Method Article

차세대 염기서열분석을 위한 뮤린 망막 내피 세포의 분리

DOI:

10.3791/63133

⸱

October 11th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

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이 프로토콜은 세포 수율, 순도 및 생존성에 최적화된 뮤린 출생후 망막 내피 세포의 단리를 위한 방법을 설명한다. 이 세포는 차세대 시퀀싱 접근법에 적합합니다.

Abstract

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차세대 시퀀싱의 최근 개선은 분자 및 세포 생물학에 대한 연구자의 지식을 향상 시켰으며 여러 연구에서 혈관 생물학의 새로운 패러다임을 밝혀 냈습니다. 이러한 방법을 혈관 발달 모델에 적용하려면 배아 및 출생 후 조직에서 세포 분리 기술을 최적화해야합니다. 세포 수율, 생존력 및 순도는 모두 차세대 염기서열분석 접근법에서 정확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 최대여야 합니다. 신생아 마우스 망막 혈관 형성 모델은 연구자들이 혈관 발달 메커니즘을 연구하는 데 사용됩니다. 연구원들은 이 모델을 사용하여 혈관 형성 및 성숙 동안 혈관신생 및 동맥-정맥 운명 사양의 메커니즘을 조사했습니다. 망막 혈관 개발 모델을 연구하기 위해 차세대 시퀀싱 기술을 적용하려면 세포 수율, 생존력 및 순도를 극대화하는 망막 내피 세포의 분리 방법을 최적화해야 합니다. 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 쥐 망막 조직 분리, 소화 및 정제하는 방법을 설명합니다. 상기 결과는 FACS-정제된 CD31+/CD45-내피 세포 집단이 내피 세포 유전자 발현에 대해 고도로 농축되고, FACS 후 60분 동안 생존력의 변화를 나타내지 않음을 나타낸다. 여기에는 벌크 RNA 시퀀싱 및 단일 세포 RNA 시퀀싱을 포함하여 이 방법을 사용하여 분리된 내피 세포에 대한 차세대 시퀀싱 접근법의 대표적인 결과가 포함되어 망막 내피 세포 분리를 위한 이 방법이 차세대 시퀀싱 애플리케이션과 호환됨을 보여줍니다. 이 망막 내피 세포 분리 방법은 혈관 발달의 새로운 메커니즘을 밝히는 고급 시퀀싱 기술을 허용합니다.

Introduction

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차세대 염기서열분석 접근법을 통한 핵산 염기서열분석의 높은 처리량은 분자 및 세포 생물학에 대한 연구자들의 지식을 크게 발전시켰습니다. 이러한 고급 기술에는 전체 전사체 RNA 시퀀싱, 단일 염기 다형성(SNP)을 식별하기 위한 표적 영역의 DNA 시퀀싱, 염색질 면역침전(ChIP) 시퀀싱에서 결합된 전사 인자의 DNA 시퀀싱 또는 트랜스포아제 접근 가능 염색질(ATAC) 시퀀싱을 위한 분석에서 열린 염색질 영역 및 단일 세포 RNA 시퀀싱1이 포함됩니다. . 혈관 생물학에서 이러한 발전으로 연구자들은 다양한 표현형 2,3의 연속체를 따라 유전자 발현 패턴을 구별하는 것과 함께 복잡한 발달 및 질병 메커니즘을 밝힐 수있었습니다. 향후 실험에서는 차세대 염기서열분석과 평가된 혈관 발달 모델을 결합하여 복잡한 메커니즘을 추가로 정의할 수 있지만, 시료 전처리 방법은 고급 염기서열분석 기법과 호환되어야 합니다.

차세대 염기서열분석 접근법의 품질, 정확성 및 재현성은 시료 전처리 방법에 따라 달라집니다. 세포의 하위 집합을 분리하거나 조직에서 단일 세포 현탁액을 생성할 때

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Protocol

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예일 대학교와 버지니아 대학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회는이 프로토콜에 나열된 모든 동물 실험을 승인했습니다.

1. 망막 분리를 위한 마우스 눈 획득

  1. 1x 얼음처럼 차가운 PBS를 준비하고 48웰 플레이트의 각 웰에 500μL를 추가합니다.
  2. 승인된 기관 지침에 따라 출생 후 6일(P6)에 신생아 마우스를 안락사시킵니다. 이 실험을 위해, 약 4-8 신생아 마우스의 새끼는 호흡 정지 후 적어도 3 분 동안 이소 플루 란 흡입을 통해 P6에서 안락사 된 후 참수된다.
  3. 각 마우스에서 눈을 제거하십시오. 해부 가위를 사용하여 눈꺼풀에 수직으로 잘라 눈 위의 피부와 막을 잘라냅니다. 그런 다음 집게를 사용하여 눈 위와 아래를 부드럽게 눌러 눈이 소켓에서 나오도록 합니다.
    1. 집게로 눈 밑을 조심스럽게 꼬집고 눈을 붙여있는 시신경을 자릅니다. 그런 다음 수확이 완료될 때까지 준비된 1x 얼음처럼 차가운 PBS의 48웰 플레이트에 각 눈을 놓습니다.
      참고: 마우스당 하나의 웰을 사용하고 동일한 웰에 있는 단일 마우스의 두 눈을 사용합니다.

2. ....

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Results

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망막 조직의 소화 및 CD31 및 CD45에 대한 면역염색은 세포, 단일 세포 및 생존력에 대한 게이팅 후 CD31+/CD45-내피 세포의 식별 가능한 집단을 초래합니다(그림 2A). CD45 면역염색은 혈소판 및 일부 백혈구를 포함하는 CD31+/CD45+ 세포를 제거하는 데 필요합니다21. 항체 특이성을 보여주고 게이팅 전략을 안내하기 위해 각 실험에 대해 대조군을 수행해야 합니다(그림 2B). 이 비율은 소화된 단일 세포 현탁액에 있는 모든 세포의 약 0.5%-1.0%로 상대적으로 낮습니다.

생존력과 순도는 프로피듐 요오드화물 염색의 정량화 및 상이한 집단으로부터 분리된 RNA의 유전자 발현 분석을 통해 평가할 수 있다. 다양한 분해 시간은 세포 수율과 생존율에 영향을 미치며, 20분의 분해 시간은 생존할 수 없는 내피 세포의.......

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Discussion

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이 프로토콜은 높은 세포 수, 순도 및 생존력에 최적화된 출생 후 뮤린 망막 조직으로부터 내피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 세포 순도는 CD31+/CD45-면역염색에 의해 소화된 단일-세포 현탁액으로부터 내피 세포 집단의 FACS 단리에 의해 수득된다. 분리 품질은 트리판 블루 염색에 의한 생존력 분석 및 CD31, CD45 및 VE-카데린에 대한 qPCR에 의한 유전자 발현에 대한 분석에서 정량화됩니다(VE-카데린은 면역염색에 사용되지 않음). 이 프로토콜의 중요한 단계는 망막 조직 분리 및 조직 소화입니다. 망막 조직 분리는 세포 생존력을 유지하고 정확하게 세포 순도를 높이기 위해 신속하게 수행되어야합니다. 조직 소화는 세포 수율과 세포 생존력을 최적화하기 위해 설명 된대로 수행되어야합니다.

이 프로토콜에 대한 수정은 이 방법을 다른 시점, 트랜스제닉 변형을 갖는 마우스 또는 다른 다운스트림 애플리케이션에 적용할 때 이루어질 수 있다. 이것은 조직이 P6 망막 조직보다.......

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Disclosures

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저자는 관련 공개가 없습니다.

Acknowledgements

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Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis 및 University of Virginia Genome Analysis and Technology Core에 감사드립니다. 이 연구는 NUC (T32 HL007224, T32 HL007284), SC (T32 HL007284), KW (R01 HL142650) 및 K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765)에 대한 NIH 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL 에펜도르프  safe-lock tubesUSA Scientific4036-3352
5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap CapCorning352235
60 mm Non-TC-treated Culture DishCorning430589
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κ Isotype ControlBD Biosciences553932
BD FACSChorus SoftwareBD BiosciencesFACSCHORUS
BD FACSMelody Cell SorterBD BiosciencesFACSMELODY
Collagenase Type IISigma-Aldrich234115
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individualped, Sterile Corning3548
D-GlucoseGibcoA2494001
일회용 눈금 전달 피펫Fisher Scientific12-711-9AM
해부 팬 왁스캐롤라이나629100
해부 가위Fine Science Tools14085-08
해부 실체 현미경 M165 FCLeicaM165FC
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-052
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (PBS)Gibco14190144
Eppendorf  Flex-Tubes 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mLSigma-Aldrich22364120
Fetal Bovine Serum (FBS)Gemini Bio100-106
미세 해부 겸자Fine Science Tools11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco14175095
Hepes (1M)Gibco15630130
iScript cDNA 합성 키트Bio-Rad1708890
Isoflurane, USPCovetrus11695067772
Isotemp 범용 디럭스 수조Fisher ScientificFSGPD20
프라이머: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'통합 DNA 기술N/A
프라이머: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'통합 DNA 기술N/A
입문서: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'통합 DNA 기술N/A
프라이머: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'통합 DNA 기술N/A
프라이머: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'통합 DNA 기술N/A
Primer: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'통합 DNA 기술N/A
프라이머: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'통합 DNA 기술N/A
프라이머: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
프로피듐 요오드화물Sigma-AldrichP4864
RNeasy Plus 미니 키트Qiagen74134
Sorvall Legend Micro 21R 원심분리기, 냉장ThermoFisher75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5120
Trypan Blue SolutionThermoFisher15250061
V450 쥐 안티-마우스 CD45BD Biosciences560501
V450 쥐 IgG2b, κ 동형(Isotype) 제어BD 생명과학560457

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine<....

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