이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

1.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63260

⸱

2021년 12월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 이 프로토콜에서, 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다.

초록

초파리 광형질도입은 가장 빠르게 알려진 G 단백질 결합 신호전달 경로 중 하나이다. 이 캐스케이드의 특이성과 효율을 보장하기 위해, 칼슘 (Ca2+)-투과성 양이온 채널, 일시적 수용체 전위 (TRP)는 스캐폴드 단백질에 긴밀하게 결합하고, 불활성화-불활성화-무-전위 D(INAD), 그리고 눈 특이적 단백질 키나아제 C(ePKC) 및 포스포리파제 Cβ/No 수용체 전위 A(PLCβ/NORPA)와 함께 큰 신호전달 단백질 복합체를 형성한다. 그러나 초파리 TRP 채널의 생화학 적 특성은 불분명하다. INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 내인성 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다. 먼저, 정제된 히스티딘 (His)-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 Ni-비드에 결합시키고, 초파리 머리 균질물로부터 내인성 INAD 단백질 복합체를 끌어내리기 위한 미끼로 사용하였다. 이어서, 과량의 정제된 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 TRP 채널과 경쟁하기 위해 Ni-비드에 첨가하였다. 마지막으로, 상청액 내의 TRP 채널을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과도한 TRP 1261-1275 펩티드로부터 분리하였다. 이 방법은 생화학 적 및 구조적 각도 모두에서 초파리 TRP 채널의 게이팅 메커니즘을 연구 할 수있게합니다. 정제된 초파리 TRP 채널의 전기생리학적 특성은 또한 미래에 측정될 수 있다.

서론

광전달은 흡수된 광자가 뉴런의 전기 코드로 변환되는 과정입니다. 그것은 독점적으로 척추 동물과 무척추 동물 모두에서 옵신과 다음 G 단백질 결합 신호 전달 캐스케이드를 전달합니다. 초파리에서, 그의 다섯 PDZ 도메인을 사용하여, 스캐폴드 단백질 불활성화-없음-사후 전위 D(INAD)는 일시적인 수용체 전위(TRP) 채널, 포스포리파제 Cβ/No 수용체 전위 A(PLCβ/NORPA) 및 눈 특이적 단백질 키나아제 C(ePKC)1로 구성된 초분자 신호전달 복합체를 조직한다. 이 초분자 신호 복합체의 형성은 Drosophila 광전달 기계의 정확한 세포 내 국소화, 고효율 및 특이성을 보장합니다. 이 복합체에서 빛에 민감한 TRP 채널은 NORPA의 하류 이펙터 역할을하며 칼슘 유입과 광수용체의 탈분극을 매개합니다. 이전의 연구는 초파리 TRP 채널의 개방이 양성자, 국소 지질 환경의 파괴 또는 기계적 힘 2,3,4에 의해 매개된다는 것을 보여주었습니다. 초파리 TRP 채널은 또한 calmodulin 5와 상호 작용하며 긍정적 인 피드백과 부정적인 피드백 6,7,8 모두에 의해 칼슘에 의해 변조됩니다.

지금까지 초파리 TRP 및 TRP 유사 (TRPL) 채널의 게이팅 메커니즘에 대한 전기 생리학 연구는 절제된 막 패치, 해리 된 야생형 초파리 광수용체로부터의 전체 세포 기록 및 S2, SF9 또는 HEK 세포 2,9,10,11,12,13의 헤테로 발현 채널을 기반으로했지만 정제 된 채널에서는 그렇지 않았습니다. 전장 초파리 TRP 채널의 구조 정보도 불분명하다. 재구성된 막 환경에서 정제된 단백질의 전기생리학적 특성을 연구하고 전장 초파리 TRP 채널의 구조적 정보를 얻기 위해, 정제된 전장 TRP 채널을 얻는 것은 포유동물 TRP 채널 연구14,15,16,17에서 사용된 방법론과 유사한 첫 번째 단계이다.

최근에, INAD 단백질 복합체18,19,20의 조립 메카니즘에 기초하여, 스트렙타비딘 비드5에 의해 초파리 머리 균질물로부터 TRP 채널을 정제하기 위해 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 처음 개발되었다. 스트렙타비딘 비드의 낮은 용량과 비싼 비용을 고려하여, His-태깅된 미끼 단백질과 훨씬 더 높은 용량의 상응하는 저가의 Ni-비드를 사용하는 개선된 정제 프로토콜이 여기에 도입된다. 제안된 방법은 구조적 각도에서 TRP 채널의 게이팅 메카니즘을 연구하고 정제된 단백질로 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 측정하는 데 도움이 될 것이다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. GST 태깅된 TRP 및 그의 태그된 NORPA 단편의 정제

  1. GST 태그 TRP 1261-1275 단편 정화
    1. pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 플라스미드10을 CaCl2 열충격형질전환 방법 21을 이용하여 대장균(E. coli) BL21(DE3) 세포로 형질전환시킨다. 단일 콜로니를 10 mL의 루리아 베르타니(LB) 배지에 접종하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. 이어서, 시딩 배양액 10 mL를 37°C에서 LB 배지 1 L로 증폭시킨다.
    2. 세포의 광학 밀도 (OD600)가 0.5에 도달한 후, 세포를 16°C로 냉각시키고 0.1 mM 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG; 최종 농도)를 첨가하여 표적 단백질의 과발현을 유도하고16°C에서 18시간 동안 배양하였다.
    3. 과발현 후, 3,993 × g에서 20 분 동안 원심분리하여 배양된 세포 펠릿 1 L를 40 mL의 포스페이트 완충 식염수(PBS) 완충액에 재현탁시켰다.
    4. 재현탁된 세포를 4°C에서 예비냉각된 고압 호모게나이저에 로딩한다. 천천히 호모게나이저 압력을 800 bar로 증가시킨다. 입구 탭을 열고 재현탁 된 세포가 매우 좁은 슬릿이있는 밸브를 원형으로 통과하게하십시오.
      참고: 세포는 큰 압력 강하 및 캐비테이션으로 인한 높은 전단력에 의해 균질화됩니다.
    5. 5 mL의 글루타티온 비드를 중력 유동 컬럼에 로딩하고, 비드를 총 3회 동안 PBS 버퍼 50 mL로 세척한다.
    6. 세포 용해물을 고압 호모게나이저로부터 48,384 x g로 원심분리한다. 원심분리된 세포 용해물(40 mL)의 상층액을 중력 유동 컬럼의 평형화된 글루타티온 비드에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 글루타티온 비드를 10분마다 재현탁합니다.
    7. 30분 인큐베이션 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다. 흐름 통과 분수를 버립니다. 나머지 글루타티온 비드를 PBS 버퍼 50 mL로 두 번 헹구십시오.
    8. 15 mL의 용출 완충액을 글루타티온 비드에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.
    9. 30분 인큐베이션 후, 50 mL 원뿔형 튜브에서 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 용출시키고, 크기-배제 컬럼(준비 등급)에 로딩하고, 이는 50 mM 트리스(pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 완충액을 사용하여 평형화된다.
    10. 크기 배제 컬럼의 용출 유속을 3 mL/min으로 유지하십시오. 용출 된 단백질을 5 mL / 튜브의 속도로 수집하십시오.
    11. 280 nm에서 UV 흡수 신호를 분석하여 크기 배제 컬럼에서 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔 분석으로 검증한다 (전기영동 파라미터: 스태킹 겔의 경우 150 V, 분해 겔의 경우 200 V). Coomassie blue R250으로 젤을 얼룩지게하십시오.
    12. 크기 배제 컬럼으로부터 정제된 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 1 mL로 농축하고, 15 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하여 데스크탑 냉장 원심분리기에서 농축하였다.
    13. Beer-Lambert Law를 사용하여 농축 단백질의 농도를 결정하십시오. 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편의 UV 흡수를 측정하였다.
    14. 단백질 서열을 Protparam 프로그램 (https://web.expasy.org/protparam/)으로 임포트하여 280 nm에서 흡광 계수를 구하십시오. 전형적으로, GST 태깅된 TRP 1261-1275의 1 L 배양물은 1 mL의 600 μM 단백질(6 x 10-7 mol)을 산출한다. 필요한 재료 에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
  2. 그의 태그가 붙은 NORPA 863-1095 단편의 정제
    1. pETM.3C NORPA 863-1095 플라스미드 20을 CaCl2 열충격 형질전환 방법21을 이용하여 대장균 BL21(DE3) 세포로 형질전환시킨다. 단일 콜로니를 LB 배지 10 mL에 접종하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. 이어서, 시딩 배양액 10 mL를 LB 배지 1 L에서 37°C에서 증폭시킨다.
    2. 세포의 OD600이 0.5에 도달한 후, 세포를 16°C로 냉각시키고 0.1 mM IPTG (최종 농도)를 첨가하여 표적 단백질의 과발현을 유도하고16 °C에서 18시간 동안 배양한다.
    3. 과발현 후, 펠릿 1 L를 3,993 x g에서 20분 동안 원심분리하여 배양된 세포를 40 mL의 결합 완충액에 재현탁시켰다. 다음에, 재현탁된 세포를 단계 1.1.4에 기재된 바와 같이 4°C의 고압 호모게나이저에서 용해시킨다.
    4. 5 mL의 Ni-비드를 중력 유동 컬럼에 로딩하고 50 mL의 결합 완충액으로 세 번 세척한다.
    5. 세포 용해물을 고압 호모게나이저로부터 48,384 x g로 원심분리한다. 원심분리된 세포 용해물의 상층액을 중력 유동 컬럼의 평형화된 Ni-비드에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. Ni 비드를 10분마다 재현탁합니다.
    6. 30분 인큐베이션 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다. 유동 스루 분획을 버리고 나머지 Ni-비드를 50 mL의 세척 완충액으로 두 번 세척한다.
    7. 용출 완충액 15 mL를 Ni-비드에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한다. Ni 비드를 10분마다 재현탁합니다.
    8. 30분 인큐베이션 후, 용출된 His-태그된 NORPA 863-1095 단편을 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하고, 50 mM 트리스(pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT)를 사용하여 평형화되는 크기 배제 컬럼(준비 등급)에 로딩한다.
    9. 크기 배제 컬럼의 용출 유속을 3 mL/min으로 유지하십시오. 용출 된 단백질을 5 mL / 튜브의 속도로 수집하십시오.
    10. 280 nm에서 UV 흡수 신호를 분석하여 크기 배제 컬럼에서 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔 분석으로 검증한다 (전기영동 파라미터: 스태킹 겔의 경우 150 V, 분해 겔의 경우 200 V). 쿠마시 블루 R250을 사용하여 젤을 얼룩지게하십시오.
    11. 크기 배제 컬럼으로부터 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 1 mL로 농축하고, 15 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하여 데스크탑 냉장 원심분리기에서 농축하였다.
    12. Beer-Lambert Law를 사용하여 농축 단백질의 농도를 결정하십시오. 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편의 UV 흡수를 측정하였다.
    13. 단백질 서열을 Protparam 프로그램 (https://web.expasy.org/protparam/)으로 임포트하여 280 nm에서 흡광 계수를 구하십시오. 전형적으로, His-태깅된 NORPA 863-1095 단편의 1 L 배양물은 1 mL의 600 μM 단백질 (6 x 10-7 mol)을 산출한다. 필요한 재료 에 대해서는 표 2를 참조하십시오.

2. 초파리 머리의 준비

  1. CO2 마취 방법을 사용하여 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브에서 성인 파리를 수집22,23; 즉시 액체 질소에서 10 분 동안 동결하고 -80 ° C 냉동고에 보관하십시오.
  2. 충분한 수의 파리를 수집 한 후 얼어 붙은 50mL 원뿔형 튜브를 손으로 힘차게 흔들어 파리의 다리, 머리, 날개 및 몸을 분리하십시오. 혼합물을 순차적으로 적층된 3개의 미리 냉각된 스테인리스 스틸 체(각각 20/30/40 메쉬 크기)로 옮기고 체를 흔들어 준다.
  3. 다음으로, 헤드가 40 메쉬 체를 통과 할 수 없으므로 브러시를 사용하여 플라이 헤드를 40 메쉬 체에서 쓸어 내고 50 mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 -80 ° C에 보관하십시오.
  4. 파리와 그들의 머리를 지속적으로 수집하여 실험에 필요한 양 (0.5 g)에 도달 할 때까지 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 일반적으로 0.5g의 머리를 수집하려면 50mL 원뿔형 튜브에 35mL의 파리가 필요합니다. 필요한 재료 에 대해서는 표 3을 참조하십시오.

3. 초파리 TRP 채널 정제

  1. 총 0.5g의 헤드를 계량하고 사전 냉각 된 모르타르 페슬을 사용하여 액체 질소에서 완전히 균질화하십시오. 균질화된 헤드를 10x v/w 용해 완충액(5 mL)에 용해시키고, 4°C의 진탕기에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 20분 동안 20,817 x g 에서 원심분리한다.
  2. 스핀다운 상청액("20817 g S", 도 4)을 수집하고, 이를 4°C에서 60분 동안 100,000 x g 에서 추가로 원심분리한다. 다음의 풀다운 분석을 위해 스핀 다운 상청액 ("100,000 g S", 도 4)을 사용한다.
  3. 1 mL의 Ni 비드를 중력 유동 컬럼에 첨가하고, 비드를 10 mL의 이중 증류 H2O (ddH2O)로 4°C에서 총 3회 동안 세척하였다. 비드를 4°C에서 세 번 10 컬럼 부피의 용해 완충액으로 평형화시킨다.
  4. 500 μL의 600 μM 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질 (3 x 10-7 mol)을 Ni 컬럼에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.
  5. 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 스루 분획을 분리한다. SDS-PAGE 분석을 위해 플로우 스루 분획을 취한다(NORPA F, 도 4). 이 섹션에서는 미끼 단백질이 Ni 비드에 고정화됩니다.
  6. Ni 비드를 4°C에서 10 컬럼 부피의 용해 완충액(10 mL)으로 세척하고, SDS-PAGE 분석을 위해 세척 분획을 유지한다(세척 1, 도 4A). 상기 단계를 반복하고 SDS-PAGE 분석을 위해 샘플을 보관한다(세척 2, 도 4A). 이 섹션에서는 Ni 비드의 과도한 미끼 단백질이 제거됩니다.
  7. 초파리 헤드 균질액의 상층액을 100,000 x g 원심분리 후 4°C에서 Ni 컬럼에 넣고, 여기서 His-태그된 NORPA 863-1095 단편이 고정화되었다.
  8. 상청액을 Ni 비드와 함께 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오. 이어서, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동-관통 분획을 분리한다.
  9. SDS-PAGE 분석을 위해 상청액을 수집한다(Dro head lysis F, 도 4A). 이 섹션에서, 헤드 균질물 내의 INAD 단백질 복합체 (INAD/TRP/ePKC)는 Ni-비드 상에 고정화된 NORPA 863-1095 단편에 의해 포획된다.
  10. Ni 비드를 4°C에서 10 컬럼 부피의 용해 완충액(10 mL)으로 세척하고, SDS-PAGE 분석을 위해 중력 침전으로부터 상청액을 유지한다(세척 3, 도 4A). 상기 단계를 반복하고 SDS-PAGE 분석을 위해 상청액을 수집한다(세척 4, 도 4A). 이 섹션에서는 Ni 비드 상의 결합되지 않은 단백질이 제거됩니다.
  11. 500 μL의 600 μM의 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단백질 (3 x 10-7 mol)을 Ni- 비드에 첨가하고, 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.
  12. 내인성 초파리 TRP 채널을 포함하는 중력 컬럼 (TRP E1, 도 4B)으로부터 용출된 분획을 수집한다. 상기 단계를 반복하고 용출 분획을 수집한다(TRP E2, 도 4B). 이 단계에서, GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편을 경쟁자로서 사용함으로써, TRP 채널은 Ni-비드 상의 포획된 INAD 단백질 복합체(INAD/TRP/ePKC)로부터 용출된다.
  13. Ni-비드를 10 컬럼 부피의 결합 완충액 (10 mL; 표 1) 4°C에서 SDS-PAGE 분석을 위해 세척 분획을 수집하였다(세척 5, 도 4B).
  14. 500 μL의 용출 완충액(표 1)을 Ni 비드에 첨가하고, 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 중력 유동 컬럼으로부터 용출 분획을 수집한다(NORPA E1, 도 4B). 상기 단계를 반복하고, 용출 분획을 수집한다(NORPA E2, 도 4B).
  15. 용출 완충액을 사용하여, INAD/ePKC 단백질 복합체와 함께 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 용출시킨다. 다음에, Ni 비드를 500 μL의 결합 완충액에 재현탁시킨다.
  16. 재현탁된 Ni 비드를 취하여 SDS-PAGE(쿠마시 블루 R250으로 염색)를 실행하여 용출의 효율을 분석하고 용출액이 작동하는지 평가하였다(비드, 도 4B). 필요한 재료 에 대해서는 표 4 를 참조하십시오.

4. 초파리 TRP 채널의 크기 배제 컬럼 정제

  1. 단백질 정제 시스템에 크기 배제 컬럼 (분석 등급)을 설치하십시오. 컬럼을 컬럼 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.75 mM DDM)으로 평형화시키고, 이는 0.45 μm 필터에 의해 여과된다.
  2. 단계 3.14로부터의 TRP E1 및 E2 분획을 4 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 농축시키고, 냉장 원심분리기에서 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하였다.
  3. 컬럼 버퍼로 샘플 루프를 헹구고 샘플을 샘플 루프에 로드합니다. 샘플을 크기 배제 컬럼에 주입하고 적절한 유량 (0.5 mL / 분)으로 단백질을 용출시킵니다.
  4. 280 nm에서 흡수하여 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔을 실행하여 정제된 내인성 초파리 TRP 채널을 검출한다(도 5). 필요한 재료 에 대해서는 표 5를 참조하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 기사에서는 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하는 단백질 정제 방법을 시연합니다 (그림 1).

먼저, 재조합 단백질 발현 및 정제가 미끼 및 경쟁자 단백질을 얻기 위해 적용된다. 이어서, GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 LB 배지의 대장균 BL21 (DE3) 세포에서 발현시키고, 글루타티온 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다 (도 2). 샘플을 쿠마시 블루 R250 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석을 사용하여 검증하였다. SDS-PAGE 샘플 제조 공정에서, 30 μL의 단백질 샘플을 10 μL의 4x 로딩 염료와 혼합하고 100°C에서 10분 동안 비등시킨다. 이어서, 15 μL의 삶은 샘플이 각 웰에 개별적으로 로딩된다. His-태깅된 NORPA 863-1095 단편은 또한 LB 배지에서 대장균...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

다섯 개의 PDZ 도메인을 포함하는 INAD는 초파리 광전달 기계의 핵심 조직자입니다. 이전의 연구는 INAD PDZ3이 절묘한 특이성(KD = 0.3 μM)18을 갖는 TRP 채널 C 말단 꼬리에 결합한다는 것을 보여주었다. INAD PDZ45 탠덤은 매우 높은 결합 친화도(KD = 30 nM)를 갖는 NORPA 863-1095 단편과 상호작용한다. 이러한 발견은 친화성 정제와 경쟁 전략을 설계하기 위한 견고한 생화학적 기반을 제공하여 NORPA CC-PBM 단편을 풀다운 미끼로 사용할 수 있게 하는 반면, TRP C 말단 꼬리(단편 1261-1275)는 경쟁 시약으로 기능합니다. 따라서, 이 방법의 첫 번째 중요한 점은 INAD 복합체의 조립 메커니즘을 이해하고 충분한 NORPA 및 TRP 단편을 얻는 것이다. 동시에, TRP 채널은 멤브레인으로부터 추출되고 용액에서 안정화되어야하는 막 단백질이기 때문에 세제의 사용은이 방법의 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (제 31870746 호), 심천 기본 연구 보조금 (JCYJ20200109140414636) 및 중국 광동성 자연 과학 재단 (No. 2021A1515010796)이 W. L. L. 이 원고를 준비하는 동안 언어 적 도움을 주신 LetPub (www.letpub.com)에게 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent CellsNovagen69450Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain블루밍턴 초파리 주식 센터BDSC:3605Drosophila < / em > head 준비
< 강> 재질 < / strong >
20 / 30 / 40 메쉬 스테인레스 스틸 체Jiufeng 금속 메쉬 회사GB / T6003.1 < / em > head 준비
30 % 아크릴 아미드 -N, N &prime ; -Methylenebisacrylamide (29 : 1)LableadA3291SDS-PAGE 젤 준비
과황산 암모늄InvitrogenHC2005SDS-PAGE 겔 제제
칵테일 프로테아제 억제제Roche05892953001프로테아제 억제제
Coomassie brilliant blue R-250Sangon BiotechA100472-0025SDS-PAGE 겔 염색
DL-Dithiothreitol (DTT)Sangon BiotechA620058-0100크기 배제 컬럼 완충액 준비
에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 (EDTA)Sangon BiotechA500838-0500크기 배제 컬럼 완충액 준비
글리신Sangon BiotechA610235-0005SDS-PAGE 완충액 준비
글루타티온 세파로스 4 고속 유동 비드Cytiva17513202친화성 크로마토그래피
이미다졸Sangon BiotechA500529-0001용리 완충액 Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sangon BiotechA600168-0025단백질 과발현
유도 LB Broth PowderSangon BiotechA507002-0250E.coli. 세포 배양
L-Glutathione reduced (GSH)Sigma-aldrichG4251-100G글루타티온 비드
용 용리 완충액 준비Ni-Sepharose 엑셀 비드Cytiva17371202친화성 크로마토 그래
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)Sangon BiotechA610424-001단백질 정제 용 세제
N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)Sigma-aldrichT9281-100MLSDS-PAGE 겔 준비
PBSSangon BiotechE607008-0500E.coli. 세포 PMSF용 균질화 완충
LableadP0754-25G프로테아제 억제제
Prestained protein markerThermo Scientific26619/26616Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade)Cytiva28989336HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade)Cytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL column
염화나트륨Sangon BiotechA501218-0001단백질 정제 완충액 준비
도데실황산나트륨 (SDS)Sangon BiotechA500228-0001SDS-PAGE 젤 / 완충액 준비
Tris baseSigma-aldrichT1503-10KG단백질 정제 완충액 준비
한외 여과 스핀 columnMilliporeUFC901096/801096단백질 농도
Equipment
분석 저울DENVERAPX-60Metage of Drosophila head
15mL 및 50mL 코니컬 원심분리 튜브용 탁상용 고속 냉장 원심분리기Eppendorf5810R단백질 농축
탁상용 고속 냉장 원심분리기 1.5mL 원심분리 튜브Eppendorf5417R균질화 후 Drosophila 헤드 용해물의 원심
빈 중력 흐름 컬럼(내경=1.0cm)Bio-Rad738-0015TRP 단백질 정제
빈 중력 흐름 컬럼(내경=2.5cm)Bio-Rad738-0017E.coli.
Gel 문서화 시스템Bio-RadUniversal Hood II Gel Doc XR 시스템SDS-PAGE 이미징
고속 냉장 원심분리기Beckman coulterAvanti J-26 XPE.coli. 세포/세포 용해물의 원심
균질화UNION-BIOTECHUH-05E.coli. 세포의 균질화
액체 질소 탱크Taylor-WhartonCX-100Drosophila head 준비
단백질 정제 시스템CytivaAKTA 정제단백질 정제
냉장고 (-80° C)Thermo900GP < / em >head 준비
분광 광도계MAPADAUV-1200OD600 E.coli.< / em > 세포 측정
분광 광도계Thermo ScientificNanoDrop 2000c단백질 농도 측정
초 원심 분리기Beckman coulterOptima XPN-100 초 원심 분리기초원심분리
준비피 액 : 분리 분리 고압 기

참고문헌

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075(2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191(2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

초파리 TRP 채널단백질 복합체 정제친화성 정제크기 배제 크로마토그래피니켈 비드글루타치온 비드INAD 단백질 복합체광전달 경로초저온 전자현미경(Cryo-EM) 기술
내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.