종이 기반 토홀드 스위치 진단의 개발 및 환자 검증을 위한 설계-구현 연구

Summary

분산 테스트를 위해 커뮤니티에 배포할 수 있는 분산형, 저비용 및 고용량 진단에 대한 액세스는 글로벌 보건 위기에 대처하는 데 매우 중요합니다. 이 원고는 휴대용 광학 판독기로 검출할 수 있는 바이러스 RNA 서열에 대한 종이 기반 진단을 구축하는 방법을 설명합니다.

Abstract

테스트를 위해 커뮤니티에 배포할 수 있는 저부담 분자 진단에 대한 접근이 점점 더 중요해지고 있으며 사회의 웰빙과 경제적 안정에 의미 있는 광범위한 영향을 미칩니다. 최근 몇 년 동안 신속하고 저렴한 분자 진단의 필요성을 충족시키기 위해 몇 가지 새로운 등온 진단 방식이 등장했습니다. 우리는 모기 매개 Zika 및 chikungunya 바이러스에 대한 진단을 포함하여 발가락 스위치 기반 진단의 개발 및 환자 검증을 통해 이러한 노력에 기여했으며, 이는 금 표준 역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 기반 분석에 필적하는 성능을 제공했습니다. 이러한 진단은 개발 및 제조 비용이 저렴하며 리소스가 부족한 환경에 진단 용량을 제공할 수 있는 잠재력이 있습니다. 여기서 프로토콜은 Zika 바이러스 검출을 위한 스위치 기반 분석의 개발에 필요한 모든 단계를 제공합니다. 이 기사는 단계별 진단 개발 프로세스를 통해 독자를 안내합니다. 첫째, Zika 바이러스의 게놈 서열은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 후보 스위치의 계산 설계를 위한 입력 역할을 합니다. 다음으로, 합성 RNA 서열을 이용한 경험적 스크리닝 및 진단 민감도의 최적화를 위한 센서의 조립이 도시된다. 완료되면 RT-qPCR 및 특수 제작된 광학 리더인 PLUM과 병행하여 환자 샘플을 사용하여 검증을 수행합니다. 이 작업은 인간 건강, 농업 및 환경 모니터링에 적용되는 저비용 토홀드 스위치 기반 센서 개발을 위한 기술 로드맵을 연구자에게 제공합니다.

Introduction

RT-qPCR은 뛰어난 민감도와 특이성으로 인해 임상 진단을 위한 황금 표준 기술로 남아 있습니다. 이 방법은 매우 견고하지만 온도 제어 분배 및 보관이 필요한 값 비싼 특수 장비 및 시약에 의존합니다. 이는 전 세계적으로, 특히 질병 발생 시기와 시설이 잘 갖춰진 실험실에 대한 접근^{이 제한된 지역에서} 품질 진단의 접근성에 상당한 장벽을 제시합니다^1,2. 이것은 브라질에서 2015/2016 Zika 바이러스가 발생하는 동안 관찰되었습니다. RT-qPCR 테스트를 제공할 수 있는 중앙 집중식 실험실이 5개뿐이었기 때문에 심각한 병목 현상이 발생하여 진단에 대한 액세스가 제한되었습니다. 이것은 발병 ^3,4로 더 심각한 영향을 받은 도시 주변 환경의 개인에게 특히 어려웠습니다. 진단에 대한 액세스를 개선하기 위한 노력의 일환으로 이 프로토콜은 리소스가 적은 설정에서 분산되고 저렴한 고용량 진단을 제공할 수 있는 잠재력을 가진 플랫폼을 보여줍니다. 그 일환으로 등온 증폭 및 합성 RNA 스위치 기반 센서를 종이 기반 무세포 발현 시스템 ^5,6과 결합하는 진단 발견 파이프라인이 구축되었습니다.

무세포 단백질 합성(CFPS) 시스템, 특히 대장균 기반 무세포 시스템은 환경 모니터링 7,8 에서 병원체 진단^{5,6,9,10,11,12}에 이르기까지 광범위한 바이오센싱 애플리케이션을 위한 매력적인 플랫폼입니다. . 전사 및 번역에 필요한 구성 요소로 구성된 CFPS 시스템은 전체 세포 바이오센서에 비해 상당한 이점이 있습니다. 구체적으로, 감지는 세포벽에 의해 제한되지 않으며, 일반적으로 모듈식으로 설계되고, 생체안전하고, 저렴하고, 휴대용으로 동결건조될 수 있다. 유전자 회로 기반 반응을 종이 또는 직물과 같은 기질에 동결 건조하는 기능은 운송, 실온에서 장기 보관⁵, 심지어 웨어러블 기술¹³에 통합할 수 있습니다.

이전 연구는 E. coli cell-free 시스템을 사용하여 수은과 같은 독성 금속, 테트라 사이클린 7,14와 같은 항생제, 내분비 교란 화학 물질^15,16, 히푸르 산 (hippuric acid)과 같은 바이오 마커 (17), 병원체 관련 쿼럼 감지 분자 ^9,18 및 코카인¹⁷ 및 감마 하이드 록시 부티레이트 (GHB)와 같은 불법 물질과 같은 수많은 분석 물을 검출하는 데 사용될 수 있음을 입증했습니다.¹⁹ . 핵산의 서열 특이적 검출을 위해, 전략은 대부분 등온 증폭 기술에 결합된 스위치 기반 바이오센서의 사용에 의존해 왔다. 토홀드 스위치는 리보솜 결합 부위(RBS)와 시작 코돈을 격리하여 다운스트림 번역을 차단하는 헤어핀 구조를 포함하는 합성 리보레귤레이터(텍스트의 나머지 부분에서는 간단히 '스위치'라고도 함)입니다. 그들의 표적 트리거 RNA와의 상호작용시, 헤어핀 구조가 완화되고 리포터 개방 판독 프레임의 후속 번역이 활성화된다(²⁰).

등온 증폭은 또한 분자 진단²¹로서 사용될 수 있다; 그러나, 이들 방법은 비특이적 증폭에 취약하며, 이는 특이성을 감소시킬 수 있고, 이에 따라 시험의 정확도를 RT-qPCR ²²의 정확도 이하로 감소시킬 수 있다. 여기에 보고된 작업에서 스위치 기반 센서의 상류 등온 증폭은 임상적으로 관련된 핵산(펨토몰에서 아토몰까지)의 검출을 가능하게 하는 결합된 신호 증폭을 제공하는 데 사용되었습니다. 두 방법의 이러한 쌍은 또한 조합하여 높은 수준의 특이성을 제공하는 두 개의 시퀀스별 체크포인트를 제공합니다. 이 접근법을 사용하여 이전 연구는 Zika⁶, Ebola⁵, Norovirus¹⁰과 같은 바이러스뿐만 아니라 C. difficile²³ 및 항생제 내성 장티푸스¹²와 같은 병원성 박테리아의 검출을 입증했습니다. 가장 최근에는 COVID-19 대유행^11,12,13에 대한 접근 가능한 진단을 제공하기 위한 노력의 일환으로 SARS-CoV-2 감지를 위한 무세포 토홀드 스위치가 입증되었습니다.

다음 프로토콜은 인실리코 바이오센서 설계에서 조립 및 최적화 단계를 거쳐 환자 샘플을 사용한 현장 검증에 이르기까지 지카 바이러스 검출을 위한 무세포 종이 기반 합성 토홀드 스위치 분석의 개발 및 검증을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 RNA 토홀드 스위치 기반 센서와 지카 바이러스 RNA에 특이적인 등온 증폭 프라이머의 인실리코 설계로 시작됩니다. 수많은 등온 증폭 방법이 존재하지만, 여기에서 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 사용하여 반응에 존재하는 바이러스 RNA 표적의 농도를 증가시켜 임상적으로 유의한 민감도를 가능하게 하는 것이 입증되었습니다. 실제로 등온 증폭 방법은 일정한 온도에서 작동하는 이점이 있으므로 일반적으로 중앙 집중식 위치로 제한되는 열 순환기와 같은 특수 장비가 필요하지 않습니다.

다음으로, 중첩 확장 PCR을 통해 리포터 코딩 서열을 갖는 합성 발가락 스위치 센서를 조립하고, 합성 RNA를 사용하는 무세포 시스템에서 최적의 성능을 위해 합성 발가락 스위치 센서를 스크리닝하는 과정을 설명한다. 이 지카 바이러스 센서 세트의 경우 비색 기질인 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(CPRG)를 절단할 수 있는 β-갈락토시다아제 효소를 암호화하는 lacZ 유전자를 선택하여 눈이나 플레이트 리더로 감지할 수 있는 노란색에서 보라색으로의 색상 변화를 생성합니다. 최고 성능의 합성 스위치가 확인되면 합성 RNA를 사용하여 해당 표적 서열의 핵산 서열 기반 등온 증폭을 위한 프라이머를 스크리닝하여 최상의 감도를 제공하는 세트를 찾는 프로세스가 설명됩니다.

마지막으로, 진단 플랫폼의 성능은 라틴 아메리카 현장에서 검증됩니다(그림 1). 임상 진단 정확도를 결정하기 위해, 종이 기반 무세포 분석은 환자로부터의 지카 바이러스 샘플을 사용하여 수행되고; 비교를 위해 금 표준 RT-qPCR 분석이 병행하여 수행됩니다. 비색 무세포 분석을 모니터링하기 위해 열 순환기를 사용할 수 없는 지역에서 결과를 현장에서 정량화할 수 있습니다. 휴대용, 저비용, 사용자 친화적, 다중 모드 (PLUM, 이하 휴대용 플레이트 리더라고 함)라고하는 손으로 조립 된 플레이트 리더도 여기에 소개됩니다²⁴. 처음에는 무세포 합성 토홀드 스위치 진단을 위한 동반 장치로 개발된 휴대용 플레이트 리더는 높은 처리량 방식으로 결과를 배양하고 읽을 수 있는 접근 가능한 방법을 제공하여 사용자에게 통합된 컴퓨터 비전 기반 소프트웨어 분석을 제공합니다.

그림 1: 종이 기반 무세포 토홀드 스위치 반응을 사용하여 환자 샘플을 테스트하는 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

Protocol

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 세계 의학 협회 헬싱키 선언에 의해 수립 된 인간 피험자와 관련된 의학 연구의 윤리 원칙을 포함하여 윤리적 기준 및 관련 지침에 따라 수행되어야합니다. 이 연구는 라이센스 프로토콜 번호 CAAE : 80247417.4.0000.5190에 따라 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에 포함 된 모든 환자의 정보에 입각 한 동의는 진단 샘플에 대한 Fiocruz-PE 기관 검토위원회 (IRB)에 의해 포기되었습니다.

알림: PLUM 장치는 이후 '휴대용 플레이트 리더'라고 합니다.

1. 핵산서열 기반 증폭 프라이머의 전산 설계

1. Zika 게놈을 스캔하여 게놈 서열을 NCBI/뉴클레오티드 BLAST ^25,26에 넣어 길이가 약²⁰⁰뉴클레오티드(nt)에서 300nt인 증폭 후보 영역 세트를 식별합니다. 게놈을 참조 RNA 서열(refseq_rna)과 비교하고 고도로 보존된 상태로 유지되고 인간 게놈과 상동성이 없는 부위를 검색합니다(다른 BLAST 매개변수는 변경되지 않음). 합성 토홀드 스위치를 설계할 사이트를 두 개 이상 선택하십시오.
2. Deiman et ^al.27 의 선택 기준을 사용하여 각 후보 증폭 영역에 대한 정방향 및 역방향 핵산 서열 기반 증폭 프라이머 쌍을 생성합니다. 간단히 말해서, 프라이머 설계를위한 다음 기준을 따르십시오 : (1) 40 % -60 % 사이의 GC 함량; (2) 41°C 이상의 DNA 용융 온도를 갖는 길이 20 내지 24 nt; (3) 4개 이상의 동일한 뉴클레오티드의 실행 없음; (4) 최종 3' 뉴클레오티드는 A 염기이고; (5) 낮은 프라이머 2차 구조 및 이량체 형성 확률. 각 표적 영역에 대해 8-10개의 프라이머 쌍을 스크리닝합니다(권장).
3. T7 RNA 중합효소 (RNAP)를 사용하여 앰플리콘의 전사를 허용하기 위해 정방향 프라이머의 5' 말단에 T7 프로모터 서열AATTC TAATACGACTCACTATAGGG(밑줄이 그어진 T7 프로모터 서열)를 포함하는 접두사 서열을 추가합니다. 프라이머를 DNA 합성 회사의 DNA 올리고로 주문하십시오.

2. 토홀드 스위치의 전산 설계

1. 웹 사이트²⁸ 의 지침에 따라 NUPACK 3.2 버전²⁹(핵산 디자인 제품군)를 설치합니다. UNIX 운영 체제와 MATLAB(수치 컴퓨팅 플랫폼)을 프로그래밍 언어로 사용합니다(권장).
2. 단계 1.1에서와 같이 토홀드 스위치 설계에 대한 관심 병원체에 특이적인 표적 서열(예: 바이러스 게놈)을 식별합니다. 단계 1.2에서 생성된 핵산 서열 기반 앰플리콘으로부터 Zika 표적 서열을 선택한다.
   참고: 실제로 핵산 서열 기반 증폭 프라이머 또는 합성 토홀드 스위치는 사용자의 요구에 따라 먼저 설계하고 테스트할 수 있습니다. 관심의 특정 표적 영역이 이미 확립된 경우(예를 들어, 기존의 간행물 또는 진단 프로토콜로부터), 발가락 스위치 설계 및 스크리닝이 먼저 발생하고, 이어서 핵산 서열-기반 증폭 프라이머에 대한 설계 및 스크리닝이 발생할 수 있다. 확립된 표적 영역이 없는 경우, 먼저 전체 게놈에 대해 핵산 서열 기반 증폭 프라이머를 스크리닝하여 프라이머 증폭 효율을 위해 선택하는 동안 선택한 표적을 좁힙니다. 병원체에 대한 여러 서열을 사용할 수 있는 경우 전체 게놈을 스크리닝하는 대신 고도로 보존된 영역에 초점을 맞춘 핵산 서열 기반 증폭 프라이머를 설계하는 것이 가장 좋습니다.
3. 컴퓨터에 필요한 MATLAB 소프트웨어를 다운로드하여 설치합니다.
4. 소프트웨어에서 핵산 설계 제품군 기능을 호출할 수 있도록 환경 변수를 설정합니다. 이렇게 하려면 소프트웨어를 연 다음 기본 작업 폴더에서 startup.m 파일을 열거나 만듭니다. 그런 다음 다음 코드 줄을 startup.m 파일에 복사하고 마지막으로 핵산 디자인 제품군 바이너리가 포함된 폴더를 PATH에 추가합니다.
   NUPACKINSTALL = '/Users/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. 수치 컴퓨팅 플랫폼 소프트웨어를 열고 설계 소프트웨어 폴더로 이동합니다. https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN 에서 액세스할 수 있는 설계 알고리즘을 실행합니다.
6. 입력 하위 폴더에 있는 design_input_file.csv에 대상 시퀀스를 입력합니다. 입력에는 표 1에 정의된 이름, 외부 시퀀스, 내부 시퀀스, 온도, 출력 이름 및 출력 시퀀스가 포함됩니다. 대상에 대한 프라이밍 부위가 아직 결정되지 않은 경우 내부 및 외부 시퀀스를 동일하게 유지합니다. 설계 과정에서 보고자의 처음 29nt만 고려됩니다. 완료되면 업데이트된 스프레드시트를 저장하고 닫습니다.
   참고: 출력 서열은 분석에 사용하도록 계획된 리포터 단백질(예: lacZ)의 서열입니다. 내부 및 외부 시퀀스를 지정하면 알고리즘이 프라이머 중 하나와 겹치는 합성 토홀드 스위치를 생성하지 않습니다. 또한 분석이 Zika 게놈의 세 가지 고유 한 부위를 인식하여 특이성을 개선하도록합니다.
7. 설계 기능에 사용할 모수를 선택합니다: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, 옵션). 매개 변수 값을 다음과 같이 채웁니다.
   1. num_designs - 소프트웨어의 각 대상 출력에 대한 상위 설계 수입니다. 기본값은 6이며 필요에 따라 변경할 수 있습니다(각 대상에 대해 최소 6개의 디자인 권장).
   2. input_file - 이 매개 변수는 입력 시퀀스 정보를 제공하는 파일의 이름을 지정합니다. 기본값은 'design_input_file.csv'이며 필요에 따라 변경할 수 있습니다.
   3. 다음 옵션 중에서 선택하십시오 - (1) 시리즈 A 및 시리즈 B : 코드가 생성 할 toehold 스위치의 버전. 시리즈 B를 1로, 시리즈 A를 0으로 설정하여 Zika 바이러스 진단⁶에 사용되는 형식인 시리즈 B 토홀드 스위치를 생성합니다. (2) 병렬: 설계를 계산하기 위해 여러 코어를 활용하려면 1로 설정합니다. 그렇지 않으면 0으로 설정합니다. (3) 안티센스: 타겟 입력의 안티센스 시퀀스(즉, 역방향 보수)를 혼성화하는 토홀드 스위치를 생성하기 위해 1로 설정하고; 그렇지 않으면 0으로 설정합니다.
8. 선택한 매개변수 toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options)를 사용하여 설계 기능을 실행합니다. 그런 다음 알고리즘은 관심 대상에 대한 토홀드 스위치 설계를 생성하기 시작합니다.
9. 설계가 완료되면 final_designs 폴더에서 상단 토홀드 스위치 설계 시퀀스와 해당 대상 시퀀스를 .csv 형식 스프레드시트 형식으로 찾습니다. 상기 알고리즘에 의해 생성된 토홀드 스위치 DNA 서열은 5' 말단에 T7 프로모터 서열 및 3' 말단에 보존된 21 nt 링커 서열 AACCTGGCGGCAGCAAAAG를 포함할 것이다.
10. 생성된 상단 발가락 스위치 설계 서열을 NCBI-BLAST에 놓고 서열 상동성을 확인하여 다른 일반적인 바이러스에 대해 스크리닝합니다. 40% 상동성 이하의 서열을 받아들입니다.
11. 발가락 스위치 헤어핀 서열을 DNA 올리고로 주문하고 나중에 리포터 유전자와 함께 완전한 기능의 스위치로 조립합니다. 선택한 리포터 단백질에 따라 후속 센서 조립에 필요한 PCR 프라이머를 주문하십시오.

매개 변수	정의
이름	출력 토홀드 스위치 시퀀스의 원하는 이름입니다.
외부 시퀀스	증폭에서 생성 된 전체 NASBA 성적표.
내부 시퀀스	프라이머 결합 부위를 제외한 외부 서열. 외부 서열과 일치하지만 정방향 및 역방향 프라이머에 결합하는 전사체 부분은 제외합니다.
온도	알고리즘이 RNA 구조를 계산하는 데 사용하는 온도입니다.
출력 이름	출력 유전자의 이름(예: lacZ, gfp).
출력 순서	출력 유전자의 서열.

표 1: 토홀드 스위치 설계 소프트웨어에 사용되는 각 매개변수의 정의.

3. PCR에 의한 토홀드 스위치 구축

알림: 이 단계에서는 오버랩 확장 PCR에 의한 LacZ 토홀드 스위치의 구성을 설명합니다. 여기서, DNA 올리고는 순방향 프라이머로 사용되고 T7 터미네이터는 역방향 프라이머로 사용된다. 우리는 pCOLADuet-LacZ 플라스미드를 lacZ 유전자의 주형으로 사용합니다 (addgene : 75006). T7 터미네이터가 최종 구축물에 포함되는 경우 해당 서열을 포함하는 다른 DNA 주형을 주형으로 사용할 수 있습니다.

1. 합성 DNA 올리고가 상업적 공급자로부터 수령되면, 합성 DNA의 용액을 준비하고 뉴클레아제가 없는 물에서 10μM의 농도로 역증폭 프라이머를 준비한다. 표 2에 따라 얼음 위의 PCR 튜브에서 반응을 조립합니다.
   참고: PCR 볼륨은 필요에 따라 확장할 수 있습니다. 최소량의 pCOLADuet-LacZ DNA 주형을 사용하여 추가적인 플라스미드 제거 단계 또는 배경 LacZ 신호가 필요하지 않도록 합니다. 더 많은 DNA 주형 양의 경우, DpnI 제한 효소 소화로 PCR을 따라 잔류 플라스미드 주형을 제거합니다.
2. 표 3에 나열된 사이클링 조건에 따라 열 순환기에 반응을 넣습니다. 아가로스 겔 상에서 PCR 산물을 분석한다(도 2; 보충 프로토콜 및³⁰ 참조).
3. 스핀 컬럼 기반 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정제하고 제조업체의 지침에 따라 뉴클레아제가 없는 물 15-30μL에서 DNA를 용리합니다. 분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량화합니다.

구성 요소	음량	농도
5X Q5 반응 버퍼	10 μL	1배
10 mM dNTP	1 μL	200 마이크로미터
10 mM 포워드 프라이머 (합성 스위치 DNA FW)	2.5 μL	0.5 마이크로미터
10mM 리버스 프라이머(T7 터미네이터 RV)	2.5 μL	0.5 마이크로미터
Template DNA (pCOLADuet-LacZ)	변수	<1 ng
Q5 고충실도 DNA 중합효소	0.5 μL	0.02 U/μL
뉴클레아제가 없는 물	50 μL까지	-

표 2: 토홀드 스위치를 구성하는 데 사용되는 PCR 구성 요소.

걸음		온도	시간
초기 변성		98 °C	30초
35 사이클	변성	98 °C	10초
	어 닐 링	60 °C	20초
	확장	72 °C	1.45 분
최종 확장		72 °C	5 분
들다		4 °C	-

표 3: PCR에 의한 토홀드 스위치 구성 중 사용된 사이클링 조건.

4. 합성 RNA 표적(트리거)의 제조

1. 분자 생물학 설계 소프트웨어를 사용하여 업스트림 T7 프로모터 서열을 포함하도록 합성 트리거 RNA 주형(1.1단계에서 선택)을 수정하여 전체 주형이 짧게 유지되도록 합니다(<200bp). 트리거 서열 프라이머를 증폭하기 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다(올리고 서열에 대해서는 보충 프로토콜 참조).
2. 서열을 DNA 올리고로 정렬합니다. 일단 수신되면, 합성 트리거 DNA 및 증폭 프라이머를 뉴클레아제가 없는 물에서 10 μM로 재구성한다. 표 2 에 따라 얼음 위의 얇은 벽 튜브에 해당 PCR을 조립하고 0.5μL의 트리거 DNA 울트라머(최종 농도 0.1μM)를 주형 DNA로 사용합니다.
3. 반응을 열 순환기에 넣고 표 3에 나열된 사이클링 조건을 사용합니다. 15초의 연장 시간을 사용합니다. 품질을 평가하고 단계 3.3 및 보충 프로토콜에 설명된 대로 트리거 PCR 제품을 정제합니다.
   참고: 공정을 신속하게 처리하기 위해 컬럼 정제된 트리거 PCR 제품을 초기 토홀드 스위치 스크리닝에 직접 사용할 수도 있습니다.

5. 선택된 트리거 서열의 시험관 내 전사

1. 표 4에 따라 얼음 위에 반응 성분을 조립하십시오.
2. 37°C에서 4시간 동안 시험관내 전사(IVT) 반응을 인큐베이션하고, 이어서 DNase I 처리하여 주형 DNA를 제거하였다. DNase I 단계의 경우, 70μL의 뉴클레아제-없는 물, 10μL의 10x DNase I 완충액, 및 2μL의 DNase I (RNase-없음)을 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다. 즉시 단계 5.4로 진행하지 않으면, 50 mM EDTA를 첨가하여 DNase I을 불활성화시키고 65°C에서 10분 동안 열 불활성화시킨다.
3. 선택적 단계: IVT 제품에 대한 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(예: 요소-PAGE) 분석을 수행하여 보충 프로토콜에 설명된 대로 RNA 품질을 평가합니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 RNA 정화 키트를 사용하여 트리거 IVT 제품을 정제한 다음 분광 광도법을 사용하여 RNA 농도와 순도를 정량화합니다. RNA의 몰 농도 및 복제 수 / μL를 결정하는 방법에 대한 지침은 보충 프로토콜을 참조하십시오.

구성 요소	음량	농도
10X 반응 버퍼	1.5 μL	0.75배
25 mM NTP 믹스	6 μL	7.5 밀리미터
템플릿 트리거 DNA	엑스 μL	1 μg
T7 RNA 중합효소 혼합물	1.5 μL	-
뉴클레아제가 없는 물	엑스 μL	20 μL까지

표 4: 선택된 트리거 서열의 시험관내 전사(IVT).

6. 스위치의 초기 스크리닝

알림: 이 섹션에서는 셀이 없는 종이 기반 토홀드 스위치 반응 설정과 관련된 단계와 고성능 토홀드 스위치를 스크리닝하는 방법에 대해 설명합니다. 6.10단계에서 사용된 BSA 차단 여과지는 보충 프로토콜에 설명된 대로 미리 준비해야 합니다.

1. 25mg의 분말을 1mL의 뉴클레아제가 없는 물에 용해시켜 CPRG 원액을 준비합니다. 용액을 항상 얼음 위에 보관하고 장기간 사용하려면 -20 ° C에서 보관하십시오.
2. 설정할 반응 수를 결정합니다. 평가된 각 토홀드 스위치에 대해 마스터 믹스에서 발생할 수 있는 배경 신호를 설명하기 위해 주형 제어 없음(스위치 없음 및 표적 RNA 없음-세포 없는 단독 제어라고도 함)을 포함합니다. 표적 RNA가 없는 경우 백그라운드 스위치 누설 또는 OFF 속도를 평가하기 위한 스위치 전용 제어를 포함합니다.
3. 용액 A, 용액 B, RNase 억제제 및 CPRG의 무세포 반응 마스터 혼합물을 표 5에 나열된 표준 프로토콜에 따라 얼음 위에 조립합니다.
   참고: 여기에 설명된 단계는 피펫팅 오류를 설명하기 위해 10% 부피가 추가된 1.8μL 삼중 반응에 충분한 마스터 믹스를 위한 것입니다. 마스터 믹스 볼륨은 선별된 토홀드 스위치의 수에 따라 필요에 따라 조정해야 합니다.
4. 각 삼중 무세포 반응에 대해 마스터 믹스를 PCR 튜브에 분주하고 모든 튜브를 얼음 위에 유지합니다. 무세포 단독 대조군으로 따로 보관된 튜브의 경우, 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 5.84μL에 첨가하고, 위아래로 피펫팅하여 혼합하고, 짧게 원심분리합니다. 튜브의 나머지 부분에 대해, PCR 정제된 토홀드 스위치 DNA를 최종 농도 33 nM로 첨가한다.
5. 스위치 단독 대조군으로 따로 보관된 튜브의 경우 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 5.84μL에 추가합니다. 토홀드 스위치와 표적 RNA 조합을 테스트하기 위해 따로 보관된 튜브의 경우 시험관 내 전사된 표적 RNA를 최종 농도 1μM로 추가합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 5.84μL까지 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 모든 반응을 완전히 혼합하고 짧게 원심분리합니다.
6. 384웰의 투명한 검은색 바닥 플레이트의 반응 웰을 둘러싼 웰에 뉴클레아제가 없는 물 30μL를 추가합니다. 이는 실험 과정에서 증발을 최소화하고 재현성을 향상시킵니다.
   알림: 휴대용 플레이트 리더 장치를 사용하는 경우 플레이트 위에 PCR 호일을 놓고 정밀 나이프를 사용하여 반응용 웰과 네 모서리 웰 각각을 잘라냅니다. PCR 호일은 휴대용 플레이트 리더 카메라가 빈 우물에서 과다 노출되는 것을 방지합니다.
7. 2mm 생검 펀치와 핀셋을 사용하여 BSA 차단 여과지 디스크를 절단하고 펀치를 배출하거나 핀셋을 사용하여 반응 웰에 넣습니다(BSA 차단 여과지 준비를 위한 보충 프로토콜 참조). 각 반응 튜브에서 1.8 μL 부피의 384웰 플레이트의 여과지 디스크로 삼중 분주하여 모든 샘플과 384웰 플레이트를 항상 얼음 위에 유지합니다.
   알림: 휴대용 플레이트 리더 장치를 사용하는 경우 1.8웰 플레이트의 네 모서리 각각에 0.6μL의 CPRG(384mg/mL)를 추가합니다. CPRG의 노란색은 이미지 분석에서 디지털 멀티웰 플레이트 템플릿의 정렬을 위해 휴대용 플레이트 리더에 패턴 인식을 제공합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트의 웰을 PCR 필름으로 덮으십시오.
8. 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 37°C에서 130분 동안 분당 OD₅₇₀ 을 읽습니다.

구성 요소	음량	반응당 최종 농도
솔루션 A	2.38 μL	40%
솔루션 B	1.78 μL	30%
RNase 억제제	0.03 μL	0.5% V/V
심폐 소생술 (25 밀리그램 / 밀리리터)	0.14 μL	0.6 밀리그램 / 밀리람베르트
토홀드 스위치	엑스 μL	33 nM
표적 RNA	엑스 μL	1 마이크로미터
뉴클레아제가 없는 물	5.94 μL까지	-
총 볼륨:		5.94 μL

표 5: PURExpress 무세포 전사-번역 반응 성분.

7. 고성능 토홀드 스위치 식별

참고: 이 섹션에서는 6단계의 데이터를 분석하여 앞으로 진행할 최상의 토홀드 스위치를 선택하는 방법에 대해 설명합니다.

1. 먼저 배경 OD₅₇₀ 흡광도로 정규화하여 데이터 분석을 시작합니다. 이렇게 하려면 다른 OD570 측정에서 스위치 또는 표적 RNA가 없는 반응(즉, 무세포 단독 웰)의_OD570 측정값을 뺍니다.
2. 3점 이동 평균을 사용하여 정규화된 데이터를 평활화하고 각 웰의 최소값을 0으로 조정합니다. 토홀드 스위치들(27B, 33B, 47B)에 대해 수집된 정규화된 시간-코스 데이터의 예는 도 3 을 참조한다.
3. 이 처리된 데이터를 사용하여 토홀드 스위치와 타겟 및 스위치 단독 웰 사이의 색상 변화율(즉, 시간 경과에 따른 OD₅₇₀ 의 변화)의 차이를 결정하여 폴드 변화(또는 ON/OFF 비율)를 계산합니다(비율 계산을 위한 보충 프로토콜 참조; 그림 4).
4. 추가 특성화를 위해 ON/OFF 폴드 변화가 가장 높은 스위치를 선택하십시오. 가장 낮은 접힘 변화를 표시하는 성능이 좋지 않은 토홀드 스위치는 생략합니다.

8. 핵산서열 기반 증폭 프라이머 스크리닝 및 민감도

참고: 다음 단계에서는 먼저 기능적 등온 증폭 프라이머에 대한 스크리닝을 수행한 다음 등온 증폭과 결합될 때 주어진 발판 스위치가 안정적으로 감지할 수 있는 합성 RNA의 μL당 표적 RNA 사본 수를 결정하여 민감도를 평가합니다. 등온 증폭 후 무세포 반응을 수행하여 성공적인 핵산 서열 기반 증폭 프라이머 세트를 식별합니다. 그러나, 먼저 후보 프라이머 세트의 풀을 좁히기 위해 핵산 서열 기반 증폭 반응에서 폴리아크릴아미드 또는 아가로스 겔을 실행하는 것이 더 비용 효율적일 수 있다. 그 경우, 적절한 앰플리콘 크기로 겔 상에 밴드를 생성하는 핵산 서열 기반 증폭 프라이머 세트는 후속 무세포 스크리닝을 위해 후보로 선정될 수 있다.

1. 뉴클레아제가 없는 물에서 모든 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 25μM 스톡 용액을 만듭니다( 보충 프로토콜 참조). 설정해야 하는 핵산 서열 기반 증폭 반응과 후속 무세포 반응의 수를 결정합니다. 이것은 토홀드 스위치의 수와 각각의 프라이머 세트에 따라 다릅니다.
   참고: 프라이머를 스크리닝할 때, 프라이머 관련 비특이적 증폭으로 인해 발생할 수 있는 배경 아티팩트를 설명하기 위해 각 프라이머 세트에 대해 항상 주형 없음 대조군을 포함하는 것이 중요합니다.
2. 다음과 같이 하나의 5μL 반응을 설정합니다(필요에 따라 확장). 얼음에서 모든 시약을 해동하십시오. 반응 완충액, 뉴클레오티드 믹스, 및 RNase 억제제의 반응 마스터 믹스를 표 6에 따라 조립한다. 흰색 침전물이 가용화될 때까지 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합한 다음 분취량을 PCR 튜브에 분주합니다.
   1. 마스터 믹스가 핵산 서열 기반 증폭 프라이머를 스크리닝하기 위한 것이라면 먼저 마스터 믹스에서 프라이머를 제외합니다(마스터 믹스 2.55μL 분주). 그렇지 않으면, 프라이머 민감도 분석을 수행하는 경우, 프라이머가 마스터 믹스에 포함될 수 있다(이 경우 2.75 μL 분취량 분주). 변성 및 평형 단계 후에 효소 혼합물을 추가하십시오.
3. 핵산 서열 기반 증폭 프라이머를 스크리닝하는 경우, 정방향 및 역방향 프라이머를 적절한 튜브에 첨가한다. 열 순환기에서 표 7에 설명된 대로 배양 프로토콜을 설정합니다.
4. 2pM 또는 약 10^{6 copyies} /μL에서 1 μL의 뉴클레아제 없는 물 또는 1 μL의 표적 트리거 RNA를 추가하고 그에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하고 튜브를 짧게 회전시킵니다.
   참고: 프라이머 세트 스크리닝의 경우 등온 증폭 방법의 검출 하한에 충돌하지 않을 만큼 충분히 높지만 증폭이 발생하지 않을 경우 발가락 스위치를 활성화할 만큼 충분히 높지 않은 표적 트리거 RNA의 농도를 사용하십시오.
5. 튜브를 열 순환기로 옮기고 배양을 시작하십시오. 12분 후 튜브를 제거하고 각 튜브에 효소 혼합물 1.25μL를 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 튜브를 간단히 원심분리합니다.
   알림: 이 시점에서 튜브는 실온에서 보관할 수 있습니다. 그러나 효소 혼합물은 튜브에 추가 될 때까지 얼음 위에 보관해야합니다.
6. 튜브를 열 순환기로 되돌리고 41°C 유지 단계를 건너뛰고 1시간 반응 배양을 시작합니다.
   참고: 배양 후 반응물을 당일 처리를 위해 얼음에 두거나 나중에 처리하기 위해 -20°C에서 냉동할 수 있습니다.
7. 6.2-6.7단계 및 표 8 단계에 따라 종이 기반 무세포 토홀드 스위치 반응을 조립하여 프라이머 성능을 평가합니다. 7.1-7.2단계 및 그림 3에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.
   참고: 앞서 언급한 컨트롤 외에도 반응에서 발생할 수 있는 배경 신호를 설명하기 위해 음성 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 또한, NO-NASBA 증폭 대조군으로서 표적 RNA의 스위치 및 2 pM (최종 농도)을 갖는 대조군을 포함하는 것도 중요하다.
8. 민감도 분석을 진행할 후보 프라이머 쌍을 식별합니다. 프라이머 쌍은 인큐베이션된 반응의 첨가 후에 발가락 스위치 활성화가 발생하는지 여부에 기초하여 선택된다. 필요한 경우 더 많은 프라이머 조합으로 프라이머 스크린을 반복합니다.
9. RNA 샘플을 항상 얼음 위에 보관하고 뉴클레아제가 없는 물에서 표적 RNA의 연속 희석 세트를 만드십시오: 10⁴, 10³, 10 2, 10¹ 및 10^{0 RNA} 사본/μL. 선택된 프라이머 세트(단계 8.2-8.7)로 핵산 서열 기반 증폭 및 무세포 반응을 반복하고, 최상의 감도를 제공하는 프라이머 세트를 식별하기 위해 연속 희석 시리즈를 테스트합니다. 프라이머 세트 감도를 결정하기 위한 결과의 예는 도 5를 참조한다.
   참고: 이상적으로, 선택된 토홀드 스위치와 프라이머 쌍은 RNA의 μL당 1-100개의 표적 RNA 사본을 검출해야 합니다(스톡 용액 농도).
10. 핵산서열 기반 증폭 민감도 실험을 생물학적 삼중으로 반복한다. 이 단계는 환자 샘플을 사용한 실험으로 이동하기 전에 결과의 재현성을 확인하는 역할을 합니다.
11. 선택적: 장기간 사용 및 수송을 위한 스위치 DNA의 신뢰할 수 있는 공급원을 갖기 위해, 임의의 통상적인 클로닝 방법을 사용하여 선택된 스위치 서열(들)을 플라스미드로 클로닝한다. 유사하게, 표적 트리거 RNA 서열은 또한 저장을 위해 선택된 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다.

구성 요소	반응당 부피	최종 농도
나스바 반응 버퍼	1.67 μL	1배
나스바 뉴클레오티드 믹스	0.833 μL	1배
25μM 순방향 프라이머	0.1 μL	0.5 마이크로미터
25μM 리버스 프라이머	0.1 μL	0.5 마이크로미터
RNase 억제제 (40 U / μL)	0.05 μL	0.4 U/μL
표적 RNA	1 μL
나스바 효소 믹스	1.25 μL	1배
총 볼륨	5 μL

표 6: NASBA 반응 성분.

걸음	온도	시간
변성	65 °C	2 분
평형	41 °C	10 분
들다	41 °C	∞
잠복	41 °C	1시간
들다	4 °C	-

표 7 : NASBA의 반응 조건.

구성 요소	음량	반응당 최종 농도
솔루션 A	2.38 μL	40%
솔루션 B	1.78 μL	30%
RNase 억제제	0.03 μL	0.5% V/V
심폐 소생술 (25 밀리그램 / 밀리리터)	0.14 μL	0.6 밀리그램 / 밀리람베르트
토홀드 스위치	엑스 μL	33 nM
표적 RNA (해당되는 경우)	엑스 μL	1 마이크로미터
나스바 (해당되는 경우)	0.85 μL	1:7
뉴클레아제가 없는 물	5.94 μL까지	-
총 볼륨:		5.94 μL

표 8: 종이 기반 무세포 반응 성분.

9. 환자 샘플 수집 및 바이러스 RNA 추출

알림: 이 섹션에서는 RNA 정제 키트를 사용하여 환자 샘플을 수집하고 RNA를 추출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 아래 프로토콜은 말초 혈액에서 혈청을 얻는 데 사용됩니다. 이 연구에 사용 된 샘플은 브라질 Pernambuco 주에서 발열, 발진, 관절통 또는 기타 관련 아르보 바이러스 감염 증상을 나타내는 환자로부터 수집되었습니다.

1. 아르보 바이러스에 감염된 것으로 의심되는 환자로부터 말초 혈액 샘플을 수집합니다. 표준 무균 기술을 사용하여 정맥 천자 (전혈관)를 수행하십시오. 샘플 튜브에 익명의 코드와 샘플 수집 날짜를 표시하십시오.
2. 혈액을 원심분리하여 혈청을 2,300 x g 에서 10분 동안 분리합니다. 피펫을 사용하여 1.5mL 튜브에서 RNA 추출에 사용할 혈청 분취량(200μL)을 준비합니다.
   참고: 샘플 수집 직후 RNA 추출을 수행할 수 없는 경우 혈청 샘플은 다운스트림 적용 전에 -80°C에서 보관해야 합니다.
3. 캐리어 RNA가 포함된 준비된 완충액 AVL(바이러스 용해 완충액) 560 μL를 1.5 mL 튜브에 피펫팅한다. 140 μL의 혈청을 튜브의 완충액 AVL/캐리어 RNA 혼합물에 추가합니다. 펄스 볼텍싱으로 15초 동안 혼합합니다.
4. 실온에서 10분 동안 배양한 다음 샘플을 잠시 원심분리하여 튜브 바닥에 내용물을 수집합니다. 560 μL의 에탄올 (96 % -100 %)을 샘플에 첨가하고 15 초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 혼합 후 샘플을 원심 분리하여 튜브 바닥에 내용물을 수집합니다.
5. 림을 적시지 않고 9.4단계의 용액 630μL를 스핀 컬럼에 조심스럽게 추가합니다. 이 단계에 따라 캡을 닫고 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 여액이 들어 있는 사용한 수집 튜브를 버립니다.
6. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 9.5 단계를 반복하십시오. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 500μL의 버퍼 AW1(세척 버퍼 1)을 추가합니다. 캡을 닫고 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 여액이 들어 있는 사용한 수집 튜브를 버립니다.
7. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 500μL의 버퍼 AW2(세척 버퍼 2)를 추가합니다. 캡과 원심분리기를 20,000 x g 에서 3분 동안 닫습니다. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 여액이 들어 있는 사용한 수집 튜브를 버립니다.
8. 다운스트림 효소 반응에 문제를 일으킬 수 있는 잔류 완충액 AW2에 의한 오염을 방지하려면 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 사용한 수집 튜브를 여액과 함께 폐기하십시오. 20,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
9. 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5mL 튜브에 넣고 사용한 수집 튜브를 여액과 함께 버립니다. 스핀 컬럼을 조심스럽게 열고 실온과 평형화된 60μL의 버퍼 AVE(용리 버퍼)를 추가합니다. 이 단계에 따라 캡을 닫고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
10. 6,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 용출된 RNA를 NASBA 및 RT-qPCR의 입력으로 병렬로 사용할 수 있습니다.
11. 8.3 - 8.11단계에 따라 추출된 환자 RNA 1μL를 사용하여 핵산 서열 기반 증폭 및 종이 기반 무세포 반응을 수행하여 음성 및 양성 대조군 반응이 포함되도록 합니다. 반응 후, 384-웰 반응 플레이트를 제조하고 37°C의 휴대용 플레이트 판독기 장치에서 분석을 실행합니다( 보충 프로토콜의 세부 정보 참조).
    참고: 배양된 지카 바이러스에서 추출한 10⁴ 및 10² PFU/mL의 두 RNA 농도는 임상 검증 중 모든 실험에서 양성 대조군으로 사용됩니다. 앞서 언급한 대조군 외에도 트리거(10ng/μL)를 양성 대조군으로 포함하는 것도 중요합니다.
12. 모든 실험이 끝나면 사용 가능한 플레이트 리더의 원시 데이터(.csv 파일)를 온라인 보안 데이터베이스에 업로드할 수 있습니다. 또한 휴대용 플레이트 리더는 샘플이 Zika 바이러스에 대해 양성인지 음성인지 여부를 나타내는 보고서를 생성합니다(그림 6). 배양 중에 얻은 모든 그래프의 예는 대표 결과 섹션을 참조하십시오(그림 7).
    참고: 사용자는 USB를 통해 휴대용 플레이트 리더에서 자신의 컴퓨터로 파일을 전송할 수도 있습니다.

10. 휴대용 플레이트 리더 장치

1. 휴대용 플레이트 리더 장치(도 8)는 종래의 플레이트 리더(²⁴)에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 프로토콜 및 대표 결과는 보충 프로토콜을 참조하십시오.

11. 지카 바이러스 검출을 위한 RT-qPCR

참고: 이 섹션에서는 환자 샘플에서 Zika 바이러스 검출을 위한 RT-qPCR을 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다( 보충 프로토콜 참조).

1. 오염을 방지하려면 RT-qPCR 구성 요소를 증폭 과정에서 격리된 영역(예: 클린 후드)에 조립합니다. RT-qPCR 버퍼, 효소 및 프라이머/프로브를 얼음이나 콜드 블록에 놓습니다. 그런 다음 표 9에 따라 얼음 위의 384웰 플레이트에 반응을 추가합니다.
   참고: 모든 실험에는 음성(추출 대조군 및 비주형 대조군[NTC]) 및 양성 대조군(10⁴ PFU/mL)이 권장됩니다.
2. 시약을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 추가한 후 위아래로 피펫팅하여(와동하지 않음) 반응물을 혼합하고 각 웰에 6.5μL를 분주합니다. 각 RNA 주형 3.5μL를 3배로 추가합니다.
3. 플레이트 위에 PCR 필름을 놓습니다. 384웰 플레이트를 600 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
4. 표 10에 설명된 다음 사이클링 조건을 사용하여 플레이트를 RT-qPCR 기계에 놓습니다. 결과를 분석하려면 RT-qPCR 기계 설계 및 분석 소프트웨어를 사용하고 자동 임계값 및 기준선을 고려하십시오(보충 프로토콜의 세부 정보 참조).

구성 요소	음량	농도
2X 콴티노바 프로브 RT-PCR 마스터 믹스	5 μL	1 엑스
100μM 순방향 프라이머	0.08 μL	0.8 마이크로미터
100μM 리버스 프라이머	0.08 μL	0.8 마이크로미터
25 μM 프로브	0.04 μL	0.1 마이크로미터
콴티노바 ROX 레퍼런스 염료	0.05 μL	1 엑스
콴티노바 프로브 RT 믹스	0.1 μL	1 엑스
템플릿 RNA	3.5 μL	-
뉴클레아제가 없는 물	10 μL까지	-

표 9: 환자 샘플에서 지카 바이러스를 검출하기 위해 미국 질병통제예방센터-CDC USA 프로토콜을 기반으로 지카 바이러스 RNA를 증폭하기 위한 RT-qPCR 성분(³¹).

걸음		온도	시간
역전사		45 °C	15 분
PCR 초기 활성화 단계		95 °C	5 분
45 사이클	변성	95 °C	5초
	어닐링/확장 결합	60 °C	45초

표 10: RT-qPCR에 대한 사이클링 조건.

Results

전산 설계 파이프라인에 이어 3개의 토홀드 스위치의 구성은 PCR에 의해 수행되었습니다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분석하였다(도 2). 대략 발가락 스위치에 결합 된 lacZ 유전자의 크기 인 약 3,000bp의 명확한 밴드의 존재는 일반적으로 성공적인 반응을 나타냅니다. 또는 밴드가 없는 레인, 다중 밴드 또는 잘못된 크기의 밴드는 실패한 PCR을 나타냅니다. 실패한 PCR의 경우, 반응 조건 및/또는 프라이머 서열이 최적화되어야 한다.

조립된 토홀드 스위치를 스크리닝하여 각각의 시험관 전사된 트리거 RNA에 대해 각 센서를 평가했습니다(그림 3). 3개의 센서 모두 증가된 OD₅₇₀ 흡광도를 나타냈지만, 스위치 27B(그림 3A)가 가장 빠른 온레이트를 보였다. 스위치(33B) 및 그보다 덜한 정도로, 47B는 표적 트리거 RNA의 부재 하에서 증가된_OD570 흡광도를 나타냈으며, 이는 이들 스위치가 일부 배경 활성 또는 누출을 갖는다는 것을 나타내고(도 3B,C) - 특이성을 감소시킬 수 있기 때문에 후보 센서에서 원하지 않는 특성이다. ON/OFF 신호 비율이 가장 높은 센서를 보다 명확하게 식별하기 위해 OD₅₇₀ 흡광도의 접힘 변화를 계산하고(추가 정보 섹션 5 참조) 플로팅했습니다(그림 4). 이 분석에서 스위치 27B는 약 60의 ON/OFF 비율로 최고의 성능을 가진 센서임이 분명합니다.

이어서, 최고 성능의 토홀드 스위치(27B)의 감도는 NASBA 반응과 결합될 때 토홀드 스위치를 활성화하는데 필요한 최저 RNA 농도를 결정함으로써 평가되었다. 그래프는 최고 성능의 Zika 센서가 μL 당 1.24 분자 (~ 2 aM에 해당)의 낮은 농도에서 RNA를 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 그림 5).

스위치 27B가 식별되고 검증된 후, 센서 재료는 브라질 페르남부쿠 주의 헤시피에 있는 팀원들에게 배포되었습니다. 브라질에서는 비교를 위해 RT-qPCR과 병행하여 지카 바이러스 환자 샘플을 사용하여 지카 바이러스 진단 플랫폼의 임상 진단 정확도를 평가했습니다. 종이 기반 Zika 진단 플랫폼을 검증하기 위해 종이 기반 센서의 비색 출력을 배양하고 읽을 수 있는 휴대용 플레이트 리더가 사용되었습니다. 노란색에서 보라색으로의 색상 변화는 양성 샘플을 식별하는 데 사용되며 음성 샘플은 노란색으로 유지됩니다(그림 6). 휴대용 플레이트 리더(그림 8)에서 생성된 결과를 시각화하기 위한 추가 옵션은 시간 경과에 따른 각 종이 기반 반응에 대한 비색 반응을 플로팅하는 것입니다. 샘플은 삼중으로 테스트되었으며 임계 값 (빨간색 선이 1로 설정됨)을 초과하는 샘플은 양성으로 간주되었으며 임계 값 미만의 샘플은 음성으로 간주되었습니다 (그림 6 및 그림 7).

마지막으로, 지카 토홀드 스위치 센서의 임상 성능을 지카 바이러스 감염 진단을 위한 현재의 황금 표준 방법과 평가하고 비교하기 위해 모든 환자 샘플을 RT-qPCR과 병행하여 테스트했습니다. 두 개의 대표적인 환자 샘플의 증폭 플롯을 RT-qPCR에 의한 지카 바이러스의 검출을 위해 삼중으로 시험하였다(도 9). 샘플은 주기 역치(Ct) 값이 ≤38일 때 양성으로 간주됩니다. 빨간색 선은 양성 샘플을 나타내고 파란색 선은 Zika 바이러스에 대한 음성 샘플을 나타냅니다.

그림 2: PCR 산물의 품질을 평가하기 위한 아가로스 겔 전기영동. PCR 산물은 1X TAE의 1% 아가로스 겔에서 분석되고 80V에서 90분 동안 실행됩니다. 단일 클리어 밴드는 일반적으로 성공적인 반응을 나타냅니다. 레인 1: 1 kb DNA 사다리; 레인 2-4: 각각 27B 스위치 DNA, 33B 트리거 DNA, 및 47B 트리거 DNA. 왼쪽의 숫자는 bp 단위의 밴드 크기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 종이 기반 Zika 센서를 위한 3개의 토홀드 스위치 프로토타이핑. 3개의 종이 기반 RNA 토홀드 스위치 센서의 성능을 37°C에서 130분 이상 측정했습니다. 각 그래프에는 두 개의 추적이 포함되어 있으며, 하나는 스위치 전용 컨트롤을 나타내고 다른 하나는 스위치 및 트리거를 나타냅니다. 3개의 그래프는 토홀드 스위치 센서(27B(A), 33B(B) 및 47B(C)를 사용하여 획득된 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 세 번의 반복실험에서 평균(SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 최고 성능의 센서는 570nm에서 흡광도의 접힘 변화를 계산하여 식별됩니다. 폴드 변화(또는 최대 ON/OFF 비율)는 스위치 전용 제어와 스위치 플러스 트리거 CFPS 분석 사이의 130분에서 흡광도(OD₅₇₀)의 비율을 측정하여 계산됩니다. 오차 막대는 세 번의 반복실험에서 얻은 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 최고 성능의 스위치의 민감도 평가. 시험관내 전사된 지카 RNA는 NASBA 반응으로 적정됩니다. 1시간 배양 후, 반응물을 종이 디스크의 무세포 PURExpress 반응에 1:7의 비율로 첨가했습니다. 37°C에서 130분 후의 폴드 변화가 플롯팅된다. 이 수치는²⁴에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 캡처된 이미지 데이터가 로드된 휴대용 플레이트 판독기 캡처 페이지. 이 그림은 데이터 수집 실행 중에 휴대용 플레이트 판독기로 캡처한 최종 이미지의 샘플 그림을 보여줍니다. 원래 날짜/시간 스탬프가 이미지 상단에 표시됩니다. 노란색은 대조군 또는 음성 반응을 나타내고 보라색은 긍정적 인 반응을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 데이터 분석 모드 왼쪽에서 사용자는 플롯하려는 데이터 세트를 선택합니다. 그런 다음 그래프가 각 샘플 또는 컨트롤 세트에 대해 고유한 색상으로 오른쪽에 표시됩니다. 빨간색 점선은 양성 및 음성 샘플을 결정하기 위한 임계값 역할을 합니다. 임계값을 초과하는 삼중 테스트된 샘플은 양성으로 간주되고 임계값 미만의 샘플은 음성으로 간주됩니다. 오차 막대는 세 번의 반복실험에서 표준 편차(SD)를 나타냅니다. Ctrl 1에서 Ctrl 5는 컨트롤을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8. PLUM, 휴대용 플레이트 리더. 이 휴대용 플레이트 리더는 실험실 인 어 박스 역할을 하며 비색 반응을 배양하고 모니터링하기 위한 온도 제어 플레이트 리더 역할을 합니다. 이 휴대용 장치는 현장에서 종이 기반 Zika 센서의 정량적 및 높은 처리량 측정을 제공할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 지카 바이러스 검출을 위해 삼중으로 테스트된 두 환자 샘플의 증폭에 대한 RT-qPCR 플롯. 샘플은 주기 임계값(Ct) 값이 ≤38일 때 양성으로 간주됩니다. 빨간색 점선은 양성 및 음성 샘플을 결정하기 위한 임계값 역할을 합니다. 빨간색 트레이스는 양성 샘플을 나타내고 파란색 트레이스는 음성 샘플을 나타냅니다. ΔRn(델타 Rn) 값은 테스트된 모든 샘플에 대해 RT-qPCR 기기에 의해 검출된 형광 신호의 정규화된 크기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 프로토콜 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 수치. 이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 

Discussion

여기에 설명된 결합된 종이 기반 시스템은 RT-qPCR과 기능적으로 유사한 성능으로 임상적으로 관련된 분자^{진단을 필요 시점}6으로 가져올 수 있습니다. 중요한 것은 원격 설정의 경우 현장에서 진단을 사용할 수 있으므로 결과를 얻는 시간을 며칠에서 몇 시간으로 줄일 수 있다는 것입니다. 이 접근법의 프로그래밍 가능성을 강조하면서 설명 된 파이프 라인은 거의 모든 병원체 표적을 검출하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 분자 도구를 특수 제작된 휴대용 플레이트 리더와 페어링했으며, 이 리더는 컴팩트하고 배터리 작동(8–9시간)과 호환되며 온보드 데이터 분석을 제공하여 분산 애플리케이션을 가능하게 합니다. 다른 작업에서는 RT-qPCR과 병행하여 268개의 환자 샘플로 결합된 하드웨어 및 Zika 바이러스 진단 플랫폼을 검증했으며 98.5%²⁴의 진단 정확도를 발견했습니다. 종합하면, 우리의 목표는 이 플랫폼의 기술 이전을 연구자에게 제공하여 충족되지 않은 진단 요구 사항을 해결하기 위해 커뮤니티에서 용도를 변경하고 개선할 수 있도록 하는 것입니다.

인실리코 토홀드 스위치 설계 프로세스는 3단계로 나눌 수 있는 파이프라인으로 통합되고 자동화되었습니다. 첫 번째 단계는 하나의 뉴클레오티드 증분으로 표적 서열에 혼성화하는 토홀드 스위치 설계 풀을 생성합니다. 두 번째 단계는 2차 구조 및 토홀드 스위치 가용성을 검사하고 프레임 내 조기 정지 코돈이 있는 센서를 제거합니다. 그런 다음 여러 요소(예: 토홀드 스위치의 결함 수준, 토홀드 스위치 가용성 및 대상 사이트 접근성)를 고려하는 스코어링 기능을 구현하여 전체 점수를 기반으로 상단 토홀드 스위치 설계를 선택합니다. 마지막 단계에서는 상단 토홀드 스위치 설계 및 해당 대상 트리거에 대한 시퀀스 목록이 생성됩니다. 상단 센서 서열은 NCBI/Primer-BLAST²⁵를 사용하여 인간 전사체 및 밀접하게 관련된 바이러스 게놈에 대한 특이성을 스크리닝해야 합니다. 또한 Zika 바이러스 게놈에서 서열 보존을 위해 센서 표적 부위를 스크리닝하여 센서가 광범위하고 강력한 검출을 제공하도록 하는 것이 가장 좋습니다. 여러 버전의 토홀드 스위치 설계 소프트웨어가 개발되었으며 설계 알고리즘을 통해 사용자는 시리즈 A 6 또는 시리즈 B 토홀드 스위치⁶의 두 가지 버전을 생성할 수 있습니다. 이 기사에서는 시리즈 B 토홀드 스위치 설계에 중점을 두었습니다.

상용 DNA 합성 후, 토홀드 스위치는 신속하게 조립된 다음 표적 게놈의 짧은 영역(200-300nt)에 해당하는 합성 표적 트리거 서열에 대해 초기 스크리닝을 수행하여 테스트할 수 있습니다. 토홀드 스위치 기반 센서의 성능을 스크리닝하려면 RNA 형태로 표적 서열을 추가하는 것이 이상적입니다. 이 기사에서는 시험관 내 전사 트리거 RNA를 추가하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명했습니다. 그러나, 이용 가능한 경우, 정량화된 바이러스 RNA 추출물 또는 상업적 합성 RNA 게놈 또는 표준물질과 같은 전장 게놈 주형이 사용될 수 있다. 초기 발가락 스위치 스크리닝을 위해 전장 RNA 게놈을 사용하면 RNA 2차 구조와 같은 추가 요인이 센서 성능에 영향을 미치는지 여부를 알 수 있으므로 유용합니다. 후보 스위치의 ON/OFF 비율을 최적화하기 위해 토홀드 스위치 DNA를 무세포 반응으로 적정할 수 있습니다. 이 단계는 또한 고성능 토홀드 스위치(폴드 증폭 또는 높은 ON/OFF 비율)를 식별하고 다운스트림 특성화 단계에서 누출 토홀드 스위치(표적 RNA가 없는 경우 높은 신호)를 생략하는 역할을 할 수 있습니다.

최고 성능의 토홀드 스위치 후보의 검출 한계를 개선하기 위해 NASBA는 표적 지카 바이러스 RNA의 임상적으로 관련된 농도를 토홀^{드 스위치6}로 검출할 수 있는 수준으로 증가시키는 데 사용됩니다. 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 다양한 조합을 스크리닝하여 임상적으로 관련된 농도에서 검출할 수 있도록 최상의 NASBA 프라이머 및 토홀드 스위치 조합을 결정합니다. 이상적인 프라이머 세트와 발가락 스위치 조합이 확인되면 분석은 임상 검증으로 진행됩니다. 토홀드 스위치와 NASBA 스크리닝 단계는 노동력과 자원 집약적일 수 있으므로 테스트 개발은 자원이 풍부한 연구 사이트에 가장 적합하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 프로세스 자동화를 적용하지는 않았지만 반복적 인 설계, 빌드 및 테스트주기⁽³²)를 가속화 할 수 있습니다. 다행스럽게도 센서 설계 및 테스트에서 배포까지의 소요 시간은 매우 짧을 수 있으므로(일주일 미만) 이 전략은 전염병 발생과 같이 시간이 중요한 상황에^{이상적입니다6.}

임상적으로 관련된 감도를 가진 바이오센서가 개발된 후에도 해결해야 할 기술적 과제가 있습니다. 이 프로토콜은 수동 작동을 포함하고 다단계 절차이기 때문에 샘플 간의 교차 오염 위험이 있습니다. 우리는 신중한 실험실 실습을 통해 이러한 위험을 줄이기 위해 최선을 다합니다. 268 명의 환자 샘플에 대한 최근 임상 시험에서 우리는 오염 문제가 발생하지 않았습니다. 그러나 중요한 고려 사항입니다²⁴. 이를 염두에두고 프로토콜은 실험실 분석으로 남아 있으며 적절한 분자 생물학 기술을 구사하는 숙련 된 사용자가 필요합니다. 배치에 대한 추가 고려 사항은 환자 샘플에서 RNA 분리입니다. 여기에서는 컬럼 기반 핵산 추출 키트를 사용한 RNA 분리에 대해 설명합니다. 그러나 다른 연구에서는 저부담 환자^{시료 처리를 위한} 효과적이고 간단한 비등 용해 방법(95°C에서 2분)을 입증했습니다6. 이 전략은 RNA 추출과 관련된 비용을 거의 제거하고 COVID-19 대유행과 같은 위기 상황에서 자원이 부족한 환경이나 공급망 문제에서 물류 문제를 일으킬 수 있는 컬럼 기반 핵산 추출 키트의 사용을^{방지합니다33}.

COVID-19 팬데믹 기간 동안 보았듯이 RT-qPCR을 수행하는 데 사용되는 기기 자체가 병목 현상으로 작용하고 테스트에 대한 환자의 접근을 제한할 수 있습니다. 또한 대부분 재정적인 이 요소는 진단 액세스를 제한할 수 있는 중앙 집중식 테스트 모드로 이어집니다. 예를 들어, 2015/2016 Zika 발병 기간 동안 브라질에는 5 개의 국가 참조 실험실 만 제공되어 환자 테스트가 지연되었습니다. 규모의 경제의 잠재적 이점을 고려하지 않고 휴대용 플레이트 리더의 현재 제품 비용은 ~ $ 500 USD이며, 이는 노동 및 상업 마진을 고려하여 5 배 증가하더라도 여전히 저렴한 도구를 제공합니다. 이는 $15,000-$90,000 USD³⁴의 비용 범위의 RT-qPCR 기기와 잘 비교됩니다. 또한 라틴 아메리카의 무세포 분석에 대한 테스트당 예상 비용은 약 $5.48 USD인 반면, 브라질의 RT-qPCR 테스트당 비용은 Zika 발병 당시 ~$11-36 USD였습니다. 장비 비용 외에도 휴대용 플레이트 리더는 설치 공간이 작고(20cm³), 자동 분석, 인터넷을 통해 클라우드에 데이터 업로드가 가능하며 배터리 전원으로 실행할 수 있습니다. 이러한 기능은 테스트를 배포할 수 있는 잠재적 설정을 극적으로 확장하고 동시에 서비스를 받을 수 있는 환자 집단을 확장합니다.

현재까지 가장 일반적인 상용 대장균 CFPS 플랫폼은 S30 및 PURE 시스템³⁷; 그러나 저소득 및 중간 소득 국가에서 진단에 대한 접근성을 개선하는 데 있어 주요 고려 사항은 이러한 시약의 제한된 국내 가용성입니다. 이 문제를 해결하기 위한 중요한 단계는 현지 CFPS 생산의 개발입니다. Federici 연구소는 최근 용해물 기반 무세포 시스템에서 토홀드 스위치 기반 센서를 구현하기 위한 비상업적 플랫폼 개발에 상당한 진전을 이루었으며, Zika 바이러스 RNA¹⁴와 함께 2.7fM LOD에 도달했습니다. 이 성과는 수입 관세 및 지연을 피하면서 사용 국가에서 시약을 만들 수있을뿐만 아니라 인건비도 현지 요율로 확장되므로 전체 비용을 크게 낮출 수 있습니다. Federici 그룹이 개괄 한 작업에서 칠레에서 CFPS 발현 반응 (5 μL)을 생산하는 비용은 6.9 센트 (USD) 35,38로 용해물 기반 시스템 ^35,38을 구현하기위한 이중 인센티브 (물류 및 비용 개선)를 제공했습니다.

RT-qPCR 비교 테스트를 분산 진단 네트워크에 배치하면 중앙 집중식 RT-qPCR 시설로의 샘플 운송에 의존하는 현재 관행에 비해 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. Zika 사례가 집중된 도시 주변 환경에서 환자와 진단 시설 사이의 물리적 거리는 진단 속도를 늦추고 결과가 임상적으로 관련된 시간에 환자에게 도달하지 못할 위험을 증가시킵니다. 여기에 제시된 작업이 지식 이전을 통해 연구 커뮤니티가 인간 건강, 농업 및 환경 모니터링을위한 분산 된 생명 공학 및 휴대용 하드웨어를 만드는 데 기여할 수 있기를 바랍니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
384웰 플레이트 커버 - 알루미늄	Sarstedt	95.1995	PLUM 리더에 삽입하기 전에 384웰 플레이트를 덮는 데 사용
384웰 플레이트 커버 - 투명	Sarstedt	95.1994	BioTek 플레이트 리더에 삽입하기 전에 384웰 플레이트를 덮는 데 사용
384웰 플레이트 VWR		CA11006-180	정량화를 위해 2mm 종이 기반 진단을 이 플레이트의 웰에 넣습니다
Agarose	BioShop Canada	AGA001.500	Gel 전기영동
BSA	BioShop Canada	ALB001.500	Whatman 여과지용 차단제
Cell free 반응	New England Biolabs	E6800L	PURExpress
CPRG	Roche	10884308001	클로로페놀 red-b-D-galactopyranoside
일회용 멸균 생검 펀치	Integra Miltex	23233-31	384웰 플레이트에 맞는 2mm 종이 디스크를 만드는 데 사용
DNAse I	Thermo Scientific	K2981	체외 전사 반응
DNAse I Kit	Thermo Scientific	74104	DNase I Kit IVT RNA에서 템플릿 DNA를 제거하는 데 사용됩니다
dNTP	New England Biolabs	N0446S	PCR
전기영동 시스템	Bio-Rad	1704487	아가로스 젤 실행에 사용
겔 이미징 스테이션	Bio-Rad	1708265	ChemiDoc XRS+ 이미징 시스템
IVT 키트	New England Biolabs	E2040S	in vitro 전사 템플릿(트리거) RNA 스위치 스크리닝에 사용
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	핵산 농도 측정에 사용됨
NASBA kit	Life Sciences Advanced Technologies	NWK-1	등온 증폭 반응 성분
Nuclease free H20	invitrogen	10977015	반응 혼합물에 첨가
PAGE 전기영동 시스템	Biorad	1658001FC	폴리아크릴아미드 겔 주조 및 실행에 사용
pCOLADuet-LacZ DNA	Addgene	75006
https://www.addgene.org/75006/ Phusion polymerase/reactioin buffer	New England Biolabs	M0530L	PCR
플레이트 리더	BioTek	BioTek NEO2	다중 모드 플레이트 리더, Synergy Neo2
프라이머	Integrated DNA Technologies		맞춤형 올리고 합성
Q5 중합효소/ 반응 완충액	New England Biolabs	M0491L	PCR에 사용
Qiagen PCR Puriifcation Kit	QIAGEN	27106	QIAprep Spin Miniprep Kit
RNA loading dye	New England Biolabs	B0363S	2X RNA loading dye
RNA purification Kit	QIAGEN	EN0521	QIAamp Viral RNA extraction kit
RNase inhibitor	New England Biolabs	M0314S	RNase A, B 및 C의 오염을 방지하는 데 사용됨
RT-qPCR 키트	QIAGEN	208352	QuantiNova 프로브 RT-PCR 키트
SYBR Gold	Invitrogen S11494	S11494	PAGE 핵산용 겔 염색
TAE Buffer	BioShop Canada	TAE222.4	Gel 전기영동 버퍼
Thermal Cycler	Applied Biosystems	4484073	온도 사이클링 및 인큐베이팅 반응에 사용
Whatman 42 여과지	GE Healthcare	1442-042	종이 기반 진단을 위한 분자 구성 요소를 삽입하는 데 사용됩니다