모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

요약

초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.

초록

초기 발달은 접합체 게놈 활성화까지 발달에 필요한 모든 세포 기능을 수행하는 난자 형성 동안 성숙한 난모세포에 통합된 모체 인자 풀에 의존합니다. 일반적으로 이러한 모성 인자의 유전 적 표적화는 모성 효과 표현형을 식별하기 위해 추가 세대를 필요로하며, 발달 중에 모성 발현 유전자의 역할을 결정하는 능력을 방해합니다. CRISPR-Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력의 발견은 주입 된 배아 또는 "크리스펫"의 체세포 조직에서 배아 표현형을 스크리닝 할 수있게하여 발달 프로그램에서 접합 발현 유전자가하는 역할에 대한 이해를 높였습니다. 이 문서에서는 크리스펀트 방법의 확장인 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에서, 생식 세포의 이중 대립 유전자 편집은 단일 세대 또는 "모체 크리스펫"에서 모성 효과 표현형의 분리를 허용합니다. 단일 표적에 대한 가이드 RNA를 멀티플렉싱하면 모체 크리스펀트의 효율적인 생산을 촉진하는 반면, 모체 크리스펀트 반수체의 서열 분석은 모체 효과 표현형을 생성하는 유전적 병변을 확증하는 간단한 방법을 제공합니다. 모체 크리스펀트의 사용은 필수 모계 발현 유전자의 신속한 식별을 지원하여 조기 발달에 대한 이해를 용이하게합니다.

서론

모계로 축적된 산물(예: RNA, 단백질 및 기타 생체 분자) 풀은 배아의 접합체 게놈^{이 활성화될} 때까지 모든 초기 세포 과정에 필요합니다1. 난 모세포에서 이러한 생성물의 조기 고갈은 일반적으로 배아 치명적입니다. 발달에서 이러한 유전자의 중요성에도 불구하고, 많은 모계 발현 유전자의 역할은 현재 알려지지 않았습니다. CRISPR-Cas9와 같은 제브라피쉬의 유전자 편집 기술의 발전은 모계에서 발현된 유전자 ^2,3,4의 표적화를 가능하게 합니다. 그러나 모성 효과 표현형의 식별은 접합 표현형과 비교할 때 추가 세대가 필요하므로 더 많은 자원이 필요합니다. 최근 CRISPR-Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력은 "크리스프 판^{트"5,6,7,8,9,10}으로 알려진 주입 된 (^F0) 배아의 체세포 조직에서 배아 표현형을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 크리스펀트 기술은 체세포에서 후보 유전자의 자원 효율적인 스크리닝을 허용하여 발달의 특정 측면에 대한 이해를 용이하게 합니다. 이 논문에 설명된 프로토콜은 단일 세대에서 모성 효과 표현형 또는 "모성 크리스펫"의 식별을 허용합니다¹¹. 이 계획은 가이드 RNA를 단일 유전자로 멀티플렉싱하고 생식계열에서 이대립유전자 편집 이벤트를 촉진함으로써 달성할 수 있습니다. 이들 모체 크리스펀트 배아는 총 형태학적 표현형에 의해 확인될 수 있고, 세포 경계 및 DNA 패터닝(¹¹)에 대한 표지와 같은 1차 특성화를 거친다. 관찰 가능한 표현형과 유도된 INDEL의 기본 분자 특성화의 결합 분석을 통해 초기 발달에서 표적 유전자의 역할을 예측할 수 있습니다.

제브라 피쉬에서는 수정 후 처음 24 시간 (hpf) 동안 작은 세포 그룹이 생식선^12,13,14,15의 전구체 인 원시 생식 세포로 발전합니다. F0 암컷이 놓은 클러치에서 회수된 모체 크리스펀트 배아의 비율은 표적 유전자에 이대립유전자 편집 이벤트가 포함된 생식 세포의 수에 따라 달라집니다. 일반적으로 배아에서 편집 사건이 일찍 발생할수록 생식계열에서 CRISPR-Cas9 돌연변이가 관찰될 확률이 높아집니다. 대부분의 경우, 모체 크리스펀트 배아의 표현형은 발달중인 난 모세포에 존재하는 두 개의 모체 대립 유전자의 기능 상실에서 비롯됩니다. 난 모세포가 감수 분열을 마치면 모체 대립 유전자 중 하나가 극체를 통해 배아에서 돌출되고 다른 대립 유전자는 모체 전핵에 통합됩니다. 다수의 모체 크리스펀트 반수체의 시퀀싱은 표현형¹¹에 기여하는 생식계열에 존재하는 돌연변이(삽입 및/또는 결실(INDEL))의 혼합물을 나타낼 것이다.

다음 프로토콜은 모성 효과 유전자에서 CRISPR-Cas9 돌연변이를 생성하고 모체 크리스펀트 접근법을 사용하여 해당 표현형을 식별하는 데 필요한 단계를 설명합니다(그림 1). 섹션 1은 가이드 RNA를 효과적으로 설계하고 생성하는 방법을 설명하고 섹션 2와 3에는 미세 주입으로 산모의 크리스펀트를 만드는 중요한 단계가 포함되어 있습니다. CRISPR-Cas9 혼합물을 주입한 후, 주입된 배아는 PCR을 통해 체세포 편집을 위해 스크리닝됩니다(섹션 4). 주입된 F0 배아가 발달하여 성적으로 성숙되면 F0 암컷을 야생형 수컷으로 교배하고 자손을 대상으로 모성 효과 표현형을 선별합니다(섹션 5). 섹션 6에는 CRISPR-Cas9 유도 INDEL을 식별하기 위해 Sanger 시퀀싱과 결합할 수 있는 모체 크리스펀트 반수체를 만드는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. 또한 토론에는 이 방법의 민감도와 성능을 높이기 위해 프로토콜에 적용할 수 있는 수정 사항이 포함되어 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜의 개발로 이어지는 연구에서 모든 제브라 피쉬 하우징 및 실험은 위스콘신 대학교 매디슨 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC-M005268-R2)의 승인을 받았습니다.

1. 가이드 RNA의 합성

참고: 접합체 크리스펀트는 단일 가이드 RNA를 사용하거나 여러 가이드 RNA를 단일 표적 5,6,7,8,9,10으로 멀티플렉싱하여 생성되었습니다. 가이드 RNA의 다중화는 접합체 크리스펀트 표현형¹⁰을 나타내는 배아의 백분율을 증가시킵니다. 표현형을 나타내는 배아의 빈도가 증가하기 때문에 4 개의 가이드 RNA를 단일 유전자로 멀티플렉싱하여 모체 크리스펀트가 생성됩니다. CHOPCHOP을 사용하여 가이드 RNA를 설계하고 어닐링 방법을 사용하여 제브라피쉬에 대한 가이드 RNA를 합성하는 방법에 대한 보다 자세한 프로토콜은^{16,17,18,19,20}의 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.

1. 모계에서 발현된 유전자를 표적으로 삼기 위해, 접합체로부터 5일째까지 전사체 정보를 제공하는 RNA 서열 데이터베이스를 통해 발달 중 mRNA 전사체 수준을 확인한다²¹. 일반적으로, 모계-특이적 유전자는 초기 배아에서 고도로 발현되고, 접합체 게놈이 활성화된 후에 분해된다²².
2. 일단 모계-발현된 표적 유전자가 확인되면, Ensembl 게놈 브라우저(²³) 상에서 이용가능한 "도메인 및 특징" 섹션을 사용하여 제1 예측된 단백질 도메인을 결정한다. 이 도메인을 4개의 가이드 RNA의 표적 영역으로 사용합니다.
3. 가이드 RNA 선택 프로그램 CHOPCHOP을 사용하여 첫 번째 활성 도메인에서 4개의 가이드 RNA 표적 부위를 식별합니다. 각 표적 부위에 대해 아래와 같이 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드에서,^N20 섹션은 CHOPCHOP으로부터의 PAM 부위(NGG)를 뺀 표적 서열에 상응한다. 이러한 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드와 불변 올리고뉴클레오티드는 표준 탈염 정제를 사용하여 정렬합니다( 재료 표 참조).
   유전자 특이적 올리고뉴클레오티드:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. 각 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드에 대한 가이드 RNA 주형을 생성하려면, 이를 상수 올리고뉴클레오티드로 어닐링하고^{앞서 설명한 바와} 같이 T4-DNA 중합효소로 오버행을 채운다. 4개의 가이드 RNA 주형을 조립한 후 제조업체의 지침에 따라 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 함께 정제하고 농축합니다( 재료 표 참조).
5. 시험 관내 T7 전사 키트를 사용하여 풀링된 가이드 RNA 주형으로부터 sgRNA 혼합물을 합성한다( 재료 표 참조). 제조업체의 지침에 따라 체외 전사를 수행하십시오. T7 전사 키트의 반쪽 반응을 사용하면 반응당 비용을 줄일 수 있습니다.
6. RNA 합성 후, 앞서 설명한^바와 같이 에탄올/암모늄 아세테이트 프로토콜을 사용하여 생성된 sgRNA 풀을 정제합니다 16,20,24. RNA가 분리된 후 뉴클레아제가 없는 물 20μL에 재현탁합니다. T7 전사 키트의 반쪽 반응을 사용하여 sgRNA 풀을 전사한 경우 정제된 RNA를 뉴클레아제가 없는 물 10-15μL에 재현탁합니다.
7. 분광 광도계를 사용하여 생성된 풀링된 sgRNA의 양을 정량화합니다. 뉴클레아제가 없는 물에 있는 sgRNA 풀을 1500ng/μL ± 500ng/μL의 희석으로 희석합니다. 전형적으로, 작업 희석의 최종 부피는 30-50 μL 범위이다.
8. sgRNA 풀의 농도를 결정한 후 1% 아가로스 겔에서 sgRNA의 무결성을 확인합니다.
   1. 1% 아가로스/0.5μg/mL 에티듐 브로마이드/TBE 겔을 캐스팅합니다. 젤이 고형화되면 TBE 실행 버퍼에 넣습니다.
   2. 1μL의 sgRNA 혼합물과 1μL의 RNA 겔 로딩 버퍼를 혼합합니다( 재료 표 참조). 이 샘플을 젤에 넣고 100V에서 5분 동안 젤을 실행합니다.
9. 자외선(UV)을 사용하여 밴드를 시각화합니다. sgRNA 풀은 단일 밴드로 나타나야 합니다. 얼룩이 관찰되면 RNA 분해가 발생했을 가능성이 있습니다.
10. sgRNA 풀을 일회용 1μL 분취액으로 -80°C 냉동고의 뉴클레아제가 없는 PCR 스트립 튜브에 보관합니다. 대량의 sgRNA 혼합물(30μL 이상)의 경우 부피의 절반을 뉴클레아제가 없는 PCR 스트립 튜브에 분취하고 나머지 절반은 뉴클레아제가 없는 미세원심분리 튜브에 더 큰 부피로 저장합니다. 해동하고 필요할 때 분취하십시오.
11. RNA 분해를 방지하려면 미세 원심분리 튜브의 샘플이 두 번 이상의 동결-해동 주기를 거치지 않도록 하십시오.

2. 미세 주입을위한 시약 및 재료 준비

참고: 제브라피쉬에서 Cas9 mRNA를 주입하면 접합체 크리스펀트를 생성할 수 있습니다. 그러나 연구에 따르면 Cas9 단백질은 주입 된 배아에서 INDEL을 생성하는 데 더 효율적입니다^16,25. 이 프로토콜은 Cas9 단백질을 사용하여 모체 크리스펫을 생성하는데, 이는 이 단백질이 주입된 Cas9 mRNA와 동일한 활성 지연을 경험하지 않기 때문입니다. 이론적으로 이것은 발달 초기에 이중 대립 유전자 돌연변이의 가능성을 증가시켜 생식선의 더 광범위한 부분이 영향을 받을 가능성을 높여야 합니다. 미세 주사를 준비하는 방법을 자세히 설명하는 다른 프로토콜 및 리소스는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다^24,26.

1. Cas9 단백질을 구매하거나 생성합니다 ( 재료 표 참조). Cas9 단백질을 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시켜 2mg/mL 용액을 만들고 1μL를 RNase가 없는 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 분취합니다. -80 ° C에서 일회용 튜브로 보관하십시오.
2. 주사 전날 오후에 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 당기고 주사 바늘을 만듭니다. 부러지지 않은 바늘은 미세 주사 아침까지 밀폐 된 바늘 홀더에 보관하십시오.
3. 주입 플레이트를 만들려면 1.5% 아가로스/멸균_H2O20mL를 부어 100mm X 15mm 페트리 접시의 절반을 채우고 응고될 때까지 기다립니다. 아가 로스 용액이 설정되면 20mL의 1.5 % 아가 로스 / 멸균 H₂O를 페트리 접시에 넣고 플라스틱 몰드 ( 재료 표 참조)를 액체 아가 로스에 넣고 경화시킵니다.
4. 아가 로스가 경화 된 후 플라스틱 몰드를 제거하고 주입 아침까지 주입 판을 냉장고에 거꾸로 보관하십시오. 단일 플레이트는 웰이 무결성을 유지하는 한 여러 번 주입에 사용할 수 있습니다.

3. CRISPR-Cas9 칵테일을 단세포 제브라피쉬 배아에 미세 주입하여 모체 크리스펀트 생성

참고: 제브라피쉬 배아에 미세 주입을 위한 더 많은 자료는^24,26,27의 다른 곳에서 찾을 수 있습니다. CRISPR-Cas9 혼합물을 단세포 배아의 발달 중인 배반판에 주입하면 모체 크리스펀트가 생성될 확률이 높아질 수 있습니다. 혼합물은 또한 2 세포 단계까지 난황낭에 주입 될 수 있습니다. 그러나 노른자에 주입된 혼합물은 배반원에 도달하기 위해 난자질 스트리밍에 의존하므로 노른자에 주입된 CRISPR-Cas9는 CRISPR-Cas9²⁸의 절단 효율을 감소시킬 수 있습니다.

1. 미세 주사 전날 오후, 제브라 피쉬 짝짓기 상자에 야생형 십자가를 설치하십시오. 수컷과 암컷 물고기를 같은 탱크에 보관하되 짝짓기 상자 칸막이로 분리하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물 안에 넣으십시오.
2. 실험 아침에 Cas9 단백질 2mg/mL 분취량 1개와 sgRNA 풀 분취량 1개를 꺼냅니다. Cas9 단백질이 포함된 RNase가 없는 폴리프로필렌 미세 원심분리 튜브에서 sgRNA 풀, 0.5% 페놀 레드 용액 1μL 및 뉴클레아제가 없는 물을 포함하는 5μL 주입 혼합물을 조립합니다. RNase가 없는 물에 400ng/μL Cas9 단백질과 200ng/μL의 풀링된 sgRNA의 최종 농도 또는 주입된 배아에서 sgRNA에 대한 Cas9 단백질의 2:1 비율을 목표로 합니다. 이 주입 혼합물은 주사 아침에 얼음에 보관할 수 있습니다.
3. 냉장고에서 주입판을 꺼내 최소 20분 동안 실온(RT)으로 예열합니다.
4. 주입 칵테일을 조립한 후, 예를 들어 짝짓기 상자 칸막이를 제거하거나 수컷을 암컷과 동일한 알을 낳는 삽입물에 적절하게 배치하여 수컷과 암컷이 짝짓기를 하도록 합니다.
5. 물고기를 낳은 후 배아를 채취하기 전에 새 면도날이나 가는 집게를 사용하여 끊어지지 않은 바늘 끝을 잘라 배아 손상을 피할 수 있을 만큼 구멍이 작지만 주사 혼합물로 막히지 않을 만큼 충분히 넓은 바늘을 만듭니다. 바늘을 자른 후 모세관의 뒤쪽 끝에 삽입된 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 주입 혼합물로 바늘을 로드합니다( 재료 표 참조).
6. 바늘이 채워진 후 RT에서 5 분 동안 바늘을 배양하여 Cas9-sgRNA 복합체를 조립합니다.
7. 마이크로 인젝터를 켜고 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 삽입합니다. 마이크로미터 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 놓고 바늘이 1nL 볼루스를 미네랄 오일로 배출할 때까지 주입 압력을 조정하여 바늘을 보정합니다.
   알림: 미네랄 오일에 주입할 때 1nL 볼루스는 마이크로미터 슬라이드로 측정한 직경이 약 0.125mm(또는 반경 0.062mm)입니다.
8. 배아를 동기화하려면 플라스틱 스트레이너를 사용하여 10분 후에 배아를 수집하고 1x E3 배지(5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM_CaCl2, 0.33mM MgSO4, 1x E3 1L당 0.03M 메틸렌 블루 20μL를 추가)를 사용하여 페트리 접시에 헹굽니다. 10-15 개의 배아를 제거하고 별도의 페트리 접시에 넣어 주입되지 않은 대조군으로 보관합니다.
9. 발달중인 배아의 나머지 부분을 주입 판의 우물로 옮깁니다.
10. 1 세포 배아의 발달중인 배반원에 1 nL의 용액 (총 400 pg의 Cas9 단백질과 200 pg의 sgRNA)을 주입합니다. 바늘 끝이 막히면 집게를 사용하여 끝을 뒤로 부러뜨리고 바늘을 다시 보정하여 1nL 볼루스를 배출합니다. 수정 후 발달 첫 40 분 동안 모든 배아를 주입하십시오.
11. 주입이 완료된 후 주입된 배아를 1x E3 배지가 들어 있는 라벨이 부착된 페트리 접시에 넣고 하루 종일 발달하도록 합니다. 수정되지 않았거나 제브라 피쉬 스테이징 시리즈²⁹에 따라 정상적으로 발달하지 않는 배아를 제거하십시오.

4. F0 주입 배아에서 체세포 INDEL에 대한 스크리닝

참고: T7 엔도뉴클레아제 I 분석 또는 고해상도 용융 분석과 같은 INDEL을 확인하기 위한 다른 방법은 배아가 체세포 INDELs ³⁰을 포함하는지 여부를 결정할 때 사용할 수 있습니다.

1. 주사 후 다음날 페트리 접시에서 결함이 있고 용해된 배아를 제거하고 1x E3 배지를 교체하여 배아 건강을 유지합니다.
2. 접시를 청소 한 후 주입되지 않은 플레이트에서 6 개의 건강한 주입 배아와 2 개의 대조 배아를 수집합니다. 각 배아를 PCR 스트립 튜브의 단일 웰에 개별적으로 놓고 튜브 상단에 레이블을 지정합니다.
3. 개별 배아의 게놈 DNA를 추출하려면 스트립 튜브의 웰에서 과도한 E3 배지를 제거하고 웰당 100μL의 50mM NaOH를 추가합니다.
4. 배아를 95°C에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 4 °C로 냉각하고 10 μL의 1 M Tris HCL (pH 7.5)을 첨가하고 5-10 초 동안 와동시킵니다. 이렇게 추출된 DNA는 DNA 분해 없이 최소 6개월 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
5. CRISPR-Cas9 표적 부위를 포함하는 100-110bp DNA 단편을 증폭하기 위해 각 가이드 부위에 고유한 스크리닝 프라이머를 설계합니다. 가능하면 증폭된 단편의 중간에 대상 부위를 배치하여 더 큰 결실을 식별할 수 있습니다.
6. 4개의 가이드 표적 부위 각각에 대해 준비된 단일 배아 게놈 DNA 5μL, PCR 믹스 및 가이드 특이적 스크리닝 프라이머를 사용하여 8개의 25μL PCR 반응을 설정하여 표적 부위의 체세포 돌연변이를 확인했습니다(표 1).
7. 약 0.625cm 너비의 웰을 만드는 빗을 사용하여 2.5% 아가로스/0.5μg/mL 에티듐 브로마이드/TBE 겔을 주조합니다. 이 넓은 빗은 게놈 서열의 크기 변화를 감지할 때 더 나은 해상도를 허용합니다. 겔이 응고 된 후 TBE 실행 버퍼가 포함 된 전기 영동 챔버에 넣습니다.
8. PCR 생성물에 5μL의 6x 로딩 염료를 첨가하고 25μL의 이 혼합물을 겔에 로딩합니다. 주입 된 샘플과 대조군 샘플이 젤의 동일한 행에서 실행되는지 확인하십시오. 모든 샘플이 로딩된 후 TBE 실행 버퍼 1L당 5μL의 브롬화 에티듐을 겔 상자의 양극 끝에 추가합니다.
9. DNA 밴드가 해결되거나 DNA가 레인 끝에 접근할 때까지 120V에서 젤을 실행합니다. Cas9가 표적 부위에 INDEL을 생성하면 일반적으로 주입된 샘플에서 얼룩이 관찰되지만 대조군에서는 관찰되지 않습니다.
10. 4개의 가이드 RNA가 주입된 배아의 4개의 가이드 부위 중 최소 3개에서 도말이 관찰되면, 형제 주입된 배아를 성장시킨다.
11. 주입된 샘플에 필요한 수의 가이드 부위에 도말이 포함되지 않을 때마다 작동하지 않는 가이드 RNA를 대체할 새로운 가이드 RNA를 설계하고 작동한 것과 새로 설계된 것을 포함하는 새로운 가이드 RNA 풀을 만듭니다. 위에서 설명한 대로 체세포 INDEL에 대한 새 풀을 주입하고 테스트합니다.

5. 모체 크리스펀트 배아에서 모성 효과 표현형의 동정

참고: 주입된 F0 암컷이 성적으로 성숙되면 생식세포 세포가 모체 크리스펀트와 야생형 배아의 혼합물을 생성할 가능성이 있습니다. 이 혼합물은 수정 및 발달시기에 대한 내부 제어를 허용하지만, F0 암컷의 클러치에 모체 크리스펀트 배아 만 포함 된 경우 야생형 인크로스를 외부 대조군으로 설정하는 것이 여전히 유익합니다.

1. 실험 전날 오후, F0 주입 암컷을 야생형 수컷에 대해 설정하고 표준 제브라 피쉬 짝짓기 상자에서 야생형 교배를 통제했습니다. 수컷과 암컷 물고기를 같은 탱크에 놓고 짝짓기 상자 칸막이로 분리하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물 안에 넣으십시오.
2. 실험 아침에 수컷과 암컷이 짝짓기 상자 칸막이를 제거하거나 암컷과 동일한 알을 낳는 삽입물에 수컷을 놓아 짝짓기를 시작하도록합니다.
3. 알을 낳는 삽입물을 신선한 시스템 물이 들어있는 새로운 짝짓기 탱크 바닥으로 옮겨 10 분마다 배아를 수집하고 개별 F0 암컷을 식별하는 태그로 탱크에 라벨을 붙입니다. 오래된 짝짓기 탱크를 가지고 차 여과기를 통해 물을 부어 한 10 분 클러치에서 배아를 수집합니다.
4. 단일 10분 클러치의 배아가 여과기에 수집되면 1x E3 배지가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 페트리 접시에 수집 시간과 생선 정보를 표시하십시오.
5. 투과 광원으로 해부 현미경으로 처음 6-8 시간 동안 매시간 발달중인 배아를 관찰하고 다음 5 일 동안 매일 관찰하십시오.
6. 시간이 일치하는 야생형 대조군과 비교하여 발달의 총체적인 형태학적 변화에 의해 잠재적인 모체 크리스펀트 배아를 식별합니다²⁹.
7. 잠재적인 모체 크리스펀트 배아를 1x E3 배지가 포함된 페트리 접시로 옮기고 수정 후 5일에 24hpf에서 형태학적 표현형과 생존력(예: 수영 방광 팽창)에 대한 분석을 수행합니다.

6. 모체 파삭 파삭 반수체의 시퀀싱 대립 유전자

참고: 모체 크리스펀트 반수체는 표적 유전자좌에 단일 대립 유전자를 포함하므로 Sanger 시퀀싱을 통해 표적 유전자에서 INDEL을 식별할 수 있습니다. 모체 크리스펀트 반수체 배아는 차세대 시퀀싱 분석을 사용하여 분석할 수도 있습니다. 모체 크리스펀트 표현형을 보이는 배아는 4개의 표적 부위 중 적어도 하나에 병변을 가지고 있을 것으로 예상됩니다(토론 참조).

1. 실험 전날 오후, 야생형 수컷과 교배된 모체 크리스펀트 배아를 생산하는 것으로 알려진 F0 암컷의 짝짓기 쌍을 설정했습니다. 짝짓기 상자 칸막이를 사용하여 야생형 수컷을 암컷과 물리적으로 분리하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물에 놓습니다.
2. 실험 아침에 물리적 칸막이를 제거하거나 알을 낳는 삽입물 안에 수컷과 암컷을 모두 넣어 짝짓기를 시작합니다. 알을 낳는 첫 징후가 나타나면 수컷과 F0 암컷을 분리하여 번식을 중단하십시오. 분리 된 각 F0 암은 개별 짝짓기 상자에 보관하십시오.
3. 앞서 설명한 바와 같이 행크 용액 100μL당 야생형 수컷 1명의 고환을 사용하여 UV 처리된 정자 용액을 준비하고(표 2), 암컷 1명의 압출 난자를 수정하기에 충분합니다(표³¹).
4. 미리 선택된 F0 암컷으로부터 성숙한 난자를 수동으로 압출하고 UV 처리된 정자³¹을 사용하여 체외 수정(IVF)을 수행한다.
5. 체외 수정 후, 모체의 바삭한 표현형이 관찰 될 때까지 반수체 배아가 발달하도록하고 그 배아를 다른 페트리 접시에 넣습니다.
6. 모체 크리스펀트 반수체 배아가 확인되면 수정 후 최소 6시간 동안 발달하도록 합니다.
7. 최소 10개의 모체 크리스펀트 반수체 배아에서 게놈 DNA를 추출하려면 단일 반수체 배아를 PCR 스트립 튜브의 개별 웰에 넣고 웰에서 과도한 E3 배지를 제거하고 50mM NaOH 50μL를 추가합니다.
8. 배아를 95°C에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 4 ° C로 냉각하고 5 μL의 1 M Tris HCL (pH 7.5)을 추가하고 5-10 초 동안 와동시킵니다. 추출된 DNA는 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
9. INDEL이 포함된 가이드 부위를 식별하려면 시퀀싱 프라이머를 설계하여 4개의 CRISPR-Cas9 표적 부위를 모두 포함하는 DNA 단편을 증폭합니다. 이러한 시퀀싱 프라이머를 사용하면 여러 가이드 사이트에 걸쳐 있는 INDEL을 식별할 수 있습니다.
10. 준비된 게놈 DNA 5μL와 염기서열분석 프라이머를 사용하여 배아당 2개의 25μL PCR 반응을 설정합니다.
11. PCR이 완료된 후 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 두 샘플을 정제하고 농축합니다( 재료 표 참조). 그런 다음 정방향 및 역방향 시퀀싱 프라이머를 모두 사용하여 DNA 단편을 Sanger 시퀀싱에 제출합니다.
12. 반수체 모체 크리스펀트 단편이 시퀀싱된 후, 이를 야생형 서열에 정렬하고 서열 정렬 프로그램을 사용하여 표적 부위에서 INDEL을 식별합니다.

결과

이 프로토콜에 설명된 실험적 접근 방식을 사용하면 모성 효과 표현형을 빠르고 자원 효율적인 방식으로 식별할 수 있습니다(그림 1).

모성 크리스펀트 생성:
단일 후보 모성 효과 유전자를 표적으로 하는 4개의 가이드 RNA를 설계할 때 가이드 RNA가 DNA에 결합하는 위치를 특별히 고려해야 합니다. 일반적으로, 이들은 모두 첫 번째 예측된 단백질 도메인의 시작 부분에서 가이드 RNA 사이에 최소 또는 전혀 겹치지 않는 영역으로 함께 클러스터링되어야 합니다(그림 2A). 이 도메인에 대한 가이드 RNA를 표적으로 삼으면 프레임 내 및 프레임 외 INDEL이 단백질의 기능에 영향을 미칠 가능성이 높아집니다. 가이드 RNA를 설계할 때 고려해야 할 다른 변수는 절단 효율성과 게놈의 표적 외 부위 수입니다.

토론

이 원고에 제시된 프로토콜은 정방향 및 역방향 유전 기술 모두에 필요한 여러 세대 대신 단일 세대에서 모성 효과 표현형의 식별 및 1 차 분자 특성화를 허용합니다. 현재, 많은 모계 발현 유전자의 역할은 알려져 있지 않다. 이러한 지식 부족은 부분적으로 모성 효과 유전자를 식별 할 때 표현형을 시각화하는 데 필요한 추가 세대 때문입니다. 과거에, 제브라피쉬에서 모성 효과 유전자의 신속한 동정은 배양된 난모세포(³²)에 번역-차단 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 주입함으로써 달성될 수 있었다. 이 방법은 알려진 여러 모성 효과 유전자를 표현하여 성공적으로 입증되었지만 미성숙 난 모세포를 조작하는 것은 섬세하고 시간이 많이 걸리는 실험 일 수 있습니다. 모체 RNA는 또한 CRISPR-RfxCas13d 복합체를 사용하여 분해를 위해 표적화될 수 있지만, 이들 복합체를 단세포 배아에 주입하는 것은 모계가 제공한 단백질³³을 표적화할 수 없다. 보다 최...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	PCR 믹스
용 1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTP	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse 무료 에탄올	Any Maker
100ml 비커	IVF용	Any Maker
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	MEGAshortscript T7 전사 키트에서 발견	gRNA
70% 에탄올			합성 gRNA (에탄올 70 mL + 뉴클레아제 무료 물 30 mL)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC	INC	27-30-1	Microinjection Bulk
Pharma Sodium Bicarbonate 35 lbs	벌크 암초 공급	255	Fish 공급
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 단백질(NLS 포함	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
우울증 유리판	Thermo Fischer Scientific	13-748B	IVF
절제 겸자	Dumont	SS	IVF
해부 가위	미세 과학 도구	14091-09	IVF 용
Steroscope 해부(투과 광원 포함)	IVF DNA를 위한	모든 메이커
Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
에펜도르프  Femtotips 마이크로로더 Femtojet 마이크로인젝터	팁 Thermo Fischer	마이크로주입
에탄올을 위한 과학적 E5242956003(200프루프, 뉴클레아제 프리)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish 그물	Any Maker		Fish Supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		생선 공급
일반 모든 목적 Agarose	모든 제조사		젤 전기영동
유전자 특이적 올리고뉴클레오티드	통합 DNA 기술 (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
장갑	모든 제조사
얼음 양동이	모든 제조사
인스턴트 오션 솔트	모든 제조사		물고기 용품
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & 여성 제브라피시
MEGAshortscript T7 전사 키트	Thermo Fischer Scientific	AM1354	gRNA
메틸렌 블루	합성 Thermo Fischer Scientific	AC414240250	E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	PCR 믹스
MgSO2· 7H2O	MiliporeSigma	M2773
미세 사출 플라스틱 금형	세계 정밀 기기	주입용	Z-금형
MicroInjection Micromanipulator	Microinjection Micropipeter용	모든 제조업체
			Micropipette
풀러	Sutter	P-87	Microinjection
필터가 있는 마이크로피펫터 팁(모든 크기)	모든 제조사
마이크로피펫터 필터(모든 크기)	모든 제조사
전자레인지	모든 제조사
미네랄 오일	MiliporeSigma	m5904-5ml	마이크로주입
MS-222(트리카인-D)	모든 제조사		FDA 승인
Na2 HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free 마이크로퓨지 튜브, 1.5 mL	Ambion	AM12450	gRNA
뉴클레아제가 없는 물의	모든 제조사
종이 타월	모든 제조사
파스트로 피펫	모든 제조사
PCR 스트립 튜브	모든 제조사
페트리 플레이트 직경 100mm	모든 제조사
페놀 레드 솔루션	MiliporeSigma	P0290	Microinjection
플라스틱 Pestals	VWR	47747-358	IVF
플라스틱 숟가락	모든 메이커		IVF
프리미엄 등급 염수 새우 계란	염수 새우 직접		미세 메쉬
RNA 젤 로딩 염료		MEGAshortscript T7 전사 키트	젤 전기 영동
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
스케일	모든 메이커
Sharpie	모든 메이커
주걱	모든 메이커
멸균 H2O	모든 메이커		PCR 믹스
T4 DNA 중합 효소	NEB	M0203	gRNA
테이프	모든 메이커
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	모든 메이커		젤 전기 영동
차 염색기	아마존	IMU-71133W	생선 공급
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm 두께, 양면 B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	젤 전기영동용
Thermo Scientific  Owl EasyCast B2 미니 젤 전기 영동 시스템	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	젤 전기
영동 Thermocycler	모든 메이커
Thermocycler	모든 메이커
Transilluminator	모든 메이커
UV 램프	UVP	모델 XX-15 (Cat No. UVP18006201)	IVF
UV 안전 안경			IVF
세척 병	Thermo Fischer Scientific	S39015	물고기 용품
제브라 피쉬 짝짓기 상자	Aqua Schwarz	SpawningBox1	물고기 용품
1.5ml Eppendorf 튜브	Fisher Scientific	05-402-11
10 어금니 dNTP Thermo	Fischer Scientific	18427013
100 BP 사다리	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% 에탄올			70ml 에탄올 및 30ml 뉴클레아제 무함유
물 수평 젤 박스용 액세서리	Fisher Scientific		0.625mm
Agarose	any maker
CaCl2	시그마	10043-52-4
CaCl2, 이수화물	시그마	10035-04-8	E3 주
사 바늘 용	모세관	튜브 Cole-Parmer	UX-03010-68
Cas9 단백질	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
컴퓨터	모든 제작자
해부 Forcepts	모든 제작자
해부 현미경	모든 제작자
해부 가위	모든 제작자
DNA 클린 & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerenzyme	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 마이크로리터
에탄올 (200 proof, nuclease-free)	모든 메이커
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Briine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
유전자 특이적 올리고뉴클레오티드	통합 DNA 기술(IDT)
유리 모세 바늘	그레인저	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:유료 :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds
유리 접시	모든 제조사
장갑	모든 제조사
Hank's Final Working Solution			9.9 ml의 Hank's Premix와 0.1 ml HS Stock #6을 결합합니다
Hank's Premix			는 다음을 순서대로 결합합니다: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS # 5. 모든 HS 솔로션을 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			100ml ddH2O Hank's Stock Solution #2
			에 8.0g NaCl, 0.4g KCl에 보관0.358g Na2HPO4 무수; 100ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			중 0.60g K2H2PO4 50ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			10.0 ml ddH20 중 0.35g NaHCO3; 새로운 사용 날
만들기 HCl	Sigma	7647-01-0
얼음 양동이	any maker
인스턴트 오션 솔			어류 물
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ 울트라퓨어&트레이드; DNase/RNase-Free 증류수	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
메틸렌 블루	피셔 사이언티픽	AC414240250	E3 매체
MgSO2-7H2O	시그마	M2773
마이크로 마이크로 매니퓰레이터
마이크로 사출 플라스틱 금형	세계 정밀 기기	Z-Mold
마이크로 인젝터
마이크로 니들 슬라이드
Micropipeter (1-10) 팁 포함	모든 메이커		필요 여과 된 p10 팁
Micropipetter (20-200) 팁 포함	모든 메이커
Micropippetter (100-1000) 팁 포함	모든 메이커
Microplastic 슬라이드
전자 레인지	모든 메이커
MiliQ Water	any 메이커
미네랄 오일	시그마 알드리치	m5904-5ml
Na2HPO4	시그마
NaCl	시그마	S9888
NaHC02	시그마	223441
나노 드롭
NaOH	시그마	567530
좁은 주걱	모든 메이커
바늘 풀러	셔터	P-97
종이 타월	모든 메이커
파스트로 피펫	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR 프라이머 측면 가이드 사이트	통합 DNA 기술(IDT)
PCR 프라이머 측면 가이드 RNA 절단 사이트	통합 DNA 기술(IDT)		표준 탈염
PCR 스트립 튜브	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
페트리 접시	Fisher Scientific	FB0875714	10cm 직경 100mm x 15mm
페놀 레드	피셔 사이언	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
피펫 팁	모든 메이커		10ul, 200ul 및 1000ul 팁
플라스틱 Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
플라스틱 숟가락	모든 메이커
프라이머 가이드 사이트	통합 DNA 기술 (IDT)
면도날	Uline	H-595B
RNA 젤 메가	트 스크립트 키트에 염료 로딩 (체외 변환 키트)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
중탄산나트륨 (cell 배양 테스트)Sigma		S5761	물고기 물
브롬화 나트륨 솔로션	Sigma	E1510
sanger 시퀀싱 분석
분광 광도계
Sterlie H2O	모든 브랜드
T4 DNA 중합 효소	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
테이프	모든 브랜드
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	아마존	IMU-71133W	대부분의 주방 상점에서 사용 가능
Thermocycler
전사 피펫	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher, scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer, Scientific	15567027
Universal Primer	, Integrated DNA Technologies(IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV 램프	UVP
UV 안전 안경	모든 메이커
세척 병	fisher scientific	S39015
얼룩말 물고기 짝짓기 상자	모든 메이커
PCR 버퍼 레시피	171.12mL 멸균 H20을 추가하십시오. 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M 트리스 -HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262mL 1% 젤라틴. 20분 동안 오토클레이브한 다음 얼음 위에서 솔로션을 식힙니다. 다음으로 3.468mL 100mg/mL BSA를 추가합니다. 0.262mL dATP(100mM), 0.262mL dCTP(100mM); 0.262mL dGTP(100mM);   0.262mL dTTP(100mL). sterile eppendorf tube