본 프로토콜은 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 유도하기 위해 대퇴골 동맥 및 정맥 전기응고와 산화질소 합성효소 억제제의 투여를 결합한 말초 동맥 질환의 독특하고 임상적으로 관련된 모델을 기술한다. 심장 내 DiI 관류는 풋패드 혈관 구조의 고해상도, 입체 영상화에 사용됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
말초 동맥 질환 (PAD)은 죽상 경화성 위험 인자에 대한 만성 노출로 인한 이환의 중요한 원인입니다. 가장 심한 형태, 만성 사지를 위협하는 허혈 (CLTI)으로 고통받는 환자는 만성 통증, 통증이없는 제한된 도보 거리 및 치유되지 않는 상처를 포함하여 일상 생활에 상당한 장애에 직면합니다. 전임상 모델은 PAD를 연구하기 위해 다양한 동물에서 개발되었지만 마우스 뒷다리 허혈은 여전히 가장 널리 사용되고 있습니다. 이들 모델에서 허혈성 모욕에 대한 반응에서 상당한 변동이 있을 수 있는데, 사용된 마우스 균주 및 동맥 파괴의 부위, 수 및 수단에 의존한다. 이 프로토콜은 CLTI의 조직 손실과 유사한 프렌드 바이러스 B (FVB) 마우스에서 발판 괴괴를 안정적으로 유도하기 위해 대퇴 동맥 및 정맥 전기 응고를 산화 질소 신타제 (NOS) 억제제의 투여와 결합하는 독특한 방법을 설명합니다. 레이저 도플러 관류 영상 (LDPI)과 같은 재관류를 평가하는 전통적인 수단이 여전히 권장되지만, 친유성 염료 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염 (DiI)의 심장 내 관류는 혈관 구조를 라벨링하는 데 사용됩니다. 후속 전체 마운트 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사는 뒷다리 허혈 모델에서 재관류를 평가하는 전통적인 수단을 보완하는 풋패드 혈관 네트워크의 고해상도, 3차원(3D) 재구성을 가능하게 합니다.
서론
죽상 동맥 경화증으로 인해 사지로의 혈류 감소를 특징으로하는 말초 동맥 질환 (PAD)은 미국에서 6.5 백만 명과 전 세계적으로 2 억 명에게 영향을 미칩니다1. PAD 환자는 사지 기능과 삶의 질이 저하 된 경험을하고, PAD의 가장 심각한 형태 인 CLTI를 가진 환자는 절단 및 사망 위험이 증가하며 5 년 사망률은 50 % 2에 가깝습니다. 임상 실습에서, 발목-상완 지수(ABI) <0.9를 갖는 환자는 PAD를 갖는 것으로 간주되고, ABI <0.4를 갖는 환자는 CLTI3을 갖는 것으로 휴식 통증 또는 조직 손실과 관련된다. 증상은 일상 활동, 허혈에 대한 근육 내성, 해부학 적 변화 및 부수적 인 발달의 차이에 따라 유사한 ABI를 가진 환자간에 다릅니다4. 디지트 및 사지 괴저(Digit and limb gangrene)는 CLTI를 초래하는 모든 혈관 폐쇄성 질환 중 가장 심각한 증상이다. 그것은 연조직을 미라화하는 건조한 괴사의 한 형태입니다. 죽상 경화성 PAD 외에도 당뇨병, Buerger 병 및 Raynaud 현상과 같은 혈관염 또는 말기 신장 질환의 설정에서 calciphylaxis 환자에서도 관찰....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
프로토콜에 기재된 모든 동물 실험은 마이애미 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받았다. FVB 마우스, 8-12 주 나이의 남성과 여성 모두 연구에 사용되었다.
1. L-NAME 용액의 제조
- 층류 후드의 멸균 조건 하에서, L-NAME 분말 1g( 물자재 표 참조) 1g을 멸균수 20mL와 용해시켜 50mg/mL의 용액을 만들어 L-NAME 원액을 준비한다. 원액을 -20°C에서 300-500 μL 분취량으로 최대 3개월 동안 보관한다.
- 작동 L-NAME 용액을 만들기 위해, L-NAME 원액의 분취량을 해동하고 멸균 조건 하에서 PBS (1:4)로 희석하여 최종 10 mg/mL 농도를 얻었다.
- PBS (pH 7.4)를 제조하기 위해, 800 mL의 증류수에 8 g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g의 Na2HPO4, 및 0.23 g의 NaH2PO4를 용해시켰다. HCl로 pH를 7.4로 조정하십시오. 총 부피 1,000 mL에 물을 넣고 0.22 μm 병 탑 필터를 통해 여과하십시오.
참고 : L-NAME 작....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 프로토콜은 감수성이 있는 FVB 마우스에서 대퇴골 동맥 및 정맥 응고와 L-NAME 투여, 산화질소 신타제 억제제의 조합을 사용하여 뮤린 풋패드에서 허혈 및 조직 손실을 유도하는 신뢰할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 도 1 은 뮤린 뒷다리 혈관구조의 해부학을 상세히 기술하고 대퇴골 동맥 및 정맥 응고 부위(황색 X)를 나타내며, 측방둘레 대퇴골 동맥(LCFA)에 바로 근접하고 사페노포플라이트 접합부에 근위한다. LCFA를 식별해야 하며, 이 구조에 해당하는 응고 부위는 모든 수술 과정 전반에 걸쳐 일관되게 유지됩니다. 기술된 바와 같이, 수술 절차 2시간 전과 수술 후 1-3일에, 마우스는 또한 산화 스트레스의 상승된 조직 수준을 유지하기 위해 L-NAME의 40 mg/kg IP를 투여하였다. 도 2 는 수술 일주일 후 이 모델로부터 예상될 수 있는 조직 손실의 변화를 보여주며, Faber
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
마우스 뒷다리 허혈은 PAD 및 CLTI에서 신생혈관화를 연구하기 위해 가장 널리 사용되는 전임상 모델이지만, 사용된 특정 마우스 균주 및 동맥 파괴의 부위, 수 및 방법에 따라 허혈 중증도 및 회복에 상당한 차이가 있다. 대퇴골 동맥 결찰 및 L-NAME의 IP 투여의 조합은 FVB 마우스11에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 확실하게 유도할 수 있다. 동일한 치료로 C57BL/6 마우스에서 조직 손실이 없는 뒷다리 허혈이 발생하는 반면, BALB/c 마우스에서는 발이나 다리의 자동 절단이 대퇴골 동맥 결찰만으로 유도될 수 있습니다. 이와 같이, 허혈 모욕에 대한 중간 반응을 갖는 FVB 마우스에서 L-NAME 동시 투여를 통한 대퇴골 동맥 응고의 전술한 기술은 CLTI로 이어지는 질환의 가장 심각한 징후에서 보여지는 것과 유사한 발판 괴저의 독특하고 재현 가능한 모델을 제공한다. 이 모델에서 관찰 된 조직 손실의 정도는 허혈성 손톱 몇 개에서 여러 괴저성 숫자까지 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 국립 보건원 (R01HL149452 및 VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS))의 Z-J L 및 OC V에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 또한 마이애미 의과 대학의 마비를 치료하기위한 마이애미 프로젝트의 현미경 검사 및 이미징 시설에 감사 드리며 이미지 분석 및 처리 소프트웨어에 대한 액세스를 제공합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 바인더 클립(소) | 사무용품점 | ||
| 부프레노르핀(서방형) | |||
| 버터플라이 바늘(Luer-Lok 포함 25G) | VWR 10148-584 | ||
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Leica | TCS SP5 | |
| DiI(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| 전기 소작 장치 | Gemini Cautery System | 5917 | |
| 에탄올 (100%) | VWR | 89370-084 | |
| 피지(ImageJ) 소프트웨어 | NIH | 사용 버전 2.1.0. 무료 다운로드, 라이선스가 필요하지 않습니다. | |
| 폼 생검 패드 | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| 포르말린(중성 완충, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB 마우스 | Jackson Laboratory | 001800 | |
| 포도 | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris 소프트웨어 | Oxford Instruments | 버전 9.6.0을 사용했습니다. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| 케타민 | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine 메틸 에스테르 염산염) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| 레이저 도플러 관류 이미저 | MoorLDI | moorLDI2-HIR | 중고 moorLDI V5 소프트웨어. |
| 현미경 슬라이드 (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| 바늘(27g) | BD | 305109 | |
| 포비돈-요오드 면봉(10%) | 메드라인 | MDS093901ZZ | |
| 수술 기구 | 로보즈 서지컬 | 파인 핀셋, 바늘 드라이버, 스프링 가위, 지혈을 권장합니다. | |
| 봉합사(5-0 흡수성) | DemeTECH | G275017B0P | |
| 주사기(10mL) | BD | 305482 | |
| 3방향 스톱콕 | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| 혈관 분석 플러그인 | 무료 다운로드, 라이선스 필요 없음. 참조 : Elfarnawany (2015). | ||
| 자일라진 |
참고문헌
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
