사이토카인 분비를 담당하는 세포 유형을 식별하는 것은 신장 질환의 병리생물학을 이해하는 데 필요합니다. 여기에서는 분비 억제제인 브레펠딘 A(brefeldin A)와 세포 유형 특이적 마커(cell-type-specific marker)를 사용하여 신장 상피 세포나 간질 세포에서 생성되는 사이토카인에 대해 신장 조직을 정량적으로 염색하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
만성 신장 질환(CKD)은 미국에서 가장 큰 10대 사망 원인 중 하나입니다. 급성 신장 손상(AKI)은 종종 회복 가능하지만 환자는 나중에 CKD에 걸리기 쉽습니다. 신장 상피 세포는 AKI와 CKD 모두에서 주요 신호 노드로 확인되었으며, 이를 통해 세포는 사이토카인 및 기타 단백질의 분비를 통해 질병의 진행을 결정할 수 있습니다. 특히 만성콩팥병의 경우, 부적응적으로 복구된 세뇨관 세포가 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 결합 조직 성장 인자(CTGF) 및 기타 프로브로틱 사이토카인의 분비를 통해 질병 진행을 촉진한다는 여러 가지 증거가 있습니다. 그러나 in vivo 에서 다양한 세포 유형에서 분비되는 단백질의 출처와 상대적인 수를 식별하는 것은 여전히 어려운 일입니다.
본 논문은 브레펠딘 A(BFA)를 사용하여 사이토카인 분비를 방지하고, 표준 면역형광 기법을 사용하여 신장 조직에서 사이토카인을 염색할 수 있는 기법에 대해 설명합니다. BFA는 사이토카인 및 기타 단백질의 분비에 필요한 소포체(ER)에서 골지체로의 장치 수송을 억제합니다. 희생 6시간 전에 BFA를 주입하면 AKI의 마우스 시스플라틴 모델에서 근위세뇨관 세포(PTC) 내부에 TGF-β, PDGF 및 CTGF가 축적되고 CKD의 마우스 아리스토록산(AA) 모델에서 TGF-β이 축적됩니다. 분석 결과 BFA + 시스플라틴 또는 BFA + AA는 BFA + 식염수, 시스플라틴 또는 AA 단독에 비해 TGF-β 양성 신호를 유의하게 증가시켰습니다. 이러한 데이터는 BFA를 사용하여 특정 사이토카인을 생성하는 세포 유형을 식별하고 생산된 사이토카인의 상대적 양 및/또는 다양한 유형을 정량화할 수 있음을 시사합니다.
서론
세계 인구의 >10%가 어떤 형태로든 신장 질환을 앓고 있는 것으로 추정됩니다1. 빠른 발병으로 정의되는 AKI는 대부분 치료가 가능합니다. 그러나 AKI의 발병은 환자가 나중에 CKD로 발전하기 쉬운 원인이 될 수 있습니다 2,3. AKI와 달리 만성콩팥병은 진행성 섬유증과 신장 기능 악화가 특징이며, 이로 인해 신대체 요법이 필요한 말기 신장 질환이 발생합니다. 신장에 가해지는 대부분의 손상은 네프론을 구성하는 podocytes 또는 근위세뇨관 세포와 같은 특수 상피 세포를 대상으로 합니다 4,5. 손상 후 살아남은 상피 세포는 사이토카인과 다른 단백질의 분비를 통해 복구 반응을 조정하는 데 도움을 줍니다. 이러한 방식으로 살아남은 세포는 면역 반응을 조절하고 세포 외 기질 리모델링을 지시하며 장기 회복을 도울 수 있습니다.
사이토카인(Cytokine)은 다세포 유기체의 성숙, 성장 및 반응성을 조절하는 데 필수적인 작고 분비되는....
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프로토콜
모든 동물 실험은 밴더빌트 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용자 위원회에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 동물
- 시스플라틴 또는 아리스톨로칙 산 유발 신병증에는 8-12주 된 BALB/c 수컷 마우스(체중: 약 25g)를 사용하십시오.
- 생쥐가 건강하고 싸움으로 인한 고통이나 부상의 명백한 징후가 없는지 확인하십시오.
참고: 특히 꼬리에 대한 상처는 여기에 설명된 프로토콜을 방해할 수 있습니다. BALB/c 마우스는 이 마우스에서 주사를 위한 꼬리 정맥을 시각화하는 것이 더 쉽기 때문에 선택되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 다른 마우스 균주에 대해 작동합니다. 그러나 시스플라틴 또는 아리스톨로칙산의 복용량은 균주에 따라 다를 수 있습니다.
2. 시스플라틴 주사
- 시스플라틴을 멸균 식염수에 최종 농도 1mg/mL로 용해합니다.
알림: 시스플라틴은 실온에서 완전히 용해되지 않습니다. 흄 후드에서 처리해야 합니다. - 시스플라틴 용액을 37°C의 수조에....
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결과
시스플라틴 유도 AKI에 따른 사이토카인 생산에서 세뇨관 상피 세포의 역할을 조사하기 위해 시스플라틴 농도 20mg/kg으로 시스플라틴을 주입한 후 시스플라틴 주입 후 3일째에 BFA 0.25mg을 정맥 주사했습니다. 신장은 6시간 후에 적출하였다. 파라핀이 삽입된 신장을 절편하여 AKI의 조직 복구를 담당하는 대표적인 사이토카인인 TGF-β, PDGF-D 및 CTGF로 염색했습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, TGF-β+ 소포는 BFA가 있는 시스플라틴 처리된 신장에서 LTL로 표지된 PTC에서 관찰됩니다. 한편, TGF-β+ 소포는 손상되지 않았거나 BFA가 치료되지 않은 신장에서 관찰되지 않았습니다.
정량화는 시스플라틴 유도 AKI에서 BFA 처리로 TGF-β1+ 면적의 증가를 보여주었습니다(그림 2B). .......
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토론
신장 PTC는 TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, 혈관 내피 성장 인자 및 기타 많은 단백질의 분비를 통해 AKI와 CKD를 조절하는 것으로 알려져 있습니다 20,21,22,23. 마찬가지로, 사구체(glomeruli), 원위세뇨관(distal tubules) 및 기타 신장 상피 세포(interstitial cell)는 간질세포(interstitial cell)뿐만 아니라 손상 중에 이러한 단백질 및/또는 다른 단백질을 분비한다 24,25,26. 사이토카인 분비에서 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
미국심장협회(AHA): Kensei Taguchi, 20POST35200221; 보건복지부 | 국립보건원(NIH) | 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소(NIDDK): 크레이그 브룩스, DK114809-01 DK121101-01.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 인슐린 주사기 | BD | 329654 | |
| 10 mL 주사기 | BD 302995 | ||
| 2 mL 튜브 | Fisher 브랜드 | 05-408-138 | |
| 20 mL 주사기 | BD | 302830 | |
| 25 G 바늘 | BD | 305125 | |
| 28 G 바늘 | BD | 329424 | |
| 96 웰 플레이트 | Corning | 9017 | |
| 아리스톨로치산-I | 시그마-알드리치 | A9461 | |
| &알파;-SMA 항체와 Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | RRID:AB_476856 |
| 극저온 조절기용 블레이 | Sturkey. Inc | DT315R50 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 시그마-알드리치 | A7906 | |
| 브레펠딘 A | 시그마-알드리치 | B6542 | |
| 시스플라틴 | 시그마-알드리치 | P4394 | |
| 구연산 | 시그마-알드리치 | 791725 | |
| 공초점 현미경 | ZEISS | LSM710 | |
| 공초점 현미경 대물렌즈 | ZEISS | 40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER | |
| 공초점 소프트웨어 | ZEISS | ZEN | |
| Coplin 항아리 | 피셔 사이언티픽 | 19-4 | |
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| 극저온 스타 | 라이카 | CM1850 | |
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| Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG(H+L) | Jackson immunoresearch | 705-175-147 | RRID: AB_2340415 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 일회용 베이스 몰드 | 셔 브랜드 | 22-363-553 | |
| 당나귀 혈청 | 잭슨 면역 리서치 | 017-000-121 | |
| 에탄올 | 데콘 랩스 주식회사 | 2701 | |
| 집게 | VETUS | ESD-13 | |
| 글리신 | 피셔 브랜드 | 12007-0050 | |
| 가열 패드, | 켄트 사이언티픽 | DCT-20 | |
| 헤파린, 나트륨염 | ACROS 유기물 | 41121-0010 | 100mg/15ml의 dH2O |
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| 인슐린 주사기 | BD 329461 | ||
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| Microtome | Reichert | Jung 820 II | |
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| 마우스 수술 키트 | Kent scientific | INSMOUSEKIT | |
| NIS Elements | NIKON | ||
| 대물렌즈 | NIKON | Plan Apo 20x/0.75 | Eclipse Ti-E2(도립 현미경)에 연결된 이미지 획득 소프트웨어OCT |
| 컴파운드 | Scigen | 4586 | |
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| 플레이트 리더 | Promega | GloMax® Microplate Reader 4 | % PFA를 PBS에서 16%로 희석하여 |
| 포비돈-요오드(베타딘) | Avrio Health L.P. | NDC 67618-151-17 | |
| 압력솥 | Tristar 8 | Qt. 파워 쿠커 플러 | |
| ProLong Gold 퇴색 방지 시약 | Invitrogen | P36930 | |
| Quantichrom Urea (BUN) 분석 키트 II | BioAssay Systems | DUR2-100 | |
| 신장 해부용 단일 날지 면도날(.009", 0.23mm) | IDL 도구 | 521013 | |
| 슬라이드 워머 | Lab Scientific Inc., | XH-2001 | |
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| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 백색 유리 하전 현미경 슬라이드, 25 x 75 mm 크기, 접지 가장자리, 파란색 반투명 | 글로브 Scientific | 1358D |
참고문헌
- GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 395 (10225), 709-733 (2020).
- Canaud, G., Bonventre, J. V.
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