비교할 때 약 3 배 더 높습니다 (그림 3). 단백질은 Lowry 방법, Bicinchoninic acid (BCA) 방법 또는 Bradford 방법 (이 논문, 섹션 2.3에서 언급)...

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토론

조직학
망막 조직학은 망막 세포 및 층의 형태학적 변화를 시각화하기 위해 수행된다. 고정 용액 선택, 고정 기간, 탈수 및 파라핀 함침을 포함한 다양한 단계를 최적화해야합니다. 조직 크기는 고정 침투가 느려지기 때문에 3mm를 초과해서는 안됩니다. 일반적으로 사용되는 4 % 파라 포름 알데히드는 수성 유머 및 유리체 유머에 비해 용액의 상대적으로 높은 삼투압으로 인해 건강한 눈에서도 망막 박리를 일으켜 위양성 결과를 초래합니다23. 용액의 높은 삼투압은 부피 수축을 초래하고 조직의 수축을 초래합니다. 이 프로토콜에 사용 된 고정 용액은 1 % 포름 알데히드와 1.25 % 글루타르 알데히드로, 상대적으로 적은 삼투압을 가지며, 조직 왜곡을 줄이며, 망막 색소 상피층으로부터의 망막 박리를 최소화하고, 또한 구조를 원래 상태로 보존합니다. 고정 용액의 또 다른 선택은 포름 알데히드가있는 아세트산과 에탄올입니다. 고정 용액의 산성 상태는 조직의 신속한 고정에...

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공개 사항

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

저자는 인도 의학 연구위원회 (ICMR; ITR-2020-2882) 박사 Nirmal J.에 대한 자금 지원 우리는 또한 인프라 시설을 제공 한 Manisha Malani 및 Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad 캠퍼스에 주니어 연구 펠로우십을 제공 한 University Grant of Commission에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Histology
Reagents
IsofluraneAbbott마취제
케타민 염산염Troikaa Pharmaceuticals마취제
XylazineIndian Immunologicals Limited마취제
펜토바르비탈 나트륨Zora Pharma안락사 에이전트
고정액 (1 % 포름 알데히드, 1.25 % 글루 타르 알데히드HiMedia, AvraMB059, ASG2529사내 에
탄올HaymanF204325탈수
XyleneHiMediaMB-180에탄올 또는 파라핀 파라
HiMediaGRM10702조직
GlycerolHiMediaTC503알부민 코팅 슬라이드를 준비합니다. 글리세롤과 난자 알부민을 1:1 비율로 혼합하여 슬라이드에 코팅합니다
염산Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.659551 % 산성 알코올
아세트산HiMediaAS119제조 에
스콧 물Leica3802900블루 링 시약
Papanicolaou 용액 1b Hematoxylin 용액Sigma1.09254.0500핵 염색
EosinHiMediaGRM115세포질 염색, 0.25 % 용액 준비 사내
DPX 마운트 미디어Sigma6522망막 섹션의 시각화 및 보호
Equipments
GlasswareBorosil
각막 겸자Stephens InstrumentsS5-1200해부
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135해부
곡선 마이크로 가위Stephens InstrumentsS7-1311해부
Vannas 가위Stephens InstrumentsS7-1387해부
아이리스 가위Stephens InstrumentsS7-1015해부
카세트HiMediaPW1292조직학 처리 중 조직 유지
조GT SonicGT Sonic-D9온도 유지 파라
핀 임베딩 스테이션MyrEC 350파라핀 블록 준비
MicrotomeZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335A단면
블레이드LeicaLeica 818단면
슬라이드HiMediaBG005파라핀 조직 단면 고정
커버슬립HiMediaBG014C장착 매체 추가 후 조직을 덮으려면
Blood Retinal Barrier Breakdown
Reagents
IsofluraneAbbottB506Anesthesia
Dry ice해당 사항 없음사항 없음Dissection
Bradford 시약SigmaB6916단백질 정량
화 < 강한>장비 < / 강>
각막 겸자Stephens InstrumentsS5-1200해부
Colibri forcepStephens InstrumentsS5-1135해부
곡선 마이크로 가위Stephens InstrumentsS7-1311해부
Vannas 가위Stephens InstrumentsS7-1387해부
아이리스 가위Stephens InstrumentsS7-1015해부
유리 제품Borosil해당 사항
EDTA 코팅 튜브J.K 진단해당 없음에서 플라즈마 분리
MP BiomedicalsSKU: 115076200-CF유리체
균질화 캡MP BiomedicalsSKU: 115063002-CF의 균질화
MP BiomedicalsSKU: 116914801유리체의 균질화
HomogeniserBertin InstrumentsP000673-MLYS0-A의 균질화
- 투명GrenierGN655101단백질 정량 플레이트
리더분자 소자SpectrMax M4흡광도 측정
원심분리기REMICPR240 PlusCentrifugation
Fluorescence Angiography
Reagents
IsofluraneAbbottB506Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (Sigma의 FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSOFITC, Dextran 및 Dibutylin dilaurate; HiMediaFITC-F3651, Dextran-31390, Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185내
FluoroshiedSigmaF6182퇴색 방지 장착 매체
Equipments
각막 겸Stephens InstrumentsS5-1200해부
Colibri 겸자Stephens InstrumentsS5-1135해부
곡선 마이크로 가위Stephens InstrumentsS7-1311해부
Vannas 가위Stephens InstrumentsS7-1387해부
아이리스 가위Stephens InstrumentsS7-1015해부
유리 제품Borosil해당 없음
슬라이드HiMediaBG005플랫마운트 준비
커버슬립HiMediaBG014C마운팅 미디어 추가 후 조직을 덮기 위해
컨포칼 현미경 라이카DMi8플랫마운트 시각화
핀 왁스 HiMedia MB-180 클리어링 삽입에 사용 .오신 수 해당 없음 전혈 균질화 튜브 유리체 유리 구슬 유리질 96웰 플레이트의 DMSO 사자

참고문헌

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