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방법 논문

잎 딱정벌레의 숙주 - 장 microbiota 상호 작용 연구를위한 조직 배양 묘목으로 축 곤충 준비 및 사육

3.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63195

⸱

2021년 10월 8일

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, School of Life Sciences, Hubei University, 2Institute of Plant Protection, Wuhan Institute of Landscape Architecture, 3McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin

이 논문에서

요약

도끼 곤충을 얻기 위해 달걀 표면을 살균하고 부화 한 유충은 도끼 잎을 사용하여 사육됩니다. 이 방법은 항생제를 투여하거나 다른 잎을 먹는 곤충에도 적용 할 수있는 인공 식단을 개발하지 않고도 축산 곤충 준비를위한 효율적인 방법을 제공합니다.

초록

곤충 내장은 숙주의 생리적 특성에 심각한 영향을 줄 수있는 다양한 박테리아에 의해 식민지화됩니다. 특정 박테리아 균주를 축삭 곤충에 도입하는 것은 장내 미생물 기능을 검증하고 장내 미생물 - 숙주 상호 작용의 기초가되는 메커니즘을 밝히는 강력한 방법입니다. 항생제를 투여하거나 달걀 표면을 살균하는 것은 곤충에서 장내 박테리아를 제거하는 데 일반적으로 사용되는 두 가지 방법입니다. 그러나 곤충에 대한 항생제의 잠재적 인 부작용 외에도 이전 연구에 따르면 항생제를 먹이면 장내 박테리아를 제거 할 수 없다는 사실이 밝혀졌습니다. 따라서 세균이없는 인공 식단은 일반적으로 도끼 곤충을 유지하기 위해 사용되며, 이는 자연 식품의 영양 성분과 완전히 닮을 수없는 지루하고 노동 집약적 인 과정입니다. 여기에 설명 된 것은 잎 딱정벌레 (Plagiodera versicolora)의 축삭 유충을 준비하고 유지하기위한 효율적이고 간단한 프로토콜입니다. 특히, 딱정벌레 알의 표면은 멸균되었고, 그 다음에 세균이없는 포플러 잎이 도끼 유충을 후방하는 데 사용되었습니다. 곤충의 축삭 상태는 배양-의존적 및 배양-독립적인 검정을 통해 추가로 확인되었다. 종합적으로, 계란 소독과 무균 재배를 결합함으로써, 축삭 P. versicolora를 얻기 위해 효율적이고 편리한 방법이 개발되어 다른 잎을 먹는 곤충에게 쉽게 옮길 수있는 도구를 제공했습니다.

서론

포유류와 마찬가지로, 곤충 소화관은 음식 소화 및 흡수를위한 공동입니다. 대부분의 곤충은 내장에서 번성하고 숙주1이 제공하는 영양에 따라 사는 다양한 공생 박테리아를 가지고 있습니다. 장내 공생 공동체는 음식 소화 및 해독 2,3,4, 영양 및 개발 5,6,7, 병원균 및 기생충에 대한 방어 8,9,10,11, 화학 통신 12,13 및 행동 14를 포함하여 곤충의 여러 생리 과정에 중대한 영향을 미칩니다. ,15. 흥미롭게도, 일부 장내 미생물은 병원성이거나 병원균을 침범하여 감염을 악화시킴으로써 조작 될 수 있으며, 이는 장내 박테리아가 어떤 경우에는 해로울 수 있음을 나타냅니다16,17,18. 장내 박테리아는 또한 생명 공학 응용 및 해충 관리를위한 미생물 자원 역할을 할 수 있습니다. 예를 들어, 식물과 자일로파고우스 곤충으로부터의 리그노셀룰로오스-소화 박테리아는 바이오 연료(19)를 개발하기 위해 식물 세포를 소화하는데 사용되었다. 생리 활성 분자를 발현하는 조작 된 장 공생 물질의 분산은 유익한 곤충22의 적합성을 향상시키는 데 사용될 수있는 전염병 19,20,21을 전염시키는 농업 및 임업 해충 및 모기를 관리하기위한 새롭고 유망한 전술입니다. 따라서 장내 박테리아가 생체 내에서 어떻게 행동하는지 보여주는 것은 그 기능을 완전히 활용하고 다양한 응용 분야에 더 많이 활용하는 우선 순위로 간주됩니다.

동물은 장 1에 1 ~ >1000 종의 공생 미생물 종을 보유 할 수있습니다. 결과적으로, 개별 박테리아 탁사 또는 그들의 조립이 동물 내부에서 어떻게 수행되는지, 그리고 숙주 또는 그 미생물 파트너가 특정 기능을 구동하는지 여부를 정확하게 검증하는 것은 어렵다. 따라서 박테리아 기능과 곤충23과의 상호 작용을 조사하기 위해서는 모노 - 또는 다종 식민지화에 의해 gnotobiotic 곤충을 얻기 위해 축산 유충을 준비하는 것이 필요합니다. 현재 항생제 칵테일을 투여하고 곤충 알의 표면을 살균하는 것은 장내 박테리아14,24,25,26을 제거하는 일반적인 방법입니다. 그러나 항생제 식단은 장내 박테리아를 완전히 제거 할 수 없으며 숙주 곤충 생리학27,28에 부정적인 영향을 미칩니다. 결과적으로, 항생제 처리 곤충의 사용은 일부 장내 박테리아의 진정한 능력을 흐릴 수 있습니다. 다행히도 계란의 표면 살균은이 문제23,29를 무효화 할 수 있으며, 실험 곤충에는 아무런 영향을 미치지 않거나 무시할 수 있습니다. 또한, 인공 식단은 천연 곤충 식품과 완전히 유사 할 수 없으며, 인공 식단을 개발하는 것은 비용이 많이 들고 노동 소모적 인 과정30,31입니다.

버드 나무 잎 딱정벌레 인 Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera : Chrysomelidae)는 버드 나무 (Salix)와 포플러 (Populus L.)와 같은 소금기가있는 나무를 주로 먹는 광범위한 잎 먹는 해충입니다. 32,33. 여기서, 버드나무 잎 딱정벌레는 세균이 없는 곤충을 제조하고 후방하기 위한 프로토콜을 개발하기 위해 대표적인 잎을 먹는 곤충으로 사용되었다. 우리는 식물 조직 배양을 활용하여 멸균 된 알에서 P. versicolora axenic 유충을 후방으로 옮기기 위해 세균이없는 포플러 잎을 얻었습니다. P. versicolora 유충의 축삭 상태는 배양-의존적 및 배양-독립적인 검정을 통해 검증되었다. 이 프로토콜은 인공 식단으로 곤충을 기르는 것보다 야생 상태를 더 잘 모방 한 도끼 곤충을 유지할 수 있습니다. 더 중요한 것은,이 방법은 매우 저렴한 비용으로 편리하며, 이는 미래의 곤충 - 장내 미생물 상호 작용 연구, 특히 잘 발달 된 인공 식단이없는 비 모델 곤충의 경우 축삭 곤충을 얻을 수있는 가능성을 높입니다.

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프로토콜

1. 곤충 사육

  1. P. versicolora 개체군을 27 °C 및 70 ± 5 % 상대 습도의 조건에서 성장 챔버에 유지하고 16 h 빛 / 8 시간 어둠의 광주기로 유지하십시오. 타일 젖은 흡수 종이가있는 구멍이 뚫린 플라스틱 상자에 넣고 신선한 포플러 가지를 먹이십시오. 흡수 용지에 깨끗한 물을 뿌려 수분을 유지하고 이틀마다 가지를 바꿉니다.
  2. 번식 후 산란을 위해 성인을 격리하십시오. 더 많은 알을 얻기 위해 부드러운 잎을 먹이십시오.
  3. 새로 낳은 알을 모으십시오 (24 시간 이내). 축 유충을 준비하기 위해 60 시간 동안 촉촉한 흡수 종이에 알을 놓습니다.
    참고 : 새로 낳은 알은 ~ 72 시간 후에 부화 할 것입니다. 계란 표면을 살균하는 가장 좋은시기는 부화 전날입니다. 그렇지 않으면 성공적으로 부화 한 알의 수가 줄어 듭니다.

2. 세균 없는 포플러 배양

  1. Murashige and Skoog (MS) 배지와 1 mg/mL α-나프탈렌 아세트산(NAA) 원액을 준비 하십시오(물자 표 참조).
  2. 생물 안전 후드에서 1 mg / mL NAA 원액 50 μL를 MS 배지 500 mL에 넣고 잘 섞어서 흔들어 조직 배양 용기 당 ~ 50 mL를 부어 응고를 기다립니다.
  3. 메스, 알코올 램프 및 포셉을 준비하십시오. 생물 안전 후드의 알코올 램프 불꽃에서 메스와 포셉을 살균하십시오.
  4. ~ 1 개월의 성장 (세균이없는 조직 배양 묘목)에서 포플러 묘목에서 정점 새싹 또는 측면 새싹이있는 3-4cm 줄기 세그먼트를 자르고 용기 당 하나 또는 두 개의 줄기 세그먼트 인 배양 배지에 삽입하십시오.
  5. 이들 줄기 세그먼트를 25°C의 성장 챔버 및 50 ± 10 cd 광의 세기로 약 30일 동안 16 h 광/8 h 어둠의 광주기로 인큐베이션한다. 세균이없는 잎을 사용하여 도끼 애벌레에게 먹이를줍니다.

3. 계란 표면 살균 및 도끼 유충 사육

  1. 오토클레이브 페트리 요리, 페인트 브러시, 여과지, 증류수 및 LB (Luria-Bertani) 한천 배지가 들어있는 페트리 접시.
  2. 부착성 계란이있는 잎을 페트리 접시에 넣고 포셉을 사용하여 잎에서 계란을 조심스럽게 제거한 다음 다른 페트리 접시로 옮깁니다.
    참고 :이 단계는 계란이 잎에 부착되어 있기 때문에 매우 조심스럽게 수행해야합니다.
  3. 이 달걀을 75 % 에탄올로 8 분 동안 씻고 멸균수로 네 번 씻기를 반복하십시오.
  4. 부화를 위해 수분을 보존하기 위해 알을 LB 한천 배지로 옮깁니다.
    참고 : LB 한천 배지를 사용하면 소독 된 난자가 세균이 없는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  5. Petri 접시를 성장 챔버에 놓고 계란이 24 시간 이내에 부화 할 때까지 기다리십시오.
  6. 생물 안전 후드에서 페트리 접시에 젖은 여과지 세 조각을 타일링하고 종이에 세균이없는 포플러 잎을 놓고 유충을 모아서 나뭇잎에 놓고 파라 필름으로 페트리 접시를 밀봉 한 다음 27 ° C 및 70 ± 5 % 상대 습도의 성장 챔버에서 16 시간 빛 / 8 시간 어둠의 광주기로 배양하십시오.
    참고 : 조직 배양 잎은 섬세하며 물을 빨리 잃을 수 있습니다. 따라서 잎을 페트리 접시로 옮길 때 촉촉한 여과지를 사용해야합니다.
  7. 이틀마다 잎을 바꿉니다.
  8. 전통적으로 사육 된 그룹의 경우, 잎에서 젖은 여과지가 들어있는 페트리 접시로 알을 옮기고이 애벌레에게 세균이없는 포플러 잎을 먹이십시오.

4. 배양 의존성 분석을 통한 축산 유충의 검증

  1. 무작위로 3 개의 1st, 2nd 및 3번째 instar 유충을 세균이없고 전통적으로 사육 된 그룹에서 선택하십시오.
  2. 입체 현미경으로 멸균 된 가위와 포셉으로 3번째 인스타 유충을 해부하고 마이크로 원심 분리기 튜브에 내장을 수집하십시오. 튜브에 손상되지 않은 1번째와 2번째 인스타 유충을 수집하십시오.
    참고 : 해부하기에는 너무 작기 때문에 1번째와 2번째 인스타 유충 전체를 수집하고 내장을 그대로 유지하십시오.
  3. 100 μL의 인산염 완충 식염수와 세 개의 스틸 볼을 1.5 mL 튜브에 첨가하고, 비드 비트 호모게나이저를 사용하여 조직을 균질액으로 분쇄한다.
  4. 100 μL의 균질액을 LB 한천 배지 및 플레이트에 멸균 유리 확산 막대를 사용하여 첨가한다.
  5. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 놓고 박테리아 콜로니를 관찰하였다.

5. 문화 독립적 인 분석을 통한 도끼 개인의 검증

  1. DNA 추출 키트를 사용하여 조직(섹션 4에서 수득됨)의 총 DNA를 추출한다.
  2. 260nm에서 분광광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
  3. 박테리아 16S rRNA 유전자를 PCR과 함께 유니버셜 16S rRNA 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 반응 시스템을 18 μL의 1.1x PCR 마스터 믹스 ( 물질의 표 참조), 0.5 μL의 27F 프라이머 (5'-ACGGATACCTTTTTTTACGAC-3'), 0.5 μL의 1495R 프라이머 (5'-ACGGATACCTTTTTTTACGAC-3') 및 100 ng 주형 DNA로 설정한다. PCR 조건을 95°C에서 3분 동안 설정하고; 30초 동안 95°C, 1분 동안 55°C, 및 1분 동안 72°C의 28 사이클; 이어서 72°C에서 10분 동안 반응시켰다. PCR 산물을 추가 분석될 때까지 4°C에서 보관한다.
  4. PCR 산물을 핵산 염료와 혼합하고, 1x TAE 완충액의 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 사용하여 분석한다. 10 μL의 DNA 마커를 참조로 사용한다.
  5. UV 트랜스 조명기로 젤을 관찰하고 약 1,500 bp의 표적 단편을 찾으십시오.

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결과

P. versicolora의 수명 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 성인 남성은 성인 여성보다 작습니다(그림 1A). 들판에서, 딱정벌레는 잎에 알을 모은다. 여기에서는 잎에서 네 개의 알을 떼어냈다(그림 1B). 도끼 곤충 사육에 사용되는 포플러 줄기 세그먼트와 묘목은 그림 2에 나와 있습니다. 3번째 인스타 유충의 내장은 그림 3에 나와 있으며 장 세그먼트는 흰색 브래킷으로 표시되어 있습니다.

어떠한 세균 군에서도 박테리아 콜로니가 관찰되지 않았지만, 이들은 통상적으로 사육된 모든 그룹에서 관찰되었으며(그림 4), 이는 조직...

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토론

세균이 없는 유충을 제조하고 특정 박테리아 균주를 재도입하여 gnotobiotic 유충을 얻는 것은 숙주-미생물 상호작용의 기초가 되는 기전을 밝히는 강력한 방법이다. 새로 부화 한 유충은 두 가지 주요 방법으로 장내 미생물을 얻습니다 : 어머니로부터 자손으로의 수직 전달 또는 형제 자매와 환경으로부터의 수평 획득34. 전자는 난자 표면(35)의 오염을 통해 자손에게 부모를 옮기는 것에 의해 성취될 수 있다. 따라서, 곤충 달걀 표면27,28,29를 살균하여 축 유충을 얻는 것은 매우 실현 가능하다. 여러 항생제의 칵테일을 투여하는 것은 도끼 곤충을 개발하는 또 다른 방법이지만 몇 가지 단점이 있습니다28. 대조적으로, 도끼 식단에 이어...

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공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31971663)과 CAST (2020QNRC001)의 젊은 엘리트 과학자 후원 프로그램이 자금을 지원했습니다.

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재료



이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 주사기 필터MilliporeSLGP033RB
1 mg/mL NAA 원액a. 0.1 M NaOH 용액 준비(증류수 200 mL에 0.8 g NaOH 용해).
b. 250 mL 비커에 0.2 g NAA를 첨가하고 NAA가 용해될 때까지 0.1 M NaOH 용액을 약간 첨가한 다음 증류수로 최종 부피를 200 mL로 조정하십시오.
c. 용액을 여과하여 0.22 µ로 박테리아를 제거합니다. m 주사기 필터와 50mL 멸균 주사기를 사용하여 용액을 1.5mL 원심분리 튜브에 서브패키징하고 -20°C에서 복원합니다.
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Sangon BiotechF600620
10x PBS 스톡 솔루션Biosharp Life SciencesBL302A
2 M KOH 용액200 mL에 22.44 g KOH(분자량: 56.1)를 용해하고 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
250 mL 및 2,000 mL 비커Shubosb16455
50 mL 멸균 주사기JintaJT0125789
500 mL 측정 실린더Shubosb1601
50x TAE 재고 용액a.  242g의 트리스와 18.612g의 EDTA를 700mL의 증류수에 용해시킵니다.
b. 약 57.1mL의 아세트산으로 pH를 7.8로 조정합니다.
c. 최종 부피를 1,000mL.
d로 조정합니다. 원액을 사용시 1x TAE 완충액으로 희석하였다.
75% 에탄올Xingheda trade
α-naphthalene acetic acid (NAA)Solarbio Life Sciences86-87-3
흡수지22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm
아세트산Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
AgarCoolaber9002-18-0
AgaroseBiowest111860
오토클레이브파나소닉MLS-3781L-PC
비드 박동 균질화 기Jing XinXM-GTL64
DNA 추출 키트MP Biomedicals116560200
EDTASaiguo Biotech1340
여과지Jiaojie70mm 직경
젤 전기 영동 장치Bio-rad164-5052
겔 신호 녹색 핵산 염료TsingKeTSJ003
무균 포플러 묘목Shan Xin 포플러 산 동 성 루동 대학교
골든 스타 슈퍼 PCR 마스터 믹스 (1.1×)TsingKeTSE101
성장 챔버RuihuaHP400GS-C
LB 한천 매체a. 300mL의 증류수에 5g의 트립톤, 5g의 NaCl, 2.5g의 효모 추출물을 용해시킵니다.
b. 최종 부피를 500mL로 조정하고 용액을 1,000mL 원추형 플라스크로 옮기고 7.5g 한천을 추가합니다.
c. 121°C에서 20분 동안 배지를 오토클레이브합니다.
MS basic mediumCoolaberPM1121-50LM0245
MS 고체 배지 두 부분으로 분리하고 1,000mL 코니컬 플라스크 2개로 옮기고 500mL.
d당 2.6g 한천을 추가합니다. 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브.
NanoDrop 1000 분광 광도계Thermo Fisher Scientific
Paintbrush1cm 너비, 난자 채취에 사용
ParafilmBemisPM-996
PCR Thermal CyclersEppendorf6331000076
Petri DishesSupin직경 90mm
pH 측정기METTLER TOLEDOFE20
피펫 0.2-2 &마이크로; LGilsonECS000699
피펫 100-1,000 µ LEppendorf3120000267
피펫 20-200 &마이크로; LEppendorf3120000259
피펫 2-20 &마이크로; LEppendorf3120000232
식물 조직 배양 용기ChembaseZP21240 mL
플라스틱 상자2.35 L
수산화칼륨 (KOH)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
박테리아 16S rRNA 유전자 증폭용 프라이머Sangon Biotech27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'
염화나트륨 (NaCl)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
수산화나트륨 (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
조직 분쇄에 사용되는강구0.25mm
실체현미경OLYMPUSSZ61
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
Trans2K plus II DNA 마커Transgene BiotechBM121-01
Tris baseBiosharp Life Sciences1115
TryptoneThermo Fisher Scientific  LP0037
UV transilluminatorMonad BiotechQuickGel 6100
VortexerScilogexMX-S
버드 나무 분기Sha Lake Park, 우한, 중국
버드 나무 잎 딱정벌레Huazhong 농업 대학, 우한, 중국
효모 추출물Thermo Fisher ScientificLP0021
무균 포플러 묘목 배양을 위한 미니 원심분리기 DRAGONLAB D1008 a. 800mL의 증류수에 4.43g MS 기본 배지 분말과 30g 자당을 용해시킵니다. b. pH 측정기로 2M KOH로 pH를 약 5.8로 조정합니다. c. 최종 부피를 1,000mL로 조정하고,

참고문헌

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