이 기사는 남성 감수 분열에 대한 귀중한 모델인 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통한 CENP-E의 생체 내 억제를 보고합니다. 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 CENP-E 억제가 마우스 정자세포에서 염색체 정렬 불량 및 게놈 불안정성을 초래한다는 것을 보여줍니다.
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방법 논문
In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가
이 논문에서
요약
초록
진핵생물에서 감수분열은 유성 생식의 게놈 안정성과 유전적 다양성에 필수적입니다. 고환의 정자 세포에 대한 실험적 분석은 남성 감수분열에서 방추 조립 및 염색체 분리를 조사하는 데 중요합니다. 마우스 정자 세포는 감수 분열의 기계론적 연구에 이상적인 모델이지만 정자 세포 분석을 위한 효과적인 방법이 부족합니다. 이 논문에서는 마우스 정자세포에서 kinesin-7 CENP-E의 생체 내 억제를 위한 실용적이고 효율적인 방법이 보고되어 있습니다. 3 주 된 마우스에서 복부 수술을 통해 GSK923295 특정 억제제의 고환 주사에 대한 자세한 절차가 제시됩니다. 또한, 여기에 설명된 것은 조직 수집 및 고정, 헤마톡실린-에오신 염색, 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경을 위한 일련의 프로토콜입니다. 여기에서 우리는 남성 감수분열을 연구하는 강력한 기술이 될 수 있는 복부 수술과 고환 주사를 통한 생체 내 억제 모델을 제시합니다. 우리는 또한 CENP-E 억제가 감수 분열 I 동안 일차 정자 세포에서 염색체 정렬 불량 및 중기 정지를 초래한다는 것을 입증합니다. 우리의 생체 내 억제 방법은 감수분열에 대한 기계론적 연구를 용이하게 하고, 남성 생식선의 유전자 변형에 유용한 방법으로 작용하며, 향후 임상 적용에 대한 빛을 비출 것입니다.
서론
감수 분열은 진핵 생물에서 가장 중요하고 매우 엄격하며 진화적으로 보존된 사건 중 하나이며 배우자 형성, 유성 생식, 게놈 무결성 및 유전적 다양성에 필수적입니다 1,2,3. 포유류에서 생식 세포는 단일 라운드의 DNA 복제 후 감수 분열 I과 II라는 두 가지 연속적인 세포 분열을 겪습니다. 유사분열의 자매 염색분체와 달리, 복제된 상동 염색체는 감수 분열 I 4,5 동안 쌍을 이루어 두 개의 딸 세포로 분리됩니다. 감수 분열 II에서 자매 염색분체는 분리되어 DNA 복제 없이 반수체 배우자를 형성합니다6. 방추 조립 결함 및 염색체 오분리를 포함한 두 감수 분열 중 하나의 실수는 배우자의 손실, 불임 또는 이수성 증후군을 초래할 수 있습니다 7,8,9.
축적된 연....
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프로토콜
모든 동물 실험은 복건 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 SYXK 2016-0007)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 모든 마우스 실험은 미국 국립보건원(NIH 간행물 번호 8023, 1978년 개정판)의 관련 가이드라인에 따라 수행하였다.
1. GSK923295 매개 CENP-E 억제 마우스 모델의 구성
- 수술 기구를 121°C에서 30분 동안 소독합니다. 수술용 울트라 클린 작업대에 자외선-C(UVC)를 2시간 동안 조사합니다. 실험에 사용된 3주령의 수컷 ICR(Institute of Cancer Research) 마우스의 무게를 측정하고 필요한 마취제의 투여량을 계산한다.
- 복강 주사를 통해 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 조합을 투여하여 마우스를 마취합니다. 마우스 각막 반사, 통각 반사, 호흡 및 근긴장의 조합을 통해 마우스의 마취 깊이를 확인하십시오. 마우스가 심하게 마취되었는지 확인합니다.
알림: 수술 중 열 지원을 제공하기 위해 동물을 가열 패드에 올려 놓습니다. - 마우스 팔다리를 묶어 왁스 트레이에 고정하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 마우스 눈에 수의사 연고 한 방울을 떨어 뜨립니다. 실....
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결과
복부 수술과GSK923295 19의 고환 주사를 통해 마우스 고환의 in vivo CENP-E 억제 모델을 성공적으로 구축했습니다. 이 방법의 주요 기술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 4일 동안 GSK923295의 고환 주사 후, 추가 분석을 위해 고환을 채취하였다. 대조군에서, 정세관의 정자 형성 파동은 규칙적이고 조직적이었다 (그림 2A). 그러나, GSK923295 그룹에서, 정세관에서 정자 형성 파동이 변경되었고, 중기 정지 된 일차 정자 세포는 CENP-E 억제 후 유의하게 증가했다 (그림 2B-D). 중요하게도, 여러 상동 염색체가 CENP-E 억제 후 적도 판에서 정렬되지 않았습니다(그림 2B-D
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토론
본 연구에서는 복부 수술과 GSK923295의 미세주입을 이용하여 마우스 고환의 in vivo CENP-E 억제 모델을 확립하였다. 본 연구에서 사용한 복부 수술 및 고환 주사 방법은 다음과 같은 장점이 있다. 첫째, 생쥐의 나이에 한정되지 않는다. 실험자는 초기 단계, 예를 들어 3 주 된 어린 마우스에서 고환 주사를 수행 할 수 있습니다. 둘째, GSK923295는 CENP-E에 특이적이고 우수한 억제 효과를 갖는다. 셋째, 이 방법은 작동이 간단하고 재현성이 높습니다. 또한, 고환의 완전성이 유지되며, 이는 장기의 맥락에서 손상되지 않은 조직의 연구에 적합합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 예를 들어, 수술 후 감염의 예방을 위해 복부 수술 중 무균 환경을 유지하는 것이 중요하다31. 또한, 다른 연령 또는 다른 실험 동물의 마우스의 경우, 주사량은 고환의 크기와 약물의 효과에 따라 적절하게 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
유용한 토론을 해주신 Fujian Medical University의 Cytoskeleton Laboratory의 모든 구성원에게 감사드립니다. 유세포 분석에 대한 기술 지원을 해주신 Fujian Medical University Public Technology Service Center의 Jun-Jin Lin에게 감사드립니다. 전자 현미경에 대한 기술 지원을 위해 Fujian Medical University 공공 기술 서비스 센터 전자 현미경 연구실의 Ming-Xia Wu와 Lin-Ying Zhou에게 감사드립니다. Fujian Medical University의 기초 의학 실험 교육 센터의 Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke 및 Jun Song의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 다음과 같은 보조금의 지원을 받았습니다: 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 82001608), 중국 푸젠성 자연 과학 재단(보조금 번호 2019J05071), 복건성 보건 기술 프로젝트(보조금 번호 2018-1-69), 과학 연구 창업 기금, 복건 의과 대학(보조금 번호 2017XQ1001), 복건 의과 대학 고급 인재 과학 연구 창업 자금 지원 프로젝트(보조금 번호 XRCZX2017025) 및 연구 프로젝트 한의학 대학원생의 온라인 교육 및 교육(보조금 번호 B-YXC20200202-06)....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco 25200056 | ||
| 1ml 주사기 | 여러 상업용 브랜드 사용 | 가능 멸균. | |
| 1.5 mL 원심분리기 튜브 | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Corning | 430828 | |
| 6 cm 페트리 접시 | Corning | 430166 | |
| 95% 에탄올 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal 항체 | Beyotime | AF0001 | 면역형광 분석용. 1:100에 사용합니다. |
| 토끼 항 히스톤 H3 (phospho S10) 단클론 항체 | Abcam | ab267372 | 면역 형광 분석용. 1:100에 사용합니다. |
| 토끼 항 TUBA4A 다클론 항체 | Sangon Biotech | D110022 | 면역 형광 분석용. 1:100에 사용합니다. |
| Anti-SYCP3 토끼 단클론 항체 | Abcam | ab175191 | 면역형광 분석용. 1:100에 사용합니다. |
| 접착 현미경 슬라이드 | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488 표지 염소 항토끼 항체 | Beyotime | A0423 | Sencodary 항체. 1:500에 사용합니다. |
| 알루미늄 황산칼 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 10001060 | |
| 무수 에탄올 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 100092690 | |
| 페이드 방지 장착 매체 | Beyotime | P0131 | 형광 신호의 광흑 방지. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| 소 혈청 알부민 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 69003435 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| 클로랄 수화물 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 80037516 | |
| 구연산 | 상하이 실험 시약 Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. 두께 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| 염료 | 91347802 | ||
| Eosin Y, 알코올 용해성 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm 화학 시약 | 10009318 | |
| 포름 알데히드 - 수용액 | Sinopharm 화학 시약 10010018 | ||
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, 무수 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 71020784 | |
| ICR 마우스 | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | 형광 이미지 분석. |
| 라이카 초박 절편기 | Leica Leica | ||
| EM UC-7 초박 절편기 | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | 유세포 분석 결과 분석용. | |
| 매니큐어 | 사용 가능한 | ||
| 껌 | Sinopharm 화학 시약 유한 공사 | 10004160 | |
| 니콘 Ti-S2 현미경 | 니콘 | Ti-S2 | |
| 피크 산 | 시노팜 화학 시약 유한 공사 | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μ l rheodyne |
| 슬라이스 파라핀 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 69019461 | |
| 요오드 산 나트륨 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 80117214 | |
| 수술 도구 | 사용할 수있는 | . 121 °에서 살균하십시오. C, 20분 | |
| 투과 전자 현미경 | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30188928 | 0.25% 작업 용액을 만들기 위해 멸균 PBS에 희석합니다. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30189328 | 멸균 PBS에 희석하여 0.1% 작업 용액을 만듭니다. |
| 파라 포름 알데히드 | Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm 화학 시약 10023418 |
참고문헌
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
- Brandeis, M.
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