여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
원핵생물에서 글리코실화에 대한 연구는 빠르게 성장하는 영역이다. 박테리아는 표면에 다른 당화 된 구조를 가지고 있으며, 글리 칸은 균주 별 바코드를 구성합니다. 관련 글리 칸은 진핵 생물보다 설탕 조성과 구조에서 더 높은 다양성을 보여 주며 박테리아 - 숙주 인식 과정 및 환경과의 상호 작용에 중요합니다. 병원성 박테리아에서 당단백질은 감염 과정의 여러 단계에 관여했으며 글리 칸 변형은 당단백질의 특정 기능을 방해 할 수 있습니다. 그러나, 글리칸 조성, 구조 및 생합성 경로의 이해에서 이루어진 진보에도 불구하고, 병원성 또는 환경과의 상호작용에서 당단백질의 역할에 대한 이해는 매우 제한적이다. 또한, 일부 박테리아에서, 단백질 글리코실화에 필요한 효소는 리포폴리사카라이드 및 캡슐 생합성 경로와 같은 다른 다당류 생합성 경로와 공유된다. 글리코실화의 기능적 중요성은 글리코실화 과정에 관여하는 것으로 생각되는 특정 유전자의 돌연변이와 표적 당단백질 및 변형 글리칸의 발현에 미치는 영향에 대한 연구를 통해 여러 박테리아에서 해명되었다. 중온성 에어로모나스는 단일 및 O 글리코실화 극성 편모를 갖는다. 편모 글리 칸은 Aeromonas 균주 간의 탄수화물 구성과 사슬 길이의 다양성을 보여줍니다. 그러나, 현재까지 분석된 모든 균주는 세린 또는 트레오닌 잔기를 변형시키는 연결 당으로서 pseudaminic acid 유도체를 보여준다. pseudaminic acid 유도체는 극성 편모 조립에 필요하며 그 손실은 접착, 생물막 형성 및 식민지화에 영향을 미칩니다. 이 기사에 자세히 설명된 프로토콜은 편모 글리칸의 생합성에서 추정적 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 유전자 또는 게놈 영역의 관여를 이해하기 위해 널 돌연변이체의 구축이 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다. 여기에는 글리코실트랜스퍼라제의 기능 및 글리칸의 역할을 이해할 수 있는 잠재력이 포함된다. 이는 글리칸 결핍 돌연변이체를 야생형 균주와 비교함으로써 달성될 것이다.
서론
단백질 글리코실화는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 둘 다에 기술되어 있으며, 아미노산 측쇄 1,2에 대한 글리칸의 공유 부착으로 구성된다. 원핵생물에서, 이 과정은 보통 두 가지 주요 효소적 메카니즘을 통해 발생한다: O- 및 N-글리코실화3. O-글리코실화에서, 글리칸은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기의 히드록실기에 부착된다. N-글리코실화에서, 글리칸은 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser/Thr 내의 아스파라긴(Asn) 잔기의 측쇄 아미드 질소에 부착되며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다.
글리칸은 선형 또는 분지 구조를 채택 할 수 있으며 글리코시드 결합에 의해 공유적으로 연결된 단당류 또는 다당류로 구성됩니다. 원핵생물에서, 글리칸은 보통 진핵 글리칸4과 비교하여 설탕 조성 및 구조에서 다양성을 나타낸다. 더욱이, 글리칸이 조립되고 수용체 단백질로 전달되는 방법에 있어서 상이한 두 개의 상이한 박테리아 글리코실화 경로가 기술되었다: ....
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프로토콜
절차의 개략적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.
1. 에어로모나스에서 편모 글리코실화 섬 (FGIs)의 생물 정보학 식별
- Aeromonas 게놈에서 PseAc 생합성 클러스터를 확인하려면, NCBI 데이터베이스(26)로부터의 tblastn 도구를 사용한다. 먼저, 서열화된 Aeromonas 균주의 데이터베이스로부터 A. piscicola AH-3(식별 코드는 OCA61126.1 및 OCA61113.1)의 PseC 및 PseI에 대한 직교 단백질을 검색한 다음, tblastn 도구를 사용하여 번역된 뉴클레오티드 서열을 검색한다.
참고: pse 유전자는 Aeromonas FGI를 옆으로 향하게 하며, pseB와 pseC는 클러스터의 한쪽 끝에, pseI는 다른 쪽 끝에 위치합니다. 나머지 pse 유전자의 위치는 FGI 그룹마다 다를 수 있다. - 많은 균주의 극성 편모 유전자가 FGIs에 인....
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결과
이 방법론은 편모 글리코실화 및 편모 필라멘트의 역할에 영향을 줄 수 있는 Aeromonas 의 유전자 또는 염색체 영역에서 널 돌연변이를 생성하는 효과적인 시스템을 제공합니다(그림 1).
이 프로토콜은 추정 FGI의 생물 정보학 적 확인과 GT를 코딩하는 유전자가이 영역에 제시하는 것으로 시작됩니다. 에어로모나스에서 FGI의 염색체 위치는 세 가지 유형의 유전자의 검출을 기반으로합니다 : pseudaminic acid (pseI 및 pseC)의 생합성에 관여하는 유전자, 극성 편모 유전자 및 luxC. A. 친수성 AH-130과 같은 단일 pseudaminic acid 유도체에 의해 당화되는 극성 편모가 그의 균주는 FGIs 그룹 I27에 위치한.......
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토론
이 방법의 중요한 초기 단계는 편모 및 추정 GT의 글리코실화에 관여하는 영역을 확인하는 것인데, 이는 이들 효소가 높은 상동성을 보이고 많은 과정에 관여하기 때문이다. 공공 데이터베이스에서 Aeromonas 게놈의 생물 정보학 분석은이 영역이 많은 균주의 편모 유전자를 포함하고 pseudaminic acid27의 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 극성 편모 영역 2에 인접 해 있음을 보여줍니다. 이로 인해 Aeromonas 에서 편모 글리코실화 섬을 검출하기위한 가이드 라인을 개발할 수있게되었으며, 이는 편모 글리칸에 pseudaminic acid 유도체가 포함 된 다른 박테리아에서이 영역을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 편모 글리코실화에 관여하는 유전자 클러스터를 분석하는 방법을 기술하지만, 다른 그람 음성 박테리아에서 편모 형성, 회전 또는 조절에 관여할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 연구하는 데에도 사용될 수 있다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캐나다 국립 연구위원회 (Plan Nacional de I + D) (Ministerio de Economía y Competitividad, Spain) 및 Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia)의 지원을 받았다.
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재료
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참고문헌
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- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobac....
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