이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막병증은 눈의 신경 감각 조직에 영향을 미치는 질병의 이질적인 그룹입니다. 그(것)들은 신경 변성, 글리오오스 및 혈관 기능 및 구조물에 있는 진보적인 변경에 의해 특징입니다. 망막증의 발병은 시각적 지각에 있는 미묘한 교란에 있는 특징이더라도, 혈관 신경병의 수정은 임상의에 의해 검출된 첫번째 표시입니다. 신생 혈관화의 부재 또는 존재는 망막병증이 비 증식 (NPDR) 또는 증식 (PDR)으로 분류되는지 여부를 결정합니다. 이러한 의미에서, 몇몇 동물 모형은 각 단계의 특정 혈관 특징을 모방하기 위하여 망막에서 일어나는 내피성 변경, 신경 죽음 및 그밖 사건에 관련되었던 근본적인 기계장치를 결정하기 위하여 시도했습니다. 본 기사에서는 산후일(P)17시에 성인 및 조기 출생 마우스의 망막 혈관 파라미터 측정에 필요한 절차에 대한 완전한 설명을 제공할 것입니다. 우리는 나중에 현미경 시각화를위한 전체 마운트에 이솔록틴 GSA-IB4와 망막 혈관 염색을 수행하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. Image J Fiji 소프트웨어로 이미지 처리를 위한 주요 단계도 제공되므로 독자는 혈관 밀도, 직경 및 불법성, 혈관 분기뿐만 아니라 혈관 및 외반 영역을 측정할 수 있습니다. 이러한 도구는 비증식 및 증식 성 망막병모두에서 혈관 변화를 평가하고 정량화하는 데 매우 유용합니다.
서론
눈은 두 개의 arterio 정맥 시스템에 의해 양육된다: choroidal 혈관 분과, 망막 색소 상피 및 광수용체를 관성 외부 혈관 네트워크; 및 신경망막 혈관분과 는 신경절 세포 층과 망막1의 내부 핵 층을 관개합니다. 망막 혈관은 망막 세포에 영양분과 산소를 전달하고 적절한 시각적 신호 전달을 보장하기 위해 폐기물을 수확하는 혈관의 조직된 네트워크입니다. 이 혈관분피는 자율적 인 내적 눈부기의 부족, 본질적인 망막 메커니즘에 의한 혈관 톤의 조절 및 복잡한 망막 혈액 장벽2의 소유를 포함하여 몇 가지 뚜렷한 특징을 가지고 있습니다. 따라서 망막 혈관증은 발달 중 혈관 발생뿐만 아니라 이러한 혈관이 질병에서 겪는 변화 및 병리학 적 혈관 신생을 광범위하게 연구한 많은 연구자의 초점이었습니다3. 망막병증에서 관찰되는 가장 흔한 혈관 변화는 혈관 팽창, 난혈관화, 혈관 절단 손실 및 망막 주요 혈관의 변형으로 인해 더 지그게4,5,6입니다. 설명된 변경의 하나 이상은 임상의에 의해 검출될 초기 표시....
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프로토콜
C57BL/6J 마우스는 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용을 위한 ARVO 성명서의 지침에 따라 처리되었다. 실험 절차는 코르도바 국립 화학 과학 학부의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (CICUAL)에 의해 설계 및 승인되었습니다 (Res. HCD 1216/18).
1. 완충 솔루션 및 시약 준비
- 1x 인산염 완충식식염(PBS): 염화나트륨 8g(NaCl), 염화칼륨 0.2g(KCl), 디나트륨-수소포 14.4g 추가 증류수(Na2HPO4 2H2O) 및 0.24g의 칼륨-이수소 인산염(KH2PO4)에서 증류수 800mL에. 소금이 완전히 용해될 때까지 용액을 저어줍니다. 염화물산(HCl)으로 pH를 7.4로 조정하고 부피를 추가 증류수로 1L로 조정합니다. 용액을 걸게 하고 4°C에 보관하십시오.
- 4% 파라포름알데히드(PFA): 40g의 고체 PFA를 800mL에 추가하여 갓 준비된 PBS를 준비합니다. 60°C의 일정한 온도에서 가열 판에 용액을 저어줍니다. PFA가 완전히 용해될 때까지 수산화 나트륨(NaOH)을 추가하여 pH가 7.2-7.4 범위에서 유지되는지 확인합니다.....
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결과
프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이, 단일 형광 염색 분석에서 혈관 형태를 얻고 여러 파라미터의 이자파라미터를 정량적으로 평가할 수 있다. 특정 변경의 검색은 연구 된 망막병증의 유형에 따라 달라집니다. 본 기사에서는 혈관 및 중혈관 부위, 대망막 및 팽창이 증식 망막증의 마우스 모델에서 평가된 반면, 혈관 분진 및 밀도는 비증식 망막증을 유도하는 MetS 마우스 모델에서 분석되었다.
첫 번째 실험 예에서, 산소 유도 망막병증 (OIR) 마우스 모델은, 미숙아의 망막병증과 당뇨병 망막증의 증식 단계의 일부 특징을 닮은 채택되었다. 이 모델에서는 산후일(P)7부터 P1218까지 과옥한 방에서 간호어머니와 함께 쓰레기를 유지한다. 인트라비트 주사는 항 혈관 신생 (치료로 명명 된 조건)으로 약물의 효과를 결정하기 위해 P12에서 수행되었다. 마우스는 P17, 최대 신혈관 형성의 시점이다19에서 희생하.......
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토론
망막병증의 동물 모델은 혈관 발달, 리모델링 또는 병리학 적 혈관 신생을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 현장에서 이러한 연구의 성공은 생체 내 및 사후 마우스26,27에서 데이터를 제공하는 다양한 기술을 수행 할 수있는 조직에 쉽게 접근할 수 있습니다. 더욱이, 생체 내 연구와 임상 분석 사이에 큰 상관관계가 발견되어 이러한 모델에 대한 견고한 추적성과 신뢰성을 제공한다28. 이 기사에서는 망막 혈관 질환의 마우스 모델에서 혈관 네트워크를 특성화하는 단계에 대한 간단하고 강력한 설명을 제시합니다. 문헌에서 독자는 여기에서 선택한 매개 변수를 정량화하기 위해 측정하고 병렬 접근 방식을 찾을 수 있습니다. 컴파일 된 프로토콜은 재현 할 수 있기 때문에 다른 프로토콜에 비해 많은 이점을 가지고 있으며 분석을 수행하기 위해 무료 소프트웨어가.......
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공개 사항
저자는 연구가 잠재적 인 이해 충돌로 해석 될 수있는 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 수행되었다고 선언합니다.
감사의 글
카를로스 마스, 마리아 필라르 크레스포, CEMINCO의 세실리아 삼페드로(센트로 드 마이크로 이 나노스코피아 코르도바, 코니스트-UNC, 코르도바, 아르헨티나)에게 공초점 현미경 검사법을 지원해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 빅터 디아즈 (FCQ의 기관 커뮤니케이션의 프로 장관)와 원고의 비판적 인 읽기 및 언어 개정에 대한 폴 홉슨에게 감사드립니다.
이 문서는 Secretaría de Ciencia y Tecnología의 보조금에 의해 지원되었으며, 유니버시다드 나시오날 드 코르도바 (SECyT-UNC) 콘솔더 2018-2021, 폰도 파라 라 Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), 프로익토 데 Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015..C N4.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알루미늄 호일 | |||
| 소 혈청 알부민 | Merck | A4503 | 품질 |
| 염화칼슘 이수화물 | Merck | C3306 | |
| 염산 | Biopack | 9632.08 | |
| 컨포칼 현미경 FV1200 | Olympus | FV1200 | 전동 플레이트 |
| 커버 | Paul Marienfeld GmnH & 공동. | 111520 | |
| 해부 현미경 | NIKON | SMZ645 | |
| 디소듐-수소-인산염 이수화물 | Merck | 119753 | |
| 200 µ 엘 튜브 | Merck | Z316121 | |
| 여과지 | Merck | WHA5201090 | |
| 인큐베이터 쉐이커 GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(비닐 알코올) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| 파라포름알데히드 | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| 염화칼 | Merck | P9541 | |
| 인산이수소 | Merck | 1,04,873 | |
| 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 염화나트륨 | Merck | S3014 | |
| 나트륨 수산화물 | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| 선박 분석 피지 소프트웨어 | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
참고문헌
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
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재인쇄 및 허가
