거핵생물증(Megakaryopoiesis)을 탐구하기 위한 In vitro 및 In vivo 방법

François Lanza; Christian Gachet; Anita Eckly

doi:10.3791/63286

방법 논문

거핵생물증(Megakaryopoiesis)을 탐구하기 위한 In vitro 및 In vivo 방법

704 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63286

⸱

2021년 11월 17일

François Lanza¹ , Christian Gachet¹ , Anita Eckly¹

¹Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

이 논문에서

초록

논의 된 기사 :

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. 거핵세포 분화 및 혈소판 형성을 연구하기 위한 세포 소스로서의 백혈구 분리 필터 유래 CD34+ 세포. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. 마우스 거핵 세포 전구 세포의 분리. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62498 (2021).

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. 세포 성숙을 개선하고 강성과 구속의 영향을 연구하기 위해 3D 메틸셀룰로오스 기반 하이드로겔에서 거핵 세포 배양. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62511 (2021).

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. 투과 전자 현미경을 사용한 쥐 거핵 포이에시스의 현장 탐사. 시각화 실험 저널: JoVE. (171) e62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. 마우스 신선한 골수 이식의 혈소판 형성 역학. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), e62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. 마우스 두개골 골수에서 거핵세포 및 프로혈소판의 생체 내 이광자 이미징. 시각화 실험 저널: JoVE. (171), E62515 (2021년)

사설

혈소판은 골수(BM)의 거핵구(MK)에서 파생되는 지혈에 필수적인 작은 무핵 혈액 세포입니다. 조혈 줄기 세포에서 분화하는 동안 MK는 배수체화와 세포질 성숙을 포함하는 복잡한 분화 및 성숙 과정에서 거대 세포로 발달합니다. MK가 내피 세포와 접촉할 때 발달의 마지막 단계에서 MK는 성숙 단계에 도달하고 전혈소판이라고 하는 긴 세포질 확장을 혈관으로 확장한 다음 단편화되어 혈류에서 혈소판을 생성합니다 ^1,2. MK 성숙과 경내피 전혈소판 형성을 조절하는 메커니즘은 아직 불완전하게 이해되어 있습니다. 이 컬렉션의 목표는 시험관 내 및 생체 내 MK의 생물학을 더 잘 이해하는 데 기여할 보완적인 방법을 모으는 것입니다.

MK의 시험관 내 확장 및 분화는 혈소판 생물 발생의 기본 메커니즘을 연구하는 데 널리 사용됩니다. Pongerard 등의 프로토콜에서 저자는 인간 CD34⁺ 조혈 전구 세포로부터 MK를 분화하기 위한 표준화된 배양 프로토콜을 설명합니다. 그들은 특히 혈액 센터에서 사용할 수 있는 백혈구 필터가 CD34⁺ 세포 수집을 위한 탁월한 공급원임을 강조합니다. 이 기사에는 CD34⁺ 세포를 추출하는 방법, 순도를 평가하는 방법 및 파종 밀도의 중요성에 대한 몇 가지 필수 지침이 포함되어 있습니다. 저자는 또한 기능성 혈소판을 효율적으로 방출하기 위해 5회 연속으로 보정된 피펫팅 방법을 제안합니다. 이 방법의 흥미로운 응용 분야는 CRISPR-Cas9 게놈 편집 방법 ^3,4를 사용하여 약리학적 화합물을 평가하거나 CD34⁺ 세포를 유전적으로 조작할 수 있다는 것입니다. 마우스 연구를 위해 Kimmerlin et al. 분자 및 세포 분석과 호환되는 충분한 수로 MK 전구세포를 정제하기 위한 세포 분류 전략을 제시합니다. 저자는 장골능을 많은 수의 조혈 전구 세포를 포함하는 골수의 공급원으로 사용하고 세포 표면 마커의 조합을 사용하여 세포 분류 전에 원치 않는 세포의 2단계 자기 고갈을 수행하는 장점에 대해 논의합니다. 이 방법의 주요 장점은 예를 들어 조혈 전구세포의 계층 구조와 분화를 연구하는 연구자들에게 흥미로울 수 있는 고도로 정제된 MK 전구세포를 얻는 데 필요한 동물의 수를 줄이는 것입니다. 이러한 맥락에서 Boscheret al. 생체 내 환경을 더 잘 모방하기 위해 2% 메틸셀룰로오스로 구성된 3D 배지에서 전구세포를 성장시키는 방법을 설명합니다. 사실, 이 저자들은 이전에 3D 하이드로겔에서 성장한 MK가 액체 배지에서 성장한 MK에 비해 더 큰 성숙 상태와 더 큰 전구 형성 능력을 달성한다는 것을 입증했습니다⁵. 최적의 배지 강성을 얻기 위한 적절한 양의 메틸셀룰로오스, 각 실험 조건에서 동등해야 하는 세포 수 및 오염 위험과 같은 중요한 단계는 이 프로토콜에서 강조됩니다. 성숙 수준의 기능적 검증을 위해 저자는 배양 3일째에 겔 배양 세포를 액체 배지에 재현탁하는 방법과 면역염색, 유세포 분석 또는 전자 현미경을 통해 향후 분석을 위해 세포를 고정하는 방법을 설명합니다. 투과 전자 현미경(TEM)은 MK의 고해상도 미세 구조를 제공하기 위해 선택되는 이미징 접근 방식입니다. 여기에서, Scandola et al. 자연 BM 환경에서 MK의 미세 구조를 분석하고 세포 밀도를 정량화하고 다양한 성숙 단계를 점수화하는 프로토콜을 공유합니다. 저자는 TEM을 사용하여 MK가 정현파 벽과 상호 작용할 때 발생하는 세포 사건(예: 내피를 관통하는 짧은 침습성 포도좀 유사 돌출부)을 분석합니다⁶. 이 방법의 한계는 이러한 미성숙 세포의 특정 미미세 구조 특징이 부족하기 때문에 MK 결합의 초기 단계를 분석할 수 없다는 것입니다. 언급한 바와 같이, 이 이미징 접근법은 작은 BM 샘플을 사용하여 단일 마우스로 여러 연구를 수행할 수 있다는 장점이 있습니다. 예를 들어, 다른 골수 샘플은 MK에서 전혈소판의 동적 확장을 연구하기 위해 Guinard et al.이 컬렉션에 제시된 골수 이식 기술에 사용될 수 있습니다. 이 방법의 강점은 BM에서 발생한 MK를 사용하여 배양 중 세포 분화의 인공물로 인한 잠재적인 오해를 피하는 데 있습니다. 실제로, 이것은 이전에 MK 제한 MYH9 비활성화가 있는 마우스에서 문서화되었으며, 시험관 내 및 생체 외⁷에서 다양한 결과가 발견되었습니다. 저자는 또한 이 접근 방식의 단순하고 재현 가능하며 빠른 특성을 강조합니다. 그들의 프로토콜의 흥미로운 점은 내비게이션 소프트웨어가 장착된 현미경을 사용하여 전혈소판을 확장하는 MK의 추적/정량화를 용이하게 하는 기능입니다. 외식편 모델의 보완적인 방법은 마우스 두개골에 있는 MK의 2광자 이미징입니다. 이 기술의 독창성은 골수에서 형광 표지된 MK의 동적 거동을 생체 내에서 연구하고 전혈소판 확장을 시각화할 수 있는 능력입니다. 이 프로토콜은 제한된 외과적 개입으로 최소 침습적이므로 전혈소판 형성에 영향을 미치는 것으로 보고된 염증 반응을 피할 수 있다는 장점이 있습니다. Bornert et al. 이 방법의 한 가지 한계는 뼈의 밀도로 인해 이미지화할 수 있는 깊이가 좁다는 것이며, 이는 또한 젊은 쥐를 사용해야 한다는 것입니다. 이 기술은 생체 내 혈소판 형성에서 관심 유전자의 역할을 연구하기 위해 유전자 변형 마우스에 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 저자는 이 기술을 사용하여 전혈소판의 신장에서 미세소관의 역할이 시험관 내 조건과 생체 내 조건 간에 다르다는 것을 입증했습니다⁸.

비정상적인 MK 발달과 혈소판 생산은 혈소판 감소증 또는 혈소판증가증으로 이어져 각각 출혈 또는 혈전증의 위험을 증가시킬 수 있습니다. 혈소판 생물 발생을 지배하는 분자 메커니즘을 해부하려는 지속적인 노력은 혈소판 감소증 및 혈소판증가증 치료를 위한 새로운 전략을 개발할 수 있는 역량을 향상시킬 것입니다. 수혈 연구 분야에서 이러한 노력은 선택된 상황에서 수혈 대안으로 배양 혈소판을 생산하는 토대를 마련할 것입니다⁹.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), 유럽 지역 개발 기금 (ERDF)을 통해 유럽 연합 (EU)의 지원을 받았으며 Grant ANR-17-CE14-Megaplatprod to H.d.S 및 ANR-18-CE14-PlatForMechanics to C.L.의 지원을 받았습니다.

참고문헌

Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

Megakaryocyte Differentiation Platelet Formation CD34+ Cells Mouse Megakaryocyte Progenitors 3D Methylcellulose-based Hydrogel Cell Maturation Murine Megakaryopoiesis Transmission Electron Microscopy Proplatelet Formation Dynamics Two-photon Imaging Bone Marrow Explants