여기에 설명 된 방법은 쥐의 행동 관련 회로에서 코카인으로 유도 된 가소성을 광학 유전 학적으로 역전시키는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 시상 편도체 시냅스의 지속적인 저주파 광 자극은 장기 우울증 (LTD)을 유도합니다. 코카인 경험이 있는 쥐에서 생체내 광유전학적으로 유도된 LTD는 단서-동기 약물 탐색의 후속 감쇠를 초래하였다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 광유전학적 도구를 사용하여 시상-편도체 회로에서 코카인 유발 가소성을 역전시켜 쥐의 후속 코카인 탐색 행동을 줄이는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 우리의 연구에서, 우리는 쥐가 시청각 신호와 쌍을 이루는 정맥 내 코카인을자가 투여 할 때, 시상 (MGN)의 내측 생식기 핵에서 측면 편도체 (LA)의 주요 뉴런으로의 입력에서 형성된 시냅스가 큐 - 코카인 연관성이 학습됨에 따라 더 강해진다는 것을 발견했습니다. 우리는이 시냅스에서 코카인으로 유도 된 가소성의 역전이 단서 동기 부여 코카인 추구 행동을 감소시킬 것이라고 가정했다. 생체 내에서 이러한 유형의 신경 조절을 달성하기 위해 MGN-LA 시냅스의 강도를 감소시키는 시냅스 장기 우울증 (LTD)을 유도하고자했습니다. 이를 위해 우리는 빛을 사용하여 뇌 회로의 신경 조절을 허용하는 광유전학을 사용했습니다. 흥분성 옵신 oChiEF는 oChiEF를 포함하는 AAV를 MGN에 주입하여 LA의 시냅스 전 MGN 말단에서 발현되었습니다. 그런 다음 광섬유를 LA에 이식하고 473nm 레이저 광을 1Hz의 주파수에서 15분 동안 펄스하여 LTD 및 역 코카인 유도 가소성을 유도했습니다. 이 조작은 마약 추구 행동을 유도하는 코카인과 관련된 단서의 능력을 오래 지속적으로 감소시킵니다.
서론
약물 남용은 미국과 전 세계적으로 매우 심각한 공중 보건 문제입니다. 수십 년간의 집중적인 연구에도 불구하고 효과적인 치료 옵션은 거의 없습니다 1,2. 치료의 주요 차질은 만성 약물 사용이 환경 단서와 약물 자체 사이에 장기적인 연관 기억을 생성한다는 사실입니다. 약물 관련 단서에 다시 노출되면 지속적인 약물 사용과 재발을 유발하는 생리적 및 행동적 반응을유도합니다3. 새로운 치료 전략은 약물 큐 연관성을 조절하는 데 관련된 회로를 조작하는 것을 목표로하는 기억 기반 치료법을 제정하는 것입니다. 최근에, 측면 편도체 (LA)의 시냅스, 특히 시상의 내측 생식기 핵 (MGN)에서 발생하는 시냅스는 반복적 인 큐 관련 코카인자가 투여에 의해 강화되며,이 강화는 코카인 추구 행동 4,5를 지원할 수 있음이 관찰되었습니다. 따라서 MGN-LA 시냅스에서 가소성을 역전시킴으로써 큐 유도 복원이 감쇠 될 수 있다고 제안되었습니다.
특정 뇌 회로의 시냅스 가소성을 정확하게 표적화하는 능력은 이 분야의 주....
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프로토콜
이 프로토콜에 설명 된 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에서 정한 지침과 일치하며 피츠버그 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 도착시 무게가 275-325g 인 성인의 순진한 Sprague-Dawley 쥐를 사용하여 수행되었습니다.
1. 광섬유 임플란트 및 패치 케이블의 건설
- 이전에 발표 된 프로토콜에 따라 광섬유 임플란트 준비9. 이 프로토콜에 설명 된 실험은 200 μm 코어 섬유 (0.5 NA) 및 Ø1.25 mm 다중 모드 LC / PC 세라믹 페룰, Ø230 μm 구멍 크기를 사용했습니다.
- Dremel 도구를 사용하여 페룰의 아래쪽 1/3(페룰의 평평한 끝에 가장 가까움)에 점수를 매깁니다. 페룰에 점수를 매기면 치과용 시멘트에 부착된 상태를 유지하는 데 도움이 되어 전체 실험 범위 동안 안전하게 유지될 가능성이 높아집니다.
- 와이어 커터를 사용하여 ~35mm의 섬유를 절단하십시오. 섬유 스트리핑 도구를 사용하여 ~25mm의 섬유를 제거하고 10mm는 노출되지 않은 상태로 둡니다.
- 제조업체의 지침에 따라 열 경화성 ....
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결과
실험 순서를 요약한 타임라인이 그림 1에 나와 있습니다. 행동 실험 전반에 걸쳐 코카인 주입 횟수와 활성 레버에 대한 반응 수는 코카인 추구 행동의 강도를 측정하는 역할을합니다. 코카인자가 투여의 초기 일 동안, 활성 반응의 수는 두 번째 주 동안 안정화되기 전에 각 획득 일에 걸쳐 점차적으로 증가해야합니다. 반대로, 비활성 레버 반응은 실험 전체에서 낮게 유지되어야 합니다(그림 2A). 도구 멸종 첫날에는 예기치 않은 코카인 결핍으로 인해 코카인 추구 행동이 확대되기 때문에 일반적으로 적극적인 레버 반응의 수가 증가합니다. 그러나 이 반응은 쥐가 새로운 우발 상황을 알게 됨에 따라 후속 세션에서 점차 감소하여 6-10d 내에서 낮고 안정적인 수의 활성 레버 반응을 초래합니다(그림 2B). 실험의자가 투여 또는 도구 멸종 단계에서 지정된 획득 기준에 도달하지 못한 쥐는 .......
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토론
위에서 설명한 것처럼 적절한 실험 결과를 얻는 데 중요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 코카인자가 투여를 적절하게 획득 한 동물에서만 효과적 일 수 있으며 현재까지는 위에 설명 된 매개 변수를 사용하여 테스트되었습니다. 코카인 복용량, 강화 일정 및 큐 매개 변수는 행동 결과에 거의 영향을 미치지 않고 수정 될 수 있지만, 2 차 강화 일정은 편도체 독립적 인 코카인 탐색으로 이어질 수 있다는 점을 제외하고는 절차의 효능을 감소시킬 수 있지만 직접 테스트되지는 않았지만14 . 프로토콜 전반에 걸쳐 광섬유의 적절한 구성과 기능을 검증하는 것이 성공적인 광학 자극을 보장하는 데 도움이 되는 몇 가지 사항이 있습니다. 헤드 캡의 손실을 방지하고 광섬유 연마를 위해 페룰을 적절하게 채점하고 임플란트를 통한 광 출력 손실이 30 %를 초과하지 않는지 테스트해야합니다9. 또한 레이저 자극 매개 변수는 중요한 고려 사항입니다. 레이저는 상.......
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공개 사항
공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 USPHS 보조금 K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) 및 펜실베니아 보건부의 지원을 인정하고자합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 식염수 | Fisher Scientific | NC0291799 | |
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| Artificial Tears (Ophhalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP 마그네슘 소금 | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| 염화칼슘 | Fisher Scientific | C1016 | |
| 염화 세슘 | Fisher Scientific | 289329 | |
| 세슘 수산화물 | Fisher Scientific | 516988 | |
| 세슘 메탄설포네이트 | Fisher Scientific | C1426 | |
| 코카인 HCl | NIDA 약물 공급 센터 | 9041-001 | |
| 저온 유지 장치 | 라이카 | CM1950 | |
| D-글루코스 | 시그마-알드리치 | G8270 | |
| DMSO | 피셔 사이언티픽 | BP231-1 | |
| 듀얼 채널 온도 컨트롤러 | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| 에탄올 | 피츠버그 대학교 화학 창고 | 200C5000 | |
| 페룰 먼지 캡 | Thor Labs | CAPL | 1.25mm 페룰 |
| 룰 짝짓기 슬리브 | Doric 렌즈 | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, 청동, 1.25 mm ID |
| 페룰 | 정밀 섬유 제품 | MM-FER2007C-2300 | Ø 1.25 mm 다중 모드 LC/PC 세라믹 페룰, Ø 230 &뮤; m 구멍 크기 |
| 광섬유 | Thor Labs | FP200URT | 200 μ m core 다중 모드 광섬유 (0.5 NA) |
| 광섬유 로터리 조인트 | Prizmatix | (아마존에서 주문) | 직경 18mm, 광섬유 |
| 스트리핑 도구 | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP 나트륨 염 | Fisher Scientific | G8877 | |
| 해밀턴 주사기 | 해밀턴 | 80085 | 10 μ L 볼륨, 26 게이지, 2 인치, 포인트 스타일 3 |
| 히트 건 | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 ° F |
| 열경화 에폭시 | 정밀 섬유 제품 | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 염산 | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 케타민 HCl | Henry Schein | 55853 | 케타민은 규제 물질이므로 기관 지침에 따라 취급해야 합니다 |
| . s | Henry Schein | 9846 | |
| 레이저, 드라이버 및 레이저-광섬유 커플러 | OEM 레이저 시스템 | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, 다이오드 펌핑 고체 레이저(1가지 옵션) |
| L-글루타티온 | Fisher Scientific | G4251 | |
| 리도카인 | 버틀러 Schein | 14583 | |
| 광 센서 | Thor Labs | PM100D | 디지털 디스플레이가 있는 소형 에너지 미터 콘솔 |
| 록타이트 순간 접착제 | Grainger | 5E207 | |
| 황산 마그네슘 | 시그마-알드리치 203726 | ||
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| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| 현미경 | Olympus | BX51WI | 전기생리학용 직립 현미경 |
| 현미경 | Olympus | BX61VS | 에피 형광 슬라이드 스캐닝 현미경 |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet 치과 시멘트, 액체 | Lang Dental | 1504BLK | 블랙 |
| Orthojet 치과 시멘트, 파우더 | Lang Dental | 1530BLK | 컨템포러리 파우더, 블랙 |
| 파라포름알데히드 | 시그마-알드리치 | P6148 | |
| 패치 케이블 | Thor Labs | FP200ERT | 멀티모드, FT030 튜빙 |
| 픽크로톡신 | 피셔 사이언티픽 | AC131210010 | |
| 연마 디스크 | Thor Labs | D50FC | |
| 연마 패드 | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| 연마지 | Thor Labs | LFG5P | 5 μ m 그릿 |
| 연마지 | Thor Labs | LFG3P | 3 μ m 그릿 |
| 연마지 | 토르 연구소 | LFG1P | 1 μ m 그릿 |
| 연마지 | 토르 연구소 | LFG03P | 0.3 μ m grit |
| 염화칼 | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| 수산화칼 | 륨 Fisher Scientific | P5958 | |
| 메탄설포네이트 칼륨 | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration 챔버 / 소프트웨어 | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| 중탄산 나트륨 | 시그마 - 알드리치 | S5761 | |
| 염화나트륨 | 시그마 - 알드리치 | S7653 | |
| 수산화 나트륨 | 시그마 - 알드리치 | 1064980500 | |
| L- 아스코르브 산 | 나트륨 시그마 - 알드리치 | A7631 | |
| 펜토 바르비탈 나트륨 | 헨리 샤인 | 24352 | |
| 나트륨 인산 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| 나트륨 포스포크레아틴 | Fisher Scientific | P7936 | |
| 나트륨 피루베이트 | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 스테인레스 스틸 기계 나사 | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm 기계 나사, 팬, 필립스, A2 스테인리스 스틸, 일반, 페룰용 3mm 길이 |
| 입체 어댑터 | Thor Labs | XCL | |
| 입체 프레임 | 스톨팅 | 51603 | |
| 설탕 | 시그마-알드리치 | S8501 | |
| 봉합사 | 미세 과학 도구 | 18020-50 | 실크 실; 크기 : 5/0, 직경 : 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond 조직 접착제 | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
참고문헌
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T.
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