우리는 단일 세포 체학 실험을 수행하기 위해 안정하거나 방해받는 흐름 조건에 노출 된 마우스 경동맥의 내강에서 내피 세포와 핵을 분리하는 방법을 제시합니다.
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방법 논문
단일 세포 다중 오믹스 실험을 위한 마우스 경동맥 내강에서 내피 세포 분리
* These authors contributed equally
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
죽상 동맥 경화증은 방해받은 혈류 (d- 흐름)에 노출 된 동맥 부위의 염증성 질환입니다. D-flow 는 전사체 및 후성유전체 수준에서 내피의 유전자 발현을 조절하여 전동맥경화 반응을 일으킵니다. 최근에는 마우스 부분 경동맥 결찰(PCL) 모델을 사용하여 단일 세포 분해능에서 전사체 및 염색질 접근성 변화를 결정하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq) 및 트랜스포아제 접근 가능한 염색질 시퀀싱을 위한 단일 세포 분석(scATACseq) 연구가 수행되었습니다. 내피 세포 (ECs)는 동맥벽의 전체 세포 집단의 작은 부분을 나타내기 때문에 내강 분해 방법을 사용하여 EC가 풍부한 단일 세포 제제를 얻었습니다. 이 연구를 위해 마우스는 오른쪽 경동맥 (RCA)을 대조군으로 사용하면서 왼쪽 경동맥 (LCA)에서 d- 흐름을 유도하기 위해 PCL 수술을 받았다. 경동맥은 PCL 수술 후 2일 또는 2주 후에 해부되었다. 각 경동맥의 내강을 콜라게나제 소화를 거쳐 내피가 풍부한 단일 세포 또는 단일 핵을 얻었다. 이러한 단일 세포 및 단일 핵 제제는 이후 10x Genomics 미세유체 설정을 사용하여 바코드화되었습니다. 그런 다음 바코드된 단일 세포 및 단일 핵을 고처리량 DNA 시퀀서에서 RNA 준비, 라이브러리 생성 및 시퀀싱에 활용했습니다. 생물정보학 처리 후 scRNAseq 및 scATACseq 데이터 세트는 주로 EC로 구성된 내강 분해에서 다양한 세포 유형을 식별했습니다. 평활근 세포, 섬유 아세포 및 면역 세포도 존재했습니다. 이 EC 농축 방법은 전체 동맥 소화 방법으로는 어려울 수 있는 혈류가 내피에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이 되었습니다. EC 농축 단일 세포 준비 방법은 이러한 유전자에 대한 혈류의 영향이 연구되지 않은 EC- 녹아웃 및 형질 전환 마우스에서 단일 세포 체학 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 중요하게도, 이 기술은 유사한 기계론적 연구를 수행하기 위해 인간 동맥 외식편으로부터 EC가 풍부한 단일 세포를 분리하도록 조정될 수 있다.
서론
이 실험실은 이전에 d-flow의 유도가 고지혈증 마우스 1,2에서 빠르고 견고한 죽상 동맥 경화증 발달로 이어진다는 것을 입증했습니다. d-flow-유도 죽상동맥경화증의 새로운 마우스 모델은 부분 경동맥 결찰(PCL) 수술을 사용하여 가능했습니다3. PCL 수술은 결찰된 좌경동맥(LCA)에서 낮고 진동적인 혈류 상태 또는 d-flow를 유도합니다. 대조적으로, 반대쪽 우경동맥(RCA)은 계속해서 안정적인 층류(s-flow)에 직면합니다. 이전에는 내피 세포에 대한 d-flow의 효과를 이해하기 위해 부분 결찰 수술 후 경동맥을 해부하고 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트 기반 용해제(내막 RNA/DNA 플러싱 방법)2,4로 플러싱하여 내피가 풍부한 "풀링된 벌크" RNA 또는 DNA를 제공했습니다. 이러한 풀링된 벌크 RNA 또는 DNA는 전사체 연구 또는 후성유전체 DNA 메틸롬 연구를 위해 각각
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프로토콜
아래에 설명 된 모든 동물 절차는 Emory University의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 비 고 콜레스테롤 혈증, 연령 및 성별 일치 C57BL / 6 마우스를 사용하여 성별에 따른 변이를 완화하고 고 콜레스테롤 혈증 상태의 합병증을 상쇄했습니다.
1. 부분 경동맥 결찰 (PCL) 수술
참고: LCA의 부분 경동맥 결찰은 이전에 기술되고 입증된 바와 같이 수행되었다3.
- 마취 기화기를 사용하여 절차 전반에 걸쳐 이소플루란 흡입(유도를 위해 산소에서 5% 이소플루오란, 유지를 위해 그 후 1.5%)으로 마우스를 마취합니다. 수술 중 체온 손실을 방지하기 위해 마우스 앙와위를 델타페이즈 등온 패드에 놓습니다.
- 노출 각막염을 예방하기 위해 안구 연고를 바르고 발가락 핀치 반응이없는 경우 마취 깊이를 확인하십시오.
- 부 프레 노르 핀 0.05 mg / kg을 피하 주사하여 통증을 선제적으로 관리합니다. 베타 딘과 이소프로판올 용액으로 3 번 도포하고 청소하여 제모 된 부위를 소독하십시오. betadine이 중앙에서 시작하여 측면에서 끝나는 수술 부위를 살균하는 마지막 단계인지 확인....
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결과
부분 경동맥 결찰 수술은 44 마리의 마우스에서 수행되었으며, 부분 결찰 수술 후 하루 동안 초음파 검사를 수행하여 LCA에서 d- 흐름 의 시작을 검증했습니다. 성공적인 부분 결찰 수술은 LCA3에서 혈류 속도를 감소시키고 혈류 (방해 된 흐름)를 역전시킵니다. 경동맥은 결찰 후 2일 또는 2주에 해부되었습니다. 각 경동맥의 내강을 콜라게나제 소화를 실시하고, 내피가 풍부한 단일 세포 또는 단일 핵 현탁액을 제조하였다. 세포 수율을 증가시키기 위해 10개의 RCA 및 LCA로부터 단일 세포 현탁액을 풀링하였다. 준비된 세포/핵은 이후에 바코드화되고 시퀀싱되었습니다. sc-RNAseq 연구의 경우, 수득 된 단일 세포의 수는 ~ 9,700이었다. 4개의 샘플로부터의 세포의 분포는 표 2에 나타내었다.
마찬가지로, scATACseq 연구를 위해, 단일 세포를 제조 된 12 개의 RCA 및 LC.......
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토론
이 논문은 마우스 경동맥에서 단일 세포 제제를 분리하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. PCL 수술이 올바르게 수행되면 내피 세포에 대한 d-flow 의 영향을 정확하게 연구 할 수 있습니다. 외경동맥, 내경동맥, 후두동맥 및 상갑상선동맥과 같은 총경동맥의 가지를 정확하게 식별하는 것이 중요합니다. 초음파 검사에 의한 유동 패턴의 검증은 d-flow 조건의 성공적인 시작을 더욱 검증합니다. PCL 수술은 연령에 관계없이 마우스에서 수행 할 수 있지만 선호되는 연령은 10 ± 2 주입니다. 나이가 많은 생쥐와 고 콜레스테롤 혈증 배경을 가진 생쥐는 일반적으로 외막 주위 지방이 더 많고 피부가 뻣뻣한 경향이 있습니다.
경동맥 내피가 풍부한 단일 세포 제제를 주변 조직과 외막 주위 지방이없는 조심스럽게 해부하는 것이 필수적입니다. 경동맥의 내강은 단일 세포 제제에서 혈액 세포를 오염시키지 않도록 철저히 관류되어야합니다. 부적절한 조직 식별 및 라벨링은.......
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공개 사항
HJ는 FloKines Pharma의 설립자입니다. 다른 저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원 보조금 HL119798, HL095070 및 HL139757에서 HJ에 대한 자금으로 지원되었습니다. HJ는 또한 Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship의 지원을 받고 있습니다. Emory Integrated Genomics Core (EIGC)가 제공 한 서비스는 Emory University School of Medicine의 보조금을 받았으며 National Institutes of Health의 Georgia Clinical and Translational Science Alliance에서도 부분적으로 지원되었습니다. UL1TR002378. 위에 제공된 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원의 공식 견해를 반영하지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| 1x PBS (Cell Culture Grade) | Corning | 21040CMX12 | |
| 1.5 mL Protein LoBind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 022-43-108-1 | |
| 15 mL Centrifuge Tube - 폼 랙, sterile | Fablab | FL4022 | |
| 50 mL SuperClear Centrifuge Tubes | Labcon | 3191-335-028 | |
| 6-0 실크 봉합사 멸균 | Covidien | s-1172 c2 | |
| 70 µ m Cell Strainer, White, sterile, Individual-packaged | Thermo Fisher Scientic | 08-771-2 | |
| Accutase solution, 멸균 여과 | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | 또는 동급 |
| ATAC 버퍼(전치 혼합물의 구성 요소 I) | 10x Genomics | 2000122 | |
| ATAC Enzyme(Transposition Mix의 구성 요소 II) | 10x Genomics | 2000123/ 2000138 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마-알드리치 | A7906-500G | |
| 부프레노르핀 | 메드-벳 인터내셔널 | RXBUPRENOR5-V | |
| 크롬 컨트롤러 & 다음: GEM 액세서리 키트 | 10X 유전체학 | 1000204 | |
| 크롬, Next GEM 단일 세포 3' 시약 키트, v3.1 | 10X 게놈 | 학, 1000121 | |
| 크롬, Next GEM 단일 세포 ATAC 시약 키트, v1.1 | 10X 게놈학 | , 1000175 | |
| 콜라겐분해효소, II | MP Biomedicals, | 2100502.5 | |
| 디지토닌 | 시그마-알드리치, | D141-100MG | |
| 해부 펑 | Roboz 수술 기구 Co | RS-5005 | |
| Dnase1 | New England Biolabs Inc | M0303S | |
| 원심분리기 (Benchtop-Model # 5425) | Eppendorf | 22620444230VR | |
| 태아 소 세럼 - 프리미엄 셀렉트 | R& D systems | S11550 | |
| Fixed Angle Rotor | Eppendorf | FA-45-24-11-Kit Rotor | |
| HEPES buffered saline | Millipore Sigma | 51558 | |
| Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe) | BD | 305932 | |
| Isoflurane | Patterson vet | 789 313 89 | |
| MACS Smart Strainers (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS 스마트 스트레이너 (100 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| 일반 식염수 (0.9% 염화나트륨) | Baxter International Inc | 2B1323 | |
| 핵 버퍼 (20x) | 10x Genomics | PN 2000153/2000207 | |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientic | 70011-044 | |
| 소형 가위 | Roboz 수술 기구 Co | RS-5675 | |
| 잠금 장치가 있는 집게를 적용하는 스테인리스 스틸 마이크로 클립 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5480 | 또는 유사한 |
| Tissue Mend II | Webster Veteinanry | 07-856-7946 | |
| Type II Collagenase | MP biomedicals | 2100502.1 | |
| Deposited Data | |||
| scATACseq FastQ 파일 | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233 | |
| scRNAseq FastQ 파일 | NCBI | www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject 등록 # PRJNA646233 | |
| Software and Algorithms | |||
| Cell Ranger 3.1.0 | 10X Genomics | https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp | |
| Cicero | Pliner et al., 2018 | https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/ | |
| Ggplot2 v3.2.1 | Hadley Wickham | https://cran.r-project.org | |
| Harmony | Korsunsky et al., 2019 | https://github.com/immunogenomics/harmony | |
| ImageJ | Schneider et al., 2012 | https://imagej.nih.gov | |
| Monocle 2.8.0 | Qiu et al., 2017 | https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release | |
| R version 3.6.2 | R Foundation | ||
| Seurat 3.1.3 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/satijalab/seurat | |
| Signac 0.2.5 | Stuart et al., 2019 | https://github.com/timoast/signac |
참고문헌
- Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
- Nam, D., et al.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 6/22/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally
