초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
초기 발달은 접합체 게놈 활성화까지 발달에 필요한 모든 세포 기능을 수행하는 난자 형성 동안 성숙한 난모세포에 통합된 모체 인자 풀에 의존합니다. 일반적으로 이러한 모성 인자의 유전 적 표적화는 모성 효과 표현형을 식별하기 위해 추가 세대를 필요로하며, 발달 중에 모성 발현 유전자의 역할을 결정하는 능력을 방해합니다. CRISPR-Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력의 발견은 주입 된 배아 또는 "크리스펫"의 체세포 조직에서 배아 표현형을 스크리닝 할 수있게하여 발달 프로그램에서 접합 발현 유전자가하는 역할에 대한 이해를 높였습니다. 이 문서에서는 크리스펀트 방법의 확장인 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에서, 생식 세포의 이중 대립 유전자 편집은 단일 세대 또는 "모체 크리스펫"에서 모성 효과 표현형의 분리를 허용합니다. 단일 표적에 대한 가이드 RNA를 멀티플렉싱하면 모체 크리스펀트의 효율적인 생산을 촉진하는 반면, 모체 크리스펀트 반수체의 서열 분석은 모체 효과 표현형을 생성하는 유전적 병변을 확증하는 간단한 방법을 제공합니다. 모체 크리스펀트의 사용은 필수 모계 발현 유전자의 신속한 식별을 지원하여 조기 발달에 대한 이해를 용이하게합니다.
서론
모계로 축적된 산물(예: RNA, 단백질 및 기타 생체 분자) 풀은 배아의 접합체 게놈이 활성화될 때까지 모든 초기 세포 과정에 필요합니다1. 난 모세포에서 이러한 생성물의 조기 고갈은 일반적으로 배아 치명적입니다. 발달에서 이러한 유전자의 중요성에도 불구하고, 많은 모계 발현 유전자의 역할은 현재 알려지지 않았습니다. CRISPR-Cas9와 같은 제브라피쉬의 유전자 편집 기술의 발전은 모계에서 발현된 유전자 2,3,4의 표적화를 가능하게 합니다. 그러나 모성 효과 표현형의 식별은 접합 표현형과 비교할 때 추가 세대가 필요하므로 더 많은 자원이 필요합니다. 최근 CRISPR-Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력은 "크리스프 판트"5,6,7,8,9,10으로 알려진 주입 된 (<....
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프로토콜
이 프로토콜의 개발로 이어지는 연구에서 모든 제브라 피쉬 하우징 및 실험은 위스콘신 대학교 매디슨 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC-M005268-R2)의 승인을 받았습니다.
1. 가이드 RNA의 합성
참고: 접합체 크리스펀트는 단일 가이드 RNA를 사용하거나 여러 가이드 RNA를 단일 표적 5,6,7,8,9,10으로 멀티플렉싱하여 생성되었습니다. 가이드 RNA의 다중화는 접합체 크리스펀트 표현형10을 나타내는 배아의 백분율을 증가시킵니다. 표현형을 나타내는 배아의 빈도가 증가하기 때문에 4 개의 가이드 RNA를 단일 유전자로 멀티플렉싱하여 모체 크리스펀트가 생성됩니다. CHOPCHOP을 사용하여 가이드 RNA를 설계하고 어닐링 방법을 사용하여 제브라피쉬에 대한 가이....
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결과
이 프로토콜에 설명된 실험적 접근 방식을 사용하면 모성 효과 표현형을 빠르고 자원 효율적인 방식으로 식별할 수 있습니다(그림 1).
모성 크리스펀트 생성:
단일 후보 모성 효과 유전자를 표적으로 하는 4개의 가이드 RNA를 설계할 때 가이드 RNA가 DNA에 결합하는 위치를 특별히 고려해야 합니다. 일반적으로, 이들은 모두 첫 번째 예측된 단백질 도메인의 시작 부분에서 가이드 RNA 사이에 최소 또는 전혀 겹치지 않는 영역으로 함께 클러스터링되어야 합니다(그림 2A). 이 도메인에 대한 가이드 RNA를 표적으로 삼으면 프레임 내 및 프레임 외 INDEL이 단백질의 기능에 영향을 미칠 가능성이 높아집니다. 가이드 RNA를 설계할 때 고려해야 할 다른 변수는 절단 효율성과 게놈의 표적 외 부위 수입니다.
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토론
이 원고에 제시된 프로토콜은 정방향 및 역방향 유전 기술 모두에 필요한 여러 세대 대신 단일 세대에서 모성 효과 표현형의 식별 및 1 차 분자 특성화를 허용합니다. 현재, 많은 모계 발현 유전자의 역할은 알려져 있지 않다. 이러한 지식 부족은 부분적으로 모성 효과 유전자를 식별 할 때 표현형을 시각화하는 데 필요한 추가 세대 때문입니다. 과거에, 제브라피쉬에서 모성 효과 유전자의 신속한 동정은 배양된 난모세포(32)에 번역-차단 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 주입함으로써 달성될 수 있었다. 이 방법은 알려진 여러 모성 효과 유전자를 표현하여 성공적으로 입증되었지만 미성숙 난 모세포를 조작하는 것은 섬세하고 시간이 많이 걸리는 실험 일 수 있습니다. 모체 RNA는 또한 CRISPR-RfxCas13d 복합체를 사용하여 분해를 위해 표적화될 수 있지만, 이들 복합체를 단세포 배아에 주입하는 것은 모계가 제공한 단백질33을 표적화할 수 없다. 보다 최.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
수생 시설을 돌봐 주신 전현직 Pelegri 실험실 축산 직원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 Ryan Trevena와 Diane Hanson의 원고에 대한 의견과 통찰력에 감사드립니다. 자금은 FP에 대한 NIH 보조금으로 제공되었습니다 (GM065303).
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재료
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참고문헌
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- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body....
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