전체 배아 배양을 위한 향상된 플랫폼은 사전 배기 단계부터 고급 유기발생까지 최대 6일 동안 이식 후 마우스 배아의 연속적이고 강력한 전자궁 개발을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 정적 플레이트와 회전 병 시스템을 사용하여 성공적인 배아 배양을 위한 표준 절차를 자세히 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이식 후 포유류 배아 배양 방법은 일반적으로 비효율적이고 자궁에서 해부 후 짧은 기간으로 제한되었습니다. 플랫폼은 최근에 향상된 유기발생까지 계란 실린더 단계에서 마우스 배아의 매우 강력하고 장기간 전 자궁 배양을 위해 개발되었습니다. 이러한 플랫폼은 뒷두개 형성 단계(E11)까지 배아(E5.5)를 예식하는 적절하고 충실한 개발을 가능하게 한다. 늦은 가스루 배아(E7.5)는 이러한 설정에서 회전병에서 재배되는 반면, 예기 단계(E5.5 또는 E6.5)에서 확장된 배양은 정적 및 회전 병 배양의 조합을 필요로 한다. 또한, O2 및 CO2 농도, 가스 압력, 포도당 수준 및 특정 전 자궁 배양 배지의 사용에 대한 민감한 조절은 적절한 배아 발달에 매우 중요하다. 여기서, 확장된 전자궁 마우스 배아 배양을 위한 상세한 단계별 프로토콜이 제공된다. 기체에서 유기발생에 이르는 정상 마우스 배아 전 자궁 을 성장시키는 능력은 배아 발달 중 다른 실험적 동요의 효과를 특성화하기 위한 귀중한 도구를 나타낸다.
서론
포유류 배아의 자궁 내 발달은 이식 후 발달의 초기 단계의 연구를 제한했다1,2. 개발 배아의 접근성은 동물 체형 계획의 수립, 세균 층의 사양 또는 조직 및 장기의 형성과 같은 자궁으로 배아 임플란트 후 발생하는 주요 발달 과정의 이해를 방해합니다. 더욱이, 초기 이식 후 배아의 아주 작은 크기는 E103 의 앞에 자궁에 있는 본질적인 화상 진찰에 의해 관찰하기 어렵게 만듭니다. 이 단계에서 살아있는 태아를 관찰하고 조작하는 무능력은 발달 도중 스냅샷에 초기 이식 후 배아 발생의 연구 연구를 제한했습니다.
전 이식 포유류 배아의 체외 배양을 위한 프로토콜은 잘 확립되고, 믿을 수 있고, 정기적으로 이용됩니다4. 그럼에도 불구하고, 적절한 포유류 이식 후 배아 성장을 지원할 수 있는 자궁 배양 시스템을 확립하려는 시도는 성공을 제한했다5. 종래의 정적 판에서 배아를 배양함으로써 100년 이상 다양한 배양 기술이 제안되어 왔으며, 주로 종래의 정적 플레이트
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프로토콜
모든 동물 실험은 바이즈만 과학 연구소의 동물 보호 지침에 따라 수행되었으며 관련 Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2)에 의해 승인되었습니다. 건강한 임산부는 람밤 의료 센터 헬싱키 위원회 (#RMB-0452-15)의 승인을 받아 탯줄에서 혈액을 수집하는 데 정보에 입각한 동의를 요청받았습니다. 건강한 성인은 과학 헬싱키 위원회의 Weizmann 연구소의 지침에 따라 혈액을 수집하기 위해 자신의 정보에 입각한 동의를 요청했다 (#1566-3).
1. 미디어 준비
- 페놀 레드와 L-글루타민없이 덜벡코의 수정 독수리 매체(DMEM)의 500mL를 사용하여 해부 매체를 준비, 10% 태아 소 혈청, 5mL 의 페니실린/스트렙토마이신, 필터 멸균 0.22 μm 필터를 사용 하 여.
참고: 해부 배지를 최대 1개월 동안 4°C로 유지하십시오. - 배아 배지의 25%와 쥐 혈청 50%, 인간 탯줄 혈청(HCS) 또는 인간 성체 혈액 혈청(HBS)을 사용하여 생물학적 후드 내에서 매일 씩 씩씩하게 배아 배양 배지(EUCM)를 준비한다.
- 배아 매체를 준비하려면 글루타민 5mL, HEP....
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결과
E7.5 배아(후기 위화 단계)에 대해 설명된 롤러 배양 조건은 4배양일 후 평균 효율이 75%에 가까운 일정하고 정상적인 배아 성장을 지원합니다(그림 2 및 표 1). 배아 발달의 효율성은 다양한 마우스 유전 배경에 따라 다를 수 있지만 일관되게 견고합니다(그림 2C). HCS 대신 HBS를 사용하면 마우스의 유전적 배경에 따라 4일간의 자궁 배양 후 ~68%의 효율을 산출한다(도 2D 및 표 2). 배아는 약 44-somite 단계까지 적절한 발달을 재구성하는 전 자궁 을 개발했습니다. 그 후, 배아는 알란토성 태반의 부재로 인해 배아 이상을 제시하고, 이 단계에서 증가된 체질량을 감안할 때 산소와 영양 공급이 불충분하다.
정.......
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토론
본 명세서에 제시된 배양 프로토콜은 E5.5에서 E11까지 최대 6일 동안 적절하고 지속적인 마우스 배아 발달 ex utero를 유지할 수 있다. 이전에는 이러한 발달 단계에 있는 배아가 짧은 기간 동안만 배양에서 정상적으로 개발할 수 있었습니다(최대 48h)15. 산소 농도 및 고압 가스 압력의 정밀한 제어를 위한 롤러 배양 인큐베이터에 가스 조절 모듈을 결합하는 것은 본 원에 기재된 적절한 마우스 배아 배아 배양에 매우 중요하다. 가스 압력을 7psi로 증가하면 산소 확산이 향상되어 장기적으로 배아에 해로울 수 있는 95% O216의 이전에 사용된 조건과 달리 최대 21% O2/5% CO2의 대기중의 E11까지 배아 발달이 가능합니다. 또한, 산소 농도는 초기 이식 후 배아 발생이 저산소 조건하에서 발생함에 따라 배아 발달에 중요한 역할을 하는 것.......
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공개 사항
J.H.H는 생물산업(생물학공업)의 고문으로, 여기에 설명된 롤러 및 정적 문화 조건을 다루는 특허 출원을 제출했습니다(J.H.H. 및 바이즈만 과학 연구소가 출원). 다른 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 파스칼과 일라나 만투에 의해 지원되었다; 유럽 연구 위원회 (ERC-CoG-2016 726497-셀나디티); 승무원 의학 연구 위원회 (FAMRI); 이스라엘 암 연구 기금 (ICRF) 교수, BSF, 헬렌과 마틴 킴멜 줄기 세포 연구를위한 연구소, 헬렌과 혁신적인 조사에 대한 마틴 킴멜 상; 이스라엘 과학 재단 (ISF), 미네르바, 약용 화학에 대한 셔먼 연구소, 넬라와 레온 베노지요 신경 질환에 대한 센터, 유전 질환 연구를위한 데이비드와 펠라 셰이벨 가족 센터, 의학 유전학에 대한 케이스트 가족 연구소, 박사 베스 롬 - 라이머 줄기 세포 연구 기금, 에드먼드 드 로스 차일드 재단, 잔트 커 자선 재단, Zvia 제로니의 부동산.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 & 마이크로; m 기공 크기 필터 (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µ m 기공 크기 주사기 PVDF 필터 | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| 가스 주입구용 어댑터 캡이 있는 병 | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | |
| 에 밀봉하는 데 사용됩니다.B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | 회전 드럼 배 | |
| 양 병 밀봉에 | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | 유리병(소) BTC 03 또는 유리병(대) BTC 04 |
| D(+)-포도당 일수화물 | J.T. 베이커 | ||
| 다이아몬드 나이프 | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| 디지털 압력계 | Shanghai Benxu Electronics Technology co., Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| 가스 조절 모듈 | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | 글루타민 |
| Graefe 집게 | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical byps (Dumont # 5, # 55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| 파스퇴르 피펫 (유리) | Hilgenberg | 3150102 | |
| 파스퇴르 피펫 (플라스틱) | Alexred | SO P12201 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 생물학 산업 | 03-031-1B | |
| 페트리 접시(60mm 및 100mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| 정밀 인큐베이터 시스템 | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 모델 with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes(5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| 쥐 전체 배아 배양 혈청 | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Nikon | SMZ18 | 장착된 실체 현미경 | |
| Pic Solution | |||
| 수술용 가위 | Fine Science Tools | 14094-11 |
참고문헌
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the....
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재인쇄 및 허가
