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방법 논문

각막 상처 치유를 연구하기위한 상피 마모 모델

3.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63112

⸱

2021년 12월 29일

 ,  ,  ,  , 
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

이 논문에서

요약

여기에서, 트레핀 및 무딘 골프 클럽 스푸드를 사용하여 마우스에 중앙 각막 상피 마모 상처를 만들기 위한 프로토콜이 설명된다. 이 각막 상처 치유 모델은 재현성이 높으며 현재 질병의 맥락에서 손상된 각막 상처 치유를 평가하는 데 사용되고 있습니다.

초록

각막은 시력에 중요하며 눈의 굴절력의 약 삼분의 일을 차지합니다. 시력에서 각막의 역할에 결정적인 것은 투명성입니다. 그러나 외부 위치로 인해 각막은 각막 투명성의 상실과 최종 실명으로 이어질 수있는 다양한 부상에 매우 취약합니다. 이러한 부상에 대한 반응으로 효율적인 각막 상처 치유는 각막 항상성을 유지하고 각막 투명성과 굴절 능력을 보존하는 데 중추적인 역할을 합니다. 손상된 각막 상처 치유의 경우, 각막은 감염, 궤양 및 흉터에 취약 해집니다. 각막의 투명성과 시력 보존에 대한 각막 상처 치유의 근본적인 중요성을 감안할 때, 정상적인 각막 상처 치유 과정에 대한 더 나은 이해는 감염 및 질병과 관련된 손상된 각막 상처 치유를 이해하는 전제 조건입니다. 이 목표를 향해 각막 상처의 뮤린 모델은 정상적인 생리 학적 조건에서 작동하는 각막 상처 치유 메커니즘에 대한 우리의 이해를 증진시키는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 여기에서, 트레핀 및 무딘 골프 클럽 스푸드를 사용하여 마우스에서 중앙 각막 상피 마모를 생성하기 위한 프로토콜이 설명된다. 이 모델에서는 각막 위에 중심을 둔 직경 2mm 원형 트레핀을 사용하여 상처 부위를 구분합니다. 골프 클럽 스푸드는 상피를 탈조시키고 각막 상피 기저막을 손상시키지 않고 원형 상처를 만들기 위해 조심스럽게 사용됩니다. 생성된 염증 반응은 효율적인 상처 치유를 위해 중요한 세포 및 분자 사건의 잘 특성화된 캐스케이드로서 진행된다. 이 간단한 각막 상처 치유 모델은 재현성이 높고 잘 출판되어 있으며 현재 질병의 맥락에서 손상된 각막 상처 치유를 평가하는 데 사용되고 있습니다.

서론

각막은 눈의 투명한 앞쪽입니다. 각막은 눈의 내부 구조를 보호하고 감염으로부터 눈을 보호하는 구조적 장벽을 형성하는 등 여러 가지 기능을 수행합니다1. 더 중요한 것은, 각막은 시력에 매우 중요하며, 눈의 굴절력의 약 3분의 2를 제공합니다2,3. 시력에서 각막의 역할에 결정적인 것은 투명성입니다. 그러나 각막의 외적 위치로 인해 각막은 매일 다양한 부상에 노출되어 장벽 기능의 중단, 투명성 상실 및 최종 실명으로 이어질 수 있습니다. 각막 투명성의 상실은 전 세계적으로 시각 장애의 주요 원인입니다 4,5. 각막 찰과상은 응급실 (ER)을 방문하는 일반적인 이유이며, ER6에서 제시된 눈 관련 사례의 절반을 차지합니다. 미국에서 매년 1 백만 명이 넘는 사람들이 눈 관련 부상으로 고통받는 것으로 추정됩니다7. 이러한 부상에 대한 반응으로 효율적인 각막 상처 치유는 각막 항상성을 유지하고 투명성과 굴절 능력을 보존하는 데 중추적인 역할을 합니다. 손상된 각막 상처 치유의 경우, 각막은 감염, 궤양 및 흉터 8,9에 취약 해집니다. 또한, 굴절 수술의 인기가 높아짐에 따라 각막10에 독특한 외상성 도전이 있습니다. 각막의 투명성과 시력 보존에 대한 각막 상처 치유의 근본적인 중요성을 감안할 때, 정상적인 각막 상처 치유 과정에 대한 더 나은 이해는 감염 및 질병과 관련된 손상된 각막 상처 치유를 이해하는 전제 조건입니다.

이를 위해 각막 상처 치유의 여러 동물 모델이 개발되었습니다11,12,13,14,15. 각막 상처 치유의 뮤린 모델은 정상적인 생리적 조건 하에서 작동하는 각막 상처 치유 메커니즘에 대한 우리의 이해를 증진시키는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 각막 상처의 다른 유형은 각막 상처 치유를 연구하는 데 사용되었으며, 각각은 상처 치유 과정의 다양한 측면을 조사하는 데 적합합니다. 각막 상처 치유 연구에 사용되는 상처 모델의 가장 일반적인 유형은 기계적 및 화학적 상처 모델입니다. 주로 각막에 알칼리성 화상을 만드는 화학적 각막 상처는 각막 궤양, 불투명화 및 신생혈관화를 연구하는 데 유용합니다13. 기계적 각막 상처는 탈지 (마모) 상처와 keratectomy 상처14,15,16을 포함한다. 손상되지 않았거나 침범 된 각막 상피 기저막은 각각 탈지 및 keratectomy 상처를 정의합니다. 탈지 상처에서는 상피 기저막이 손상되지 않은 채로 남아있는 반면, keratectomy 상처에서는 기저막이 대부분 전방 스트로마로 침투하여 침범됩니다. 탈지 상처는 각막 상처에 따른 재상피화, 상피 세포 증식, 면역 반응 및 신경 재생을 연구하는 데 가장 유용합니다. 반면에 각막 절제술 상처는 각막 흉터14,15를 연구하는 데 가장 유용합니다.

여기에서, 트레핀 및 무딘 골프 클럽 스푸드를 사용하여 마우스에 중앙 각막 상피 마모 상처를 만들기 위한 프로토콜이 설명된다. 이 간단한 각막 상처 치유 모델은 재현성이 높고 잘 발표되었으며 현재 질병17의 맥락에서 손상된 각막 상처 치유를 평가하는 데 사용되고 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 프로토콜은 휴스턴 대학과 베일러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 시력 및 안과 연구에서 동물의 사용에 관한 ARVO (Association for Research in Vision and Ophthalmology) 성명서에 설명 된 지침은 마우스를 취급하고 사용하는 데 따랐습니다.

1. 준비

  1. 플루오레세인 용액의 제조
    1. 1% 플루오레세인 나트륨 염 10mg을 멸균 식염수 1mL 또는 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 1% 플루오레세인 용액을 준비한다.
      참고: 미생물 오염을 피하기 위해 사용 당일 또는 하루 전에 플루오레세인 나트륨 용액을 준비하십시오. 사용 하루 전에 준비되면 플루오레세인 용액을 빛으로부터 멀리 떨어진 4°C에서 보관하십시오. 광표백을 방지하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸십시오.
    2. 용액을 단일 실험에 사용하기에 적합한 분취량으로 나눕니다. 1-1.5 μL의 플루오레세인 용액이 마우스 당 시점 당 사용된다. 다음 공식을 사용하여 단일 실험에 적합한 분취량의 부피를 계산합니다.
      figure-protocol-1
      참고: 예를 들어, 다섯 개의 시점에서 상처 크기를 모니터링한 단일 실험에서 여섯 마리의 마우스를 연구하는 경우, 해당 단일 실험에 적합한 분취량의 부피는 다음과 같습니다.
      figure-protocol-2
  2. 마우스의 마취를위한 케타민 / 자일라진 칵테일의 준비.
    1. 칵테일 10mL를 준비하려면 케타민 2.0mL(100mg/mL)와 자일라진 1.0mL(20mg/mL)를 섞고 멸균 PBS 7.0mL를 첨가한다. 케타민 / 자일라진 칵테일을 수술 전이나 수술 당일에 준비하십시오.
      참고: 달리 명시되지 않는 한 모든 솔루션은 실온에서 사용해야 합니다.

2. 마취

  1. 마우스(8-12주령 C57BL/6 야생형 마우스)의 무게를 측정하여 투여하기에 적절한 마취제를 결정한다. 양손 마우스 구속 기술을 사용하여 마취제(18)의 주사를 위해 마우스를 제지하고 처리한다. 케타민 / 자일라진 칵테일을 복강 내 (i.p.) 케타민 80mg / kg과 자일라진 8mg / kg의 최종 농도로 투여하십시오.
  2. 마우스에 각막 상처를 수행하기 전에 완전한 마취가 이루어질 때까지 기다리십시오. 발가락 꼬집음 후 페달 반사를 평가하여 마취의 깊이를 평가하십시오. 적절한 마취가 이루어지면 마우스가 발가락을 꼬집어서는 안됩니다.
    참고 : 마우스는 마취 중에 체온을 빠르게 잃어 버리기 때문에 저체온증을 예방하기 위해 마우스에게 따뜻함의 원천을 제공하는 것이 중요합니다. 마취 및 회복 단계 동안 마우스를 열원 (가열 패드)에 놓습니다.

3. 각막 상처의 창조

  1. 오른쪽 또는 왼쪽 눈만 감았습니다. 마우스에서 마우스로 이동할 때 상처 입은 눈(즉, 왼쪽 또는 오른쪽)과의 일관성을 유지합니다.
    참고: 찰과상은 각막 신경을 손상시키고 예민함을 감소시키기 때문에 양쪽 눈을 다치게 하면 심각한 불편함과 장애를 유발할 수 있습니다. 진통제는 염증 반응을 억제 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에, 그들의 사용은 각막 염증을 이해하기위한 특정 실험에서 창시자가 될 수 있습니다. 각막 상처 실험에서 진통제를 피하는 것은 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
  2. 상피 각막 상처를 만들려면
    1. 해부 현미경으로 직경 2mm의 트레핀( 그림 1 참조)을 사용하여 각막의 중심을 구분하고 엄지손가락과 검지 손가락으로 눈꺼풀을 잡고 눈을 크게 뜨게 합니다. 트레핀을 부드럽게 돌리면 각막 상피에 인상을줍니다.
      참고: 트레핀을 사용할 때 각막 천공이 발생할 수 있으므로 과도한 압력을 가하지 않도록 주의해야 합니다. 또한 트레핀을 중앙에 위치시키기 위해주의를 기울여야합니다. 동공은 각막의 중심을 찾는 랜드 마크로 사용할 수 있습니다.
    2. 해부 현미경 아래에서, 무딘 골프 클럽 스푸드( 그림 1 참조)를 트레핀으로 구분된 영역 내의 각막 표면으로부터 약 45°로 잡으십시오. 조심스럽게 그리고 지속적으로 상피를 debride하기 위해 spud로 경계 영역 내의 상피를 긁어냅니다.
      참고: 각막 천공을 일으킬 수 있으므로 디브라이드에 과도한 힘을 가하지 마십시오. 생쥐의 눈은 상처 과정에서 말라서 신부를 어렵게 만듭니다. 이러한 경우, 최적의 수분 공급을 유지하기 위해 멸균 PBS를 안구 표면에 바르십시오.

figure-protocol-3
그림 1: 2mm 트레핀과 무딘 골프 클럽 스푸드. 트레핀은 각막 중심에서 원형 영역을 구분하는 데 사용되며 골프 클럽 스푸드는 경계 영역 내의 상피를 제거하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 상처 폐쇄 및 재상피화 모니터링

  1. 1-1.5 μL의 1% 플루오레세인 용액을 상처 표면에 피펫팅하고 청색 광원을 갖는 디지털 현미경을 사용하여 각막을 이미지화한다.
  2. 플루오레세인 용액의 첫 번째 분 이내에 이미지를 획득하여 상처 크기의 과대 평가로 이어지는 주변 상피로 확산되는 것을 방지하십시오. 상처 입은 각막은 상처 후 특정 시간 (즉, 0 h, 12 h, 18 h, 24 h 및 30 h)에 영상화됩니다.
    참고 : 모든 시점에서 이미징은 마취하에 수행됩니다. 케타민 / 자일라진은 상처시 사용되며 이소플루란은 후속 시점에서 사용됩니다. 마우스는 상처 폐쇄 모니터링 기간 동안 별도의 케이지에 개별적으로 보관됩니다. 함께 수용 될 때, 마우스는 쓰레기의 눈을 핥는 경향이 있으며, 이는 다른 조직19,20에서 상처 치유에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
  3. 캡처 된 이미지를 분석하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 상처 부위를 추적합니다. 각 시점의 상처 영역은 0 h에서 원래 상처 부위의 백분율로 표현된다.

5. 면역형광 이미징 및 분석

  1. IACUC 승인 방법 (이 경우 이산화탄소 과다 복용 후 자궁 경부 탈구)으로 마우스를 상처 후 원하는 시점에 안락사시킵니다.
  2. 홍채 곡선 가위를 사용하여 안구를 변위시키기 위해 측면 칸투스를 부드럽게 눌러 안구를 수확하십시오. 안구 뒤의 가위를 안내하여 시신경을 단단히 잡은 다음 신경을 절단하여 안구를 제거 할 수 있습니다.
  3. 각 안구를 실온에서 1 h 동안 2% 파라포름알데히드를 함유하는 1x PBS 1 mL에 고정시킨 다음, 각각 5분 동안 1x PBS 1 mL에 3회 세척하였다.
  4. 해부 현미경으로 외과 용 블레이드를 사용하여 공막에서 절개를하고 사지까지 약 500 μm 원위를 절개 한 다음 지구를 절단하십시오. 포셉을 사용하여 각막에서 홍채 물질을 부드럽게 제거한 다음 공막 조직을 조심스럽게 다듬어 팔다리가 손상되지 않도록하십시오.
  5. 네 개의 부분 방사형 컷을 만들며, 각각 길이가 약 1mm이며, 이는 주변 각막에서 연장되고 각막이 평평해질 수 있도록 중앙에 짧게 멈춥니다.
  6. 15분 동안 1x PBS 중의 2% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.01% TritonX-100의 1 mL에서 각막을 투과 및 차단하고, 이어서 실온에서 추가로 45분 동안 1x PBS 중의 2% BSA에서 블로킹하였다.
  7. 2% BSA를 함유하는 1x PBS에서 제조된 직접 표지된 독특한 플루오로크롬 접합 항체의 칵테일에서 4°C에서 밤새 각막을 인큐베이션한다.
    참고: 항체는 특정 세포 및 관심있는 조직을 표지하기 위해 표적화됩니다. 예를 들어, 내피, 호중구 및 혈소판은 각각 항-CD3121,22, 항-Ly-6G 23,24, 및 항-CD41 25,26 항체로 표지된다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 항체 칵테일에 첨가하여 핵을 시각화한다.
  8. 인큐베이션 후, 각막을 각각 15분 동안 1x PBS로 세 번 세척한다.
  9. 페이드 방지 형광 부착 배지의 한 방울로 현미경 슬라이드에 각막을 장착하고, 커버슬립으로 덮고, 형광 광학 현미경을 사용하여 원하는 배율(4x 내지 100x 목표)으로 이미지화한다. 도 2A에 예시된 바와 같이 상이한 영역에 걸친 각막의 전체 두께 이미지를 촬영한다.
    참고: 도 2A 에 예시된 현미경 분석의 패턴은 염증 및 세포 분열의 특정 지역적 변화를 분석하는데 사용된다. DAPI 및 Ly-6G 염색 모두 혈관외 호중구를 확인하기 위해 사용된다. DAPI 염색을 통해 구형 호중구는 뚜렷한 말굽 또는 도넛 모양의 핵을 갖습니다 (그림 2B).

figure-protocol-4
그림 2: 중앙 마모 후 각막 이미징 전략 및 호중구 침윤 . (A) 각막의 직경에 걸쳐 아홉 개의 현미경 필드를 보여주는 각막 전체산의 개략적인 표현. 회색 영역은 원래 상처 영역을 나타냅니다. 각 영역의 폭은 500 μm이다. (B) DAPI 염색을 통해 호중구 핵의 뚜렷한 말굽 또는 도넛 모양을 주목한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

도 3 은 무딘 골프 클럽 스푸드로 만들어진 각막 상처의 투과 전자 현미경 사진을 보여주며, 상피 기저막이 손상 후 실제로 손상되지 않았음을 보여준다.

figure-results-1
그림 3: 상피 기저막은 각막 찰과상 후에도 그대로 유지됩니다. 무딘 골프 클럽 스푸드로 만든 각막 상처의 투과 전자 현미경 사진. 화살촉은 상처를 둘러싸고 있는 나머지 상피 아래의 기저막을 가리키고, 화살은 뾰족한 부위의 기저막을 가리킨다. 이것은 기저막이 절단되지 않은 부분에서부터 각막의 절제된 부분까지의 연속성을 보여주며, 기저막이 탈지 후 손상되지 않은 채로 남아 있음을 보여줍니...

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토론

이 방법 논문의 목적은 트레핀 및 무딘 골프 클럽 스푸드를 사용하여 마우스에서 중앙 각막 상피 마모 상처를 만들기 위한 프로토콜을 설명하는 것이었다. 이 뮤린 모델은 각막 염증과 상처 치유에 대한 기여도를 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 유형의 모델은 정상적인 생리적 조건 및 병리학 17,28,29,41,42에서 각막 상처 치유 메커니즘을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 모델은 식이요법으로 유도된 비만17의 마우스 모델에서 손상된 각막 상처 치유에 관한 연구에 의해 입증된 바와 같이 병리학적 조건하에서 각막 상처 치유를 조사하는데 사용되어 왔다. 이 모델의 뚜렷한 장점은 기저막을 침범하지 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

자금 지원: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., 및 R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), 및 연구 원조 시그마 시 그랜트 (P.K.A.). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원 (National Institutes of Health) 또는 시그마 시 (Sigma Xi)의 공식 견해를 대표하지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항-CD31 항체BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 항체BD Bioscience, Pharmingen553847
Anti-Ly6G 항체BD Bioscience, Pharmingen551459
소 혈청 알부민(BSA)ThermoFisher scientificB14
C57BL/6 마우스Jackson Laboratories664
DAPISigma AldrichD8417
DeltaVision, 광시야 디콘볼루션 형광 현미경GE Life Sciences
해부 현미경Leica microsystems
, 전자 탑로딩 저울(계량 저울)Fisher Scientific
에탄올, ThermoFisher 과학T038181000CS
골프 클럽 스퍼드스티븐스 악기S2-1135
아이리스 곡선 가위Fisher Scientific31212
IsofluranePatterson 수의사07-893-1389
KetaminePatterson 수의사07-890-8598
인산염 완충 식염수(PBS)ThermoFisher scientificAM9624
플루오레세인나트륨 소금Sigma Aldrich46970
수술용 칼날(scapel blade)Fine Science tools10022-00
TrephineIntegra Miltex33-31
TritonX -100Fisher Scientific50-295-34
ForcepFine Science tools11923-13
XylazinePatterson 수의학07-808-1947
, ,

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