광유전학을 사용하여 신경 가소성을 역전시키고 쥐에서 코카인 추구를 억제

요약

여기에 설명 된 방법은 쥐의 행동 관련 회로에서 코카인으로 유도 된 가소성을 광학 유전 학적으로 역전시키는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 시상 편도체 시냅스의 지속적인 저주파 광 자극은 장기 우울증 (LTD)을 유도합니다. 코카인 경험이 있는 쥐에서 생체내 광유전학적으로 유도된 LTD는 단서-동기 약물 탐색의 후속 감쇠를 초래하였다.

초록

이 프로토콜은 광유전학적 도구를 사용하여 시상-편도체 회로에서 코카인 유발 가소성을 역전시켜 쥐의 후속 코카인 탐색 행동을 줄이는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 우리의 연구에서, 우리는 쥐가 시청각 신호와 쌍을 이루는 정맥 내 코카인을자가 투여 할 때, 시상 (MGN)의 내측 생식기 핵에서 측면 편도체 (LA)의 주요 뉴런으로의 입력에서 형성된 시냅스가 큐 - 코카인 연관성이 학습됨에 따라 더 강해진다는 것을 발견했습니다. 우리는이 시냅스에서 코카인으로 유도 된 가소성의 역전이 단서 동기 부여 코카인 추구 행동을 감소시킬 것이라고 가정했다. 생체 내에서 이러한 유형의 신경 조절을 달성하기 위해 MGN-LA 시냅스의 강도를 감소시키는 시냅스 장기 우울증 (LTD)을 유도하고자했습니다. 이를 위해 우리는 빛을 사용하여 뇌 회로의 신경 조절을 허용하는 광유전학을 사용했습니다. 흥분성 옵신 oChiEF는 oChiEF를 포함하는 AAV를 MGN에 주입하여 LA의 시냅스 전 MGN 말단에서 발현되었습니다. 그런 다음 광섬유를 LA에 이식하고 473nm 레이저 광을 1Hz의 주파수에서 15분 동안 펄스하여 LTD 및 역 코카인 유도 가소성을 유도했습니다. 이 조작은 마약 추구 행동을 유도하는 코카인과 관련된 단서의 능력을 오래 지속적으로 감소시킵니다.

서론

약물 남용은 미국과 전 세계적으로 매우 심각한 공중 보건 문제입니다. 수십 년간의 집중적인 연구에도 불구하고 효과적인 치료 옵션은 거의 없습니다 ^1,2. 치료의 주요 차질은 만성 약물 사용이 환경 단서와 약물 자체 사이에 장기적인 연관 기억을 생성한다는 사실입니다. 약물 관련 단서에 다시 노출되면 지속적인 약물 사용과 재발을 유발하는 생리적 및 행동적 반응을^{유도합니다3}. 새로운 치료 전략은 약물 큐 연관성을 조절하는 데 관련된 회로를 조작하는 것을 목표로하는 기억 기반 치료법을 제정하는 것입니다. 최근에, 측면 편도체 (LA)의 시냅스, 특히 시상의 내측 생식기 핵 (MGN)에서 발생하는 시냅스는 반복적 인 큐 관련 코카인자가 투여에 의해 강화되며,이 강화는 코카인 추구 행동 ^4,5를 지원할 수 있음이 관찰되었습니다. 따라서 MGN-LA 시냅스에서 가소성을 역전시킴으로써 큐 유도 복원이 감쇠 될 수 있다고 제안되었습니다.

특정 뇌 회로의 시냅스 가소성을 정확하게 표적화하는 능력은 이 분야의 주요 과제였습니다. 전통적인 약리학 적 도구는 재발 행동을 줄이는 데 어느 정도 성공했지만 개별 시냅스를 조작 할 수 없기 때문에 제한적입니다. 그러나 최근 생체 내 광유전학의 개발은 이러한 한계를 극복하고 시간적 및 공간^{적 정밀도로} 신경 경로를 제어하는 데 필요한 도구를 제공했습니다6,7,8. 특정 뇌 회로에서 빛에 민감한 옵신을 표현함으로써 레이저 광을 사용하여 회로를 활성화하거나 억제 할 수 있습니다. 주파수 의존적 광 자극은 행동하는 동물에서 회로의 시냅스 가소성을 구체적으로 조작하는 데 활용 될 수 있습니다.

이 원고는 생체 내 광유전학을 사용하여 행동적으로 관련된 MGN-LA 회로를 조작하기 위해 취한 절차를 간략하게 설명합니다. 먼저, 흥분성 옵신 oChIEF를 MGN에서 발현시키고 광섬유를 LA에 양측으로 이식하였다. 그런 다음 동물들은 MGN-LA 경로를 강화하는 큐 의존적 방식으로 코카인을자가 투여하도록 훈련 받았습니다. 다음으로, 473nm 레이저 광을 사용한 지속적인 저주파 자극을 사용하여 회로 별 LTD를 생성했습니다. 코카인 사용으로 유도 된 가소성을 역전시키는 것은 마약 추구 행동과 관련된 행동을 유발하는 단서의 능력을 오래 지속시키는 감소를 일으켰습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에서 정한 지침과 일치하며 피츠버그 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 도착시 무게가 275-325g 인 성인의 순진한 Sprague-Dawley 쥐를 사용하여 수행되었습니다.

1. 광섬유 임플란트 및 패치 케이블의 건설

1. 이전에 발표 된 프로토콜에 따라 광섬유 임플란트 준비⁹. 이 프로토콜에 설명 된 실험은 200 μm 코어 섬유 (0.5 NA) 및 Ø1.25 mm 다중 모드 LC / PC 세라믹 페룰, Ø230 μm 구멍 크기를 사용했습니다.
   1. Dremel 도구를 사용하여 페룰의 아래쪽 1/3(페룰의 평평한 끝에 가장 가까움)에 점수를 매깁니다. 페룰에 점수를 매기면 치과용 시멘트에 부착된 상태를 유지하는 데 도움이 되어 전체 실험 범위 동안 안전하게 유지될 가능성이 높아집니다.
   2. 와이어 커터를 사용하여 ~35mm의 섬유를 절단하십시오. 섬유 스트리핑 도구를 사용하여 ~25mm의 섬유를 제거하고 10mm는 노출되지 않은 상태로 둡니다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 열 경화성 에폭시를 준비하십시오. 1g의 수지 분말을 100mg의 경화제 화합물에 녹입니다. 무딘 25게이지 바늘을 1mL 주사기에 부착합니다. 주사기에 에폭시를 채우고 뭉툭한 25 게이지 바늘 끝을 부착하십시오.
   4. 바이스 또는 클램프를 사용하여 평평한 면이 위를 향하고 볼록한 면이 아래를 향하도록 페룰을 단단히 잡습니다. 에폭시로 채워진 주사기를 사용하여 페룰의 평평한면에 에폭시 한 방울을 추가하고 페룰 측면에서 과도한 에폭시를 닦아내도록주의하십시오.
   5. 페룰을 통해 섬유의 벗겨진 부분을 삽입하여 벗겨진 섬유가 추가로 5mm 노출되도록 합니다. LA 임플란트의 경우 섬유는 복부에서 브레그마까지 7.9mm 이식되므로 벗겨지지 않은 섬유의 노출 길이는 ~13mm여야 합니다.
   6. 에폭시가 검은색/호박색이 될 때까지 약 30-40초 동안 히트 건으로 경화합니다.
   7. 다이아몬드 나이프로 페룰의 볼록한 끝 부분에 직접 섬유를 채점하고 손가락을 사용하여 섬유를 부드럽게 두드립니다.
   8. 지혈제로 잡고 균일한 압력을 가하고 일련의 연마지(고급에서 저급까지, 5, 3, 1, 0.3μm)에 각각 20회 원형 회전을 하여 페룰의 볼록한 끝을 연마합니다.
   9. 테이프를 사용하여 벗겨지지 않은 섬유를 테이블에 고정하고 벗겨진 섬유를 득점하여 복부 좌표에서 2mm를 더 남겨 둡니다(LA 임플란트의 경우 섬유의 최종 길이는 ~10mm). 지혈제를 사용하여 페룰을 당기고 점수가 매겨진 섬유를 고르게 끊습니다. 점수를 매길 때 섬유를 완전히 자르지 않도록 주의하십시오., 그렇지 않으면 섬유의 코어가 손상될 수 있습니다.
2. 광섬유 임플란트와 호환되는 패치 케이블을 제작하십시오. 맞춤 설계된 패치 케이블을 구입했습니다( 재료 표 참조). 대안적으로, 패치 케이블은 이전에 공개된 프로토콜⁽⁹)에 따라 구성될 수 있다.
   알림: 페룰 섬유와 패치 케이블 광섬유의 직경과 NA는 과도한 광 손실을 방지하기 위해 커플링 접합부에서 일치해야 하며, 이로 인해 신경 활동을 충분히 자극하지 못할 수 있습니다.
3. 패치 케이블/광섬유를 적절한 레이저 광원(473nm, 1mW 출력)에 연결하고 광 센서로 출력을 측정하여 패치 케이블 및 광섬유 임플란트를 통한 광 출력을 측정합니다. 성공적으로 구성된 섬유는 동심원의 빛을 방출하고 30% 이하의 광 손실을 갖습니다.

2. 설치류 정맥 카테터 삽입, 바이러스 전달 및 광섬유 이식

1. 수술을 위해 동물을 준비하십시오.
   1. 제도적 지침에 따라 선택한 마취제로 쥐를 완전히 마취하십시오. 한 가지 옵션은 케타민 염산염 (87.5-100 mg / kg, i.m.) 및 자일 라진 염산염 (5 mg / kg, i.m.)입니다. 발가락 핀치 반사가 없는지 확인하여 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
      주의 : 케타민은 기관 지침에 따라 취급해야하는 규제 물질입니다.
      참고: 마취제의 근육 주사는 복강 주사보다 더 빠르고 안정적인 마취 유도를 생성했기 때문에 이 연구에서 사용됩니다. 쥐의 호흡과 반응성을 지속적으로 모니터링하고 수술 내내 열 지원을 제공합니다.
   2. 쥐의 등 (어깨 뼈 바로 위에서 등 중앙까지 등 위쪽)의 넓은 영역과 오른쪽 앞다리 아래의 목 부위 및 두피를 면도합니다.
   3. 쥐를 수술 부위에 놓고 푸랄루베(인공 눈물)를 눈에 바릅니다. 체중량의 카프로 펜 (진통제)을 등 상부의 피부를 통해 피하 (s.c.)로 주입 한 다음 허리의 피부를 통해 5mL의 젖산 링거 용액 s.c.를 주입합니다.
   4. 멸균 거즈 조각을 베타딘으로 적시고 원을 그리며 면도한 수술 부위를 닦아 모든 수술 부위를 소독합니다. 그런 다음 70 % 에탄올로 과정을 반복하십시오. 이 교대로 세 번 반복하십시오.
2. 이전에 발표 된 프로토콜 ^4,10에 따라 정맥 카테터 이식을 수행하십시오.
   참고: 카테터 이식 중 자극을 피하기 위해 이 수술 중에는 수술용 드레이프를 사용하지 않습니다. 사용하기 전에 모든기구와 장비를 소독하십시오. 멸균 장갑을 사용하고 비멸균 표면이 접촉한 경우 장갑을 교체하십시오.
3. 카테터 이식 직후, AAV 주사를 수행하기 위해 쥐를 정위 프레임에 고정시킵니다.
   1. 국소 마취제로 2 % 리도카인 (0.2-0.3 mL)의 피하 (s.c) 주사를 두피에 전달합니다.
      참고: 국소 마취제는 수술 결과의 변경을 피하기 위해 정맥 카테터 이식 중에 사용되지 않습니다.
   2. 26게이지 스테인리스 스틸 주입 캐뉼러를 1μL의 농축 AAV 용액으로 채워진 해밀턴 주사기에 연결합니다(AAV5-hSyn-tdTomato 또는 AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      참고 : oChIEF는 청색광에 민감한 옵신 채널 로돕신 (ChR2)의 변형으로, 광범위한 주파수 ^8,11에 응답 할 수 있으므로이 프로토콜에서 논의 된 저주파 LTD 실험뿐만 아니라 고주파 LTP 실험 (여기서는 논의되지 않음)에도 유용합니다. oChIEF 구조체는 Roger Tsien 박사가 기증했으며 Duke Viral Vector Core에서 포장 및 정제를 위해 가공되었습니다. MGN 축삭 말단에서 최적의 바이러스 발현을 허용하기 위해 주사일과 LTD 유도 일 사이에 최소 3-4 주가 필요합니다.
      주의 : 일반적으로 AAV는 생물 안전 레벨 1 (BSL-1) 유기체로 간주되며 생산에 도우미 바이러스를 사용하지 않는 한자가 감염 위험이 낮습니다. 이를 사용하려면 IACUC 승인이 필요하며 불필요한 노출을 제한하기 위해 기관 지침에 따라 항상 적절한 PPE를 사용해야합니다.
   3. 메스를 사용하여 두개골의 앞쪽에서 뒤쪽으로 0.5mm 절개를하고 위에 놓인 조직을 제거하여 두개골 표면을 노출시킵니다.
   4. 쥐의 머리를 전방 / 후방 축에 수평을 맞추고 bregma에 대한 입체 좌표를 0으로 만듭니다.
   5. 작은 드릴 비트가 장착 된 Dremel 도구를 사용하여 두개골에 세 개의 작은 구멍을 뚫습니다. 드라이버를 사용하여 스테인리스 스틸 나사(M2x4 965-A2)를 제자리에 단단히 장착합니다.
      알림: 나사는 치과용 시멘트를 적절하게 결합하고 견고하고 오래 지속되는 헤드캡을 만드는 데 필요합니다. 나사의 위치는 두개골의 전후 축을 가로 질러 AAV 주사 부위에서 멀리 떨어져 있어야합니다.
   6. 내측 생식기 핵(MGN)의 내측 부분에 대한 쥐 뇌 아틀라스(Watson 및 Paxinos)¹² 의 좌표를 기반으로 AAV 주입을 위한 양측 구멍을 뚫습니다. 브레그마에서 밀리미터 단위, AP : -5.4; 매물 : ±3.0; DV : -6.6. MGN에 위치할 때까지 주입 캐뉼러(4mm/분)를 천천히 내립니다. 농축된 AAV 용액을 0.1μL/min의 속도로 주입합니다.
   7. 주입이 완료된 후 5분 동안 주사 캐뉼러를 제자리에 두어 캐뉼라에서 멀리 확산되도록 한 다음 뇌에서 캐뉼라를 천천히 빼냅니다.
4. 바이러스 주사 직후 MGN-LA 말단을 표적으로 하는 광섬유 ^4,9를 계속 이식합니다.
   1. Dremel 도구를 사용하여 측면 편도체를 표적으로 하는 광섬유 임플란트의 양측 구멍을 뚫습니다(브레그마에서 mm 단위, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. 집게를 사용하여 광섬유 임플란트의 페룰을 잡고 정위 어댑터에 고정하여 제자리에 단단히 고정시킵니다.
   3. 섬유 끝이 LA의 등쪽 부분에 놓일 때까지 2mm/min의 속도로 섬유를 천천히 내립니다(DV: -7.9mm).
   4. 먼저 Loctite 순간 접착제의 얇은 층을 사용하여 페룰을 두개골에 고정한 다음 치과용 시멘트와 1.25mm 직경의 페룰 슬리브와 더스트 커버가 있는 커버 페룰을 사용합니다.
      알림: 페룰을 두개골에 고정하기위한 접착제의 선택은 지역 또는 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아야합니다. Loctite는 여러 접착제로 시행 착오 후 페룰을 두개골에 안정적으로 고정하기 위해이 연구에 사용됩니다. 그러나 사용 가능한 대안을 고려할 수 있습니다.
5. 수술 절차에 따라 쥐를 개별적으로 사육하고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다. 기관 지침에 따라 수술 후 관리를 제공합니다. 개통성을 유지하기 위해 겐타마이신(5mg/mL)과 헤파린(30USP/mL)이 함유된 식염수로 카테터를 매일 세척합니다. 수술 후 최소 5 일 및 행동 실험 시작 24 시간 전에 음식은 쥐를 자유 수유 체중의 ~ 90 %로 제한합니다.

3. 설치류 코카인 자가 관리 및 도구 레버 멸종

알림: 모든 행동 절차는 한쪽 벽에 두 개의 개폐식 레버, 각 레버 위의 자극등, 톤 제너레이터, 하우스 라이트 및 주입 펌프가 장착된 표준 조작적 컨디셔닝 챔버에서 수행됩니다.

1. 피험자 쥐에게 FR1 강화 일정에 따라 매일 2-h 코카인(1mg/mL) 자가 투여 훈련 세션.
   1. 매일 쥐를 조작 챔버에 놓고 쥐가 레버 프레스를 할 수 있도록합니다. 지정된 '액티브 레버'(왼쪽 및 오른쪽 레버에 걸쳐 균형을 이루는 것)를 누르면 코카인 주입(1.0mg/kg/주입)이 발생하고 복합 조명 및 톤 큐가 10초 동안 표시됩니다. 지정된 '비활성 레버'를 눌러도 프로그래밍된 효과가 없습니다.
   2. 최소 10일 동안 그리고 쥐가 연속 3일에 걸쳐 하루에 최소 8회 주입을 성공적으로 얻을 때까지 자가 투여 실험을 계속합니다. 20일째까지 획득 기준에 도달하지 못하면 연구에서 제외됩니다.
2. 획득 기준이 성공적으로 충족 된 후, 쥐에게 6-10 일 동안 1 시간 도구 멸종 세션을 실시합니다.
   1. 쥐를 조작실에 넣고 쥐가 자유롭게 프레스를 할 수 있도록합니다. 그러나 활성 및 비활성 레버 모두에 대한 응답은 프로그래밍된 결과가 없습니다.
   2. 쥐가 이틀 연속 평균 < 25 레버 프레스가 발생할 때까지 매일 도구 멸종을 계속하게하십시오.

4. LTD의 생체 내 광유전 유도

참고 : 광유전 억제 실험은 도구 멸종의 마지막 날 이후 24 시간 후에 발생합니다.

1. 덮개를 제거한 깨끗한 표준 설치류 하우징 케이지 위에 매달린 회전 조인트를 통해 패치 코드를 473nm 청색 레이저 다이오드에 연결합니다. 이 설정은 설치류가 광유전 자극 동안 케이지 주위를 자유롭게 움직일 수있게합니다.
2. 작동 지침에 따라 레이저 다이오드를 켜고 펄스 발생기에 연결하십시오. 쥐가 켜면 1Hz에서 900 2ms 펄스의 빛을 수신하도록 설정을 조정하십시오.
   주의 : 레이저를 작동하는 동안 항상 적절한 눈 보호구를 사용해야합니다.
3. 광 센서를 사용하여 패치 코드를 통해 광도를 측정합니다. 패치 케이블을 통한 광 출력이 ~5-7mW가 되도록 레이저의 강도를 조정합니다.
4. 깨끗한 주택 케이지에 쥐를 넣으십시오. 먼지 덮개와 페룰 슬리브를 제거하여 페룰을 노출시킵니다. 패치 코드를 광섬유 임플란트에 양측으로 연결합니다. 쥐가 LTD 유도 전에 3 분 동안 환경을 탐색하도록하십시오.
5. 펄스 발생기를 켜서 광유전학적 자극을 시작합니다.
   참고 : 가능성은 낮지 만 쥐가 자극에 대한 부작용을 경험하면 실험이 즉시 종료되고 쥐는 제도적 지침에 따라 적절하게 안락사됩니다.
6. LTD 유도 후 쥐를 새장에 3 분 동안 보관 한 다음 집 새장에 다시 넣습니다.
7. 대조 실험의 경우 AAV5-tdTomato 대조 바이러스를 발현하는 쥐에 동일한 자극 절차를 사용하십시오. 가짜 실험의 경우 AAV5-oChIEF 바이러스를 발현하는 쥐의 광섬유에 패치 코드를 부착하지만 15분 세션 동안 자극이 전달되지 않습니다.

5. 큐 유도 코카인 탐색에 대한 광유전학적 자극의 효과 테스트

1. 생체 내 광유전학적 자극 24시간 후, 쥐를 조작적 컨디셔닝 챔버에 다시 넣습니다. 쥐는 코카인 추구 행동을 평가하기 위해 1-h 표준 큐 유도 복직 세션을 받게됩니다.
   알림: 큐 유도 복원 중에 활성 레버에 대한 응답은 코카인 관련 큐의 10초 프레젠테이션을 생성하지만 코카인 주입은 생성하지 않습니다.
2. 광유전학 LTD 유도가 코카인 추구를 장기간 억제하는지 확인하기 위해 첫 번째 검사 후 최소 1주일 후에 두 번째 복원 검사를 실시하십시오.

6. 바이러스 발현 및 광섬유 배치의 조직학적 검증을 위한 염색, 형광 및 이미징

1. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)와 4% 파라포름알데히드(PFA)를 만듭니다. 두 용액을 모두 얼음 위에 보관하십시오. 총 부피는 연구에서 쥐의 수에 따라 달라집니다(쥐당 ~100mL의 PBS와 200mL의 PFA가 사용됩니다).
   주의 : PFA는 독성 화학 물질이며 알려진 발암 물질입니다. 흡입 및 피부 접촉을 피하기 위해 적절한주의를 기울이십시오. 사용 및 폐기는 적절한 PPE 및 화학 물질 흐름 후드의 사용을 포함한 기관 지침에 따라야 합니다.
2. 연동 펌프를 20mL/min의 유속으로 설정합니다. 펌프의 튜브를 1x PBS로 채 웁니다. 무딘 20게이지 바늘을 튜브 끝에 부착합니다.
3. 쥐를 펜토바르비탈 나트륨(100mg/kg, i.p.)으로 깊게 마취합니다. 더 진행하기 전에 발가락 꼬집음에 대한 반응이 부족하여 마취 깊이를 확인하십시오.
   참고: 나트륨 펜토바르비탈은 관류가 말기 절차이기 때문에 사용됩니다.
4. 수술 용 가위를 사용하여 횡격막 아래 쥐의 복강을 자릅니다. 쥐의 심장을 노출시키기 위해 측면 가장자리를 따라 주둥이로 흉곽을 자릅니다. 지혈제를 사용하여 흉곽의 부분을 심장에서 멀리 고정하십시오. 심장을 둘러싸고 있는 위에 있는 지방 조직을 잘라냅니다.
5. 무딘 바늘을 좌심실을 통해 대동맥으로 삽입하십시오. 우심방에 작은 구멍을 뚫어 심장으로 돌아갈 때 용액을 배출하십시오.
6. 각 쥐를 1x PBS로 5분 동안 관류한 다음 4% PFA, pH 7.4로 10분 동안 관류합니다.
7. 쥐의 목을 베고 뇌를 추출한 다음 4% PFA에 24시간 동안 후미사를 붙입니다. 그런 다음 뇌를 30 % 자당 용액으로 2-3 일 옮깁니다.
8. 저온 유지 장치를 사용하여 50μm의 섹션 브레인.
9. LA 또는 MGN이 포함된 모든 슬라이스를 유리 슬라이드와 커버슬립에 장착합니다.
10. 에피형광 현미경을 사용하여 MGN의 AAV-oChIEF-tdTomato 발현과 LA로의 투영, LA 위의 광섬유 배치를 확인하기 위한 이미지 슬라이스.

7. 전기생리학 실험을 위한 관류 및 급성 뇌 절편 준비

참고 : 전기 생리 학적 실험은 in vivo LTD의 성공을 검증하기 위해 동물의 하위 집합에 대해 수행됩니다.

1. 표 1-3 ^4,13에 나열된 시약을 사용하여 전기 생리학 용액을 준비하십시오. HCl을 사용하여 모든 용액의 pH를 7.4로 조정하고 삼투압을 300-310 mOsm/kg H_2O로 조정합니다. 실험 전에 용액을 신선하게 만들고 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오. 사용 중 항상 모든 용액을 카보겐 (95 % O 2 / 5 % CO₂)으로 포화 시키십시오.
2. 지역 또는 기관의 동물 관리 및 사용 지침에 따라 이소 플루 란을 사용하여 밀폐 된 안락사 챔버에서 쥐를 깊이 마취시킵니다.  동물이 발가락 핀치 반사를 통해 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
3. 작은 비커에 50mL의 얼음처럼 차가운 절단 용액을 채웁니다. 연동 펌프의 튜브를 용액으로 채우고 유속을 20mL/min으로 조정합니다. 무딘 20게이지 바늘을 튜브 끝에 부착합니다.
4. 복강을 열고 (6.4 및 6.5 단계 참조) 쥐를 절단 용액으로 간단히 관류하십시오 (최대 1-2 분).
5. 관류 후 즉시 쥐의 목을 베십시오. 뇌를 제거하고 4 ° C 절단 용액으로 채워진 작은 비커에 30 초-1 분 동안 넣습니다.
6. 주걱으로 뇌를 옮기고 비브라톰의 챔버에 빠르게 고정시킵니다. 가는 집게를 사용하여 피아를 제거합니다. 챔버를 4°C 절단 용액으로 채우고 편도체의 급성 관상 절편(두께 250μm)을 0.37mm/sec의 속도와 70Hz의 주파수로 준비합니다.
7. 슬라이스가 얻어지면 절단 용액으로 채워진 홀딩 챔버에 각각을 놓고 37 ° C에서 10-12 분 동안 배양합니다. LA를 함유하는 약 5-7개의 슬라이스가 동물 당 수득될 수 있다.
8. 슬라이스를 실온(RT) 유지 용액의 비커로 옮기고 실험 전에 >30분 동안 회수합니다.
   알림: 슬라이스는 일반적으로 4-6시간 동안 유지 용액에 보관하는 동안 건강을 유지합니다. AAV의 형광 특성으로 인해 슬라이스는 저조도 조건에서 유지됩니다.

8. 생체 외 전기생리학적 기록

1. 표 4-5에 나열된 시약을 사용하여 세포 내 용액을 준비하십시오.
   참고: 세포 내 용액은 실험 전에 만들어야 하며 -80°C에서 장기(3-12개월) 또는 -20°C에서 단기간(1-2개월) 보관할 수 있습니다. 용액은 pH를 7.3으로 조정합니다 (Cs 기반 세포 내 용액의 경우 CsOH 및 K 기반 세포 내 용액의 경우 KOH 사용). 290-300 mOsm / kg H₂O의 최종 삼투압으로 조정하십시오.
2. 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 500mM 피크로톡신 원액을 준비한다.
   참고: 피크로톡신 주식은 분취되어 -20°C에서 보관됩니다. 사용 당일에, 분취량은 해동되고 최종 농도가 100 μM이 되도록 기록액에 첨가된다.
   주의 : 피크로 톡신은 GABA_A 수용체의 비 경쟁적 길항제이므로 피크로 톡신을 주입하면 자극 효과가 있습니다. 경구 섭취 또는 피부 흡수에 의해 심하게 독성이 있습니다. 피크로 톡신으로 작업 할 때는 항상 적절한 PPE를 사용해야합니다.
3. 전기 생리학 실험을 위해 설계된 정립 현미경으로 슬라이스를 옮깁니다.
4. 실험 중에 31-33 ° C로 가열 된 기록 용액으로 슬라이스를 지속적으로 관류합니다.
5. 4x 대물렌즈를 사용하여 LA를 확대합니다. 40x 수침 렌즈로 형태별로 주요 뉴런을 식별합니다.
6. Cs 기반 세포 내 용액(전압 클램프 실험용) 또는 K 기반 세포 내 용액(전류 클램프 실험용)으로 채워진 유리 피펫(3-5MΩ)을 사용하여 전체 셀 패치 클램프 기록을 얻습니다.
7. 형광 하에서 AAV에 감염된 MGN 축삭 돌기를 식별합니다(RFP 필터 사용). 펄스 발생기에 연결된 청색광(473nm) DPSS 레이저를 사용하여 투영을 자극합니다.
   주의: 레이저 노출을 제한하기 위해 시준된 레이저 광은 현미경의 형광 포트에 결합되고 대물렌즈를 통해 슬라이스에 초점을 맞춥니다.
   참고: 전압 클램프 모드에서 흥분성 시냅스 후 전류(EPSC)는 0.1Hz에서 광학적으로 유발됩니다. AAV에 감염된 MGN 뉴런으로부터 입력을 받는 뉴런은 신뢰할 수 있는 EPSC를 나타냅니다.
8. 생체 외 LTD를 유도하려면 전류 클램프 모드에서 최소 10분 동안 흥분성 시냅스 후 전위(EPSP)의 안정적인 기준선을 기록합니다. 다음으로, 1Hz(총 시간 = 1분)에서 473nm 빛의 900개의 2ms 펄스를 전달합니다. 그런 다음 EPSP를 0.1Hz에서 ≥60분 동안 계속 기록합니다.

결과

실험 순서를 요약한 타임라인이 그림 1에 나와 있습니다. 행동 실험 전반에 걸쳐 코카인 주입 횟수와 활성 레버에 대한 반응 수는 코카인 추구 행동의 강도를 측정하는 역할을합니다. 코카인자가 투여의 초기 일 동안, 활성 반응의 수는 두 번째 주 동안 안정화되기 전에 각 획득 일에 걸쳐 점차적으로 증가해야합니다. 반대로, 비활성 레버 반응은 실험 전체에서 낮게 유지되어야 합니다(그림 2A). 도구 멸종 첫날에는 예기치 않은 코카인 결핍으로 인해 코카인 추구 행동이 확대되기 때문에 일반적으로 적극적인 레버 반응의 수가 증가합니다. 그러나 이 반응은 쥐가 새로운 우발 상황을 알게 됨에 따라 후속 세션에서 점차 감소하여 6-10d 내에서 낮고 안정적인 수의 활성 레버 반응을 초래합니다(그림 2B). 실험의자가 투여 또는 도구 멸종 단계에서 지정된 획득 기준에 도달하지 못한 쥐는 ...

토론

위에서 설명한 것처럼 적절한 실험 결과를 얻는 데 중요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 코카인자가 투여를 적절하게 획득 한 동물에서만 효과적 일 수 있으며 현재까지는 위에 설명 된 매개 변수를 사용하여 테스트되었습니다. 코카인 복용량, 강화 일정 및 큐 매개 변수는 행동 결과에 거의 영향을 미치지 않고 수정 될 수 있지만, 2 차 강화 일정은 편도체 독립적 인 코카인 탐색으로 이어질 수 있다는 점을 제외하고는 절차의 효능을 감소시킬 수 있지만 직접 테스트되지는 않았지만¹⁴ . 프로토콜 전반에 걸쳐 광섬유의 적절한 구성과 기능을 검증하는 것이 성공적인 광학 자극을 보장하는 데 도움이 되는 몇 가지 사항이 있습니다. 헤드 캡의 손실을 방지하고 광섬유 연마를 위해 페룰을 적절하게 채점하고 임플란트를 통한 광 출력 손실이 30 %^를 초과하지 않는지 테스트해야합니다9. 또한 레이저 자극 매개 변수는 중요한 고려 사항입니다. 레이저는 상...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.9% 식염수	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. 자극 아이솔레이터	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		Lin et al., 2009 참조; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Ophhalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP 마그네슘 소금	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
염화칼슘	Fisher Scientific	C1016
염화 세슘	Fisher Scientific	289329
세슘 수산화물	Fisher Scientific	516988
세슘 메탄설포네이트	Fisher Scientific	C1426
코카인 HCl	NIDA 약물 공급 센터	9041-001
저온 유지 장치	라이카	CM1950
D-글루코스	시그마-알드리치	G8270
DMSO	피셔 사이언티픽	BP231-1
듀얼 채널 온도 컨트롤러	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
에탄올	피츠버그 대학교 화학 창고	200C5000
페룰 먼지 캡	Thor Labs	CAPL	1.25mm 페룰
룰 짝짓기 슬리브	Doric 렌즈	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, 청동, 1.25 mm ID
페룰	정밀 섬유 제품	MM-FER2007C-2300	Ø 1.25 mm 다중 모드 LC/PC 세라믹 페룰, Ø 230 &뮤; m 구멍 크기
광섬유	Thor Labs	FP200URT	200 μ m core 다중 모드 광섬유 (0.5 NA)
광섬유 로터리 조인트	Prizmatix	(아마존에서 주문)	직경 18mm, 광섬유
스트리핑 도구	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP 나트륨 염	Fisher Scientific	G8877
해밀턴 주사기	해밀턴	80085	10 μ L 볼륨, 26 게이지, 2 인치, 포인트 스타일 3
히트 건	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 ° F
열경화 에폭시	정밀 섬유 제품	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
염산	Fisher Scientific	219405490
Isoflurane	Henry Schein	29405
케타민 HCl	Henry Schein	55853	케타민은 규제 물질이므로 기관 지침에 따라 취급해야 합니다
. s	Henry Schein	9846
레이저, 드라이버 및 레이저-광섬유 커플러	OEM 레이저 시스템	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, 다이오드 펌핑 고체 레이저(1가지 옵션)
L-글루타티온	Fisher Scientific	G4251
리도카인	버틀러 Schein	14583
광 센서	Thor Labs	PM100D	디지털 디스플레이가 있는 소형 에너지 미터 콘솔
록타이트 순간 접착제	Grainger	5E207
황산 마그네슘	시그마-알드리치 203726
미세 전극 증폭기/데이터 수집	분자 장치	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
마이크로인젝터 펌프	Harvard Apparatus	70-4501	이중 주사기
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
현미경	Olympus	BX51WI	전기생리학용 직립 현미경
현미경	Olympus	BX61VS	에피 형광 슬라이드 스캐닝 현미경
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet 치과 시멘트, 액체	Lang Dental	1504BLK	블랙
Orthojet 치과 시멘트, 파우더	Lang Dental	1530BLK	컨템포러리 파우더, 블랙
파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148
패치 케이블	Thor Labs	FP200ERT	멀티모드, FT030 튜빙
픽크로톡신	피셔 사이언티픽	AC131210010
연마 디스크	Thor Labs	D50FC
연마 패드	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
연마지	Thor Labs	LFG5P	5 μ m 그릿
연마지	Thor Labs	LFG3P	3 μ m 그릿
연마지	토르 연구소	LFG1P	1 μ m 그릿
연마지	토르 연구소	LFG03P	0.3 μ m grit
염화칼	Sigma-Aldrich	P9333
수산화칼	륨 Fisher Scientific	P5958
메탄설포네이트 칼륨	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration 챔버 / 소프트웨어	Med Associates	MED-NP5L-D1
중탄산 나트륨	시그마 - 알드리치	S5761
염화나트륨	시그마 - 알드리치	S7653
수산화 나트륨	시그마 - 알드리치	1064980500
L- 아스코르브 산	나트륨 시그마 - 알드리치	A7631
펜토 바르비탈 나트륨	헨리 샤인	24352
나트륨 인산	Sigma-Aldrich	S9638
나트륨 포스포크레아틴	Fisher Scientific	P7936
나트륨 피루베이트	Sigma-Aldrich	P2256
스테인레스 스틸 기계 나사	WW Grainger	6GB25	M2-0.40mm 기계 나사, 팬, 필립스, A2 스테인리스 스틸, 일반, 페룰용 3mm 길이
입체 어댑터	Thor Labs	XCL
입체 프레임	스톨팅	51603
설탕	시그마-알드리치	S8501
봉합사	미세 과학 도구	18020-50	실크 실; 크기 : 5/0, 직경 : 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond 조직 접착제	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazine	Butler Schein	33198