이 논문은 I/R 개발 및 치료를 더 잘 이해하기 위해 척추 바늘 사용자 지정 후크를 사용하여 3 일 간의 병아리 배아에서 허혈 재관류 (I/R) 모델링을 설명합니다. 이 모델은 간단하고 빠르며 저렴합니다.
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방법 논문
3일간의 병아리 배아를 이용한 후크 허혈-재관류 모델의 생성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
심근 경색, 뇌졸중 및 말초 혈관 질환과 같은 허혈 및 재관류 (I /R) 장애는 질병과 사망의 주요 원인 중 일부입니다. 많은 시험관 및 생체 내 모델은 현재 질병 또는 손상된 조직에서 I/R 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 그러나, 현재까지 , Ovo I/R 모델에서 보고 되었습니다., I/R 메커니즘및 빠른 약물 스크리닝의 더 나은 이해를 허용 할 것 이다. 이 논문은 I/R 개발 및 치료 메커니즘을 이해하기 위해 3일 병아리 배아에서 척추 바늘 사용자 지정 후크를 사용하여 I/R 모델링을 설명합니다. 우리의 모형은 DNA, RNA 및 단백질 수준에 이상을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 간단하고 빠르며 저렴합니다. 현재 모델은 독립적으로 또는 기존 시험관 내 및 생체 내 I/R 모델과 함께 사용할 수 있습니다.
서론
허혈 -재관 류 조직 부상은 심장 마비, 허혈성 뇌졸중, 외상 및 말초 혈관 질환을 포함한 여러 병리학에 연결되었습니다1,2,3,4,5. 이것은 주로 질병 진행의 포괄적인 이해의 부족 및 효과적인 연구 모형의 부족 때문입니다. 허혈성 상해는 조직의 특정 지역에 혈액 공급이 끊어질 때 생깁니다. 그 결과, 허혈성 조직은 결국 괴사, 속도는 조직에 따라 달라 집니다. 따라서 혈액 공급을 복원하면 손상을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 어떤 경우에는, 그 재관류는 혼자 허혈보다 더 많은 조직 손상을 일으키는 것이 관찰되었습니다6,7,8. 따라서, 허혈-재퍼퓨전의 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것은 효과적인 치료 적 개입을 개발하는 데 필요하다. 현재 I/R 부상에 대한 효과적인 치료법은 알려져 있지 않습니다. 이러한 차이로 인해 시험관 내부터 생체 내 모델에 이르는 새로운 실험 모델이 생성되어 기존 문제를 해결했습니다9,10,11,12,13.
병아리 배아 (갈루스 갈루스 국내)는 접근의 용이성, 윤리적 수용성, 상대적으로 큰 크기 (다른 배아에 비해), 저렴한 비용 및 급속한 성장14 때문에 연구에 널리 사용됩니다. 우리는 개발의 72 h에서 병아리 배아를 사용하여 척추 바늘의 도움으로 올바른 비텔린 동맥을 가리고 방출하여 오보 I / R에서 병아리 배아를 만들었습니다. 우리는 후크 I / R 허혈 재관전 모델 (그림 1)을 명명했습니다. 이 연구에서 활용되는 모델은 I/R 손상15,16,17과 자주 연관되는 산화 및 염증 경로를 포함한 모든 다운스트림 프로세스를 정확하게 시뮬레이션할 수 있습니다.
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프로토콜
에라의 Lucknow 의과 대학 및 병원의 기관 동물 윤리위원회는 동물 실험의 통제 및 감독위원회 (CPCSEA)에 따라 이러한 실험을 수행하기 위해 공식적인 승인이 필요하지 않다는 서면 면제를 발표했다. 그러나, 표준 수술 절차는 배아 고통에 대한 가능성을 최소화하기 위해 따랐다.
1. 버퍼 준비 (표 1)
- 링거의 솔루션 준비
- 링거의 용액을 준비하기 위해, NaCl (123 mM), 0.017 g의 CaCl2 (1.53 mM), 0.037 g의 KCl (4.96 mM)의 70 mL의 멸균 증류 H2O, 최종 볼륨 100mL를 용해하십시오. pH를 7.4로 조정합니다. 완전히 녹이고 오토클레이브를 제거하십시오. 그런 다음 0.22 μm 필터를 통해 필터를 만들고, 알리쿼트를 일회용 양(약 10mL)으로 필터링하고 실온에서 보관합니다.
- 일반 식염수(염화나트륨 0.9%, NaCl)를 준비합니다.
- 멸균 증류 H2O의 70mL에서, NaCl (154 mM)의 0.9 g를 용해. 볼륨을 100mL로 구성합니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브. 필요한 경우 pH를 0.1 N HCl 또는 0.1 N NaOH로 7.4로 조정합니다. 15mL 멸균 원심분리기 튜브에 10mL 알리코트를 만들고 실온에서 보관하십시오.
- 70% 에탄올(v/v)을 준비합니다.
- 70mL의 순수 에탄올(Mol. 46.07 g/L)을 멸균 H2O의 30mL에 혼합하십시오. 살균할 필요가 없습니다.
- 1x 인산염 버퍼 식염수(1배 PBS)를 준비한다.
- Na2HPO4,7H2O(5.37mM), 나Cl 0.8g(136.8mM), KCl 0.2g(26.8mM), KH2PO4(14. 6mMM) 0.2g(14. 6mM)을 70m에 추가하여 1x PBS 100mL를 준비한다. 121°C에서 15분 동안 100mL및 오토클레이브로 부피를 용해하고 구성한다. pH를 7.4로 가져와 필요한 경우 0.1 N HCl 또는 0.1 N NaOH의 몇 방울을 추가합니다. 15mL 멸균 원심분리기 튜브에 10mL의 알리쿼트를 만들고 실온에서 보관하십시오.
2. 1일차
- 계란 살균에 필요한 모든 도구 (70 % 에탄올, 청소 물티슈, 계란 랙 및 OHP 마커)를 정렬합니다.
- 티슈 페이퍼 와이프를 사용하여 70% 에탄올로 0일 계란을 청소하십시오. 오래된 계란이 태아를 초래하지 않을 수 있기 때문에 0 일 계란만 사용하십시오.
- OHP 마커로 계란에 현재 날짜를 적는다.
- 계란을 36-37°C의 온도와 습도 수준 인 60%-65%로 설정한 계란 인큐베이터에 놓습니다. 다음 24 시간 동안 계란을 배양하십시오.
3. 2일차
- 알부민(날카로운 가장자리 가위, 5mL 주사기, 18G 바늘, 주사기 폐기기 및 접착제 테이프)의 철수에 필요한 장비를 준비합니다.
- 70% 에탄올로 수술 가위를 닦거나 70%의 에탄올로 닦은 후 오토클레이브를 사용하여 살균하십시오.
- 이제 층면에 대한 37 °C 계란 인큐베이터에서 계란을 가져 가라.
- 깨끗한 달걀 랙에 달걀을 놓습니다.
- 달걀 가장자리에 작은 점착 테이프(크기: 약 1인치 길이 x 너비)를 부착합니다.
- 날카로운 모서리 가위를 사용하여 달걀 껍질 가장자리에 작은 구멍을 만듭니다. 대략 75°의 각도로 5mL 주사기를 삽입합니다.
참고: 5mL 주사기는 24 G x 1 바늘(멸균)과 함께 제공되지만 24 G x 1 바늘을 18 G x 1.5 바늘(멸균)으로 교체하는 것이 좋습니다. 18 G x 1.5 바늘은 폭 1.25 x 38mm입니다. 따라서 알부민 제거를 용이하게 한다. - 노른자 낭에 바늘을 삽입 한 후 천천히 알부민의 5-6 mL을 철회하십시오.
참고 : 이것은 자라날 수있는 침대를 배아를 제공합니다. 알부민을 인출하면 창을 설정하는 동안 알부민의 오버유출을 방지할 수 있습니다. 마지막으로, 창가 도중 손상되는 태아의 리스크는 알부민의 5-6 mL를 제거하여 완화됩니다. - 알부민을 제거한 후 접착제 테이프로 개구부를 다시 밀봉하고 계란을 37°C에서 48h로 배양하도록 둡니다.
4. 4일차
- 프로토콜의 섹션 1에 설명된 대로 링어의 솔루션, 0.9% 일반 식염수 및 1x PBS를 준비합니다. 그런 다음 세 가지 솔루션을 자동 복제합니다. 오토클레이브를 마친 후 각 용액을 실온에 놓습니다.
- 37°C 계란 인큐베이터에서 계란을 꺼내 서 서 서 모양으로 껍질을 잘라. 달걀 껍질을 절단하기 전에 접착제 테이프로 절단 할 영역을 덮습니다.
참고: 점착 테이프로 창 영역을 덮면 달걀 껍질이 원하는 곳으로 파기되는 것을 방지할 수 있습니다. 그러나 원치 않는 장소에 침입하면 접착제 테이프로 해당 영역을 밀봉하십시오. 접착제 테이프로 절단 할 장소를 덮면 쉘 조각이 노른자 낭에 떨어지는 것을 방지할 수 있습니다. - 창이 원하는 위치에 날카롭게 뾰족한 가장자리 가위로 달걀 껍질에 작은 구멍을 만들고 원형 개구부를 자르기 시작합니다. 이 프로세스를 창이라고 합니다.
참고: 원형 절단이 어떤 방향에서든 배아에 쉽게 접근할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오. 필요한 경우, 배아의 위치를 수용하기 위해 계란 위치를 변경합니다. - 다음으로, 스테레오 줌 수술 현미경을 사용하여 올바른 비텔린 동맥 (RVA)을 찾습니다.
참고: 닭 배아는 일반적으로 흉부 비틀림 (자궁 경부 굴곡 등과 함께)을 거치므로 머리의 왼쪽이 72 h 단계에서 노른자를 상대합니다. 더 caudally, 어디 vitelline 동맥 시체를 종료, 배아 는 많은 왜곡 되지 않습니다., 그리고 신체의이 부분은 노 른 자를 향해 아래로 복부 측면 거짓말. 그래서, 직접 보는, 태아의 권리는 연구원의 오른쪽에 있습니다. - RVA가 위치한 후에는 26G 바늘을 사용하여 RVA의 왼쪽 및 오른쪽에 두 개의 작은 구멍을 만듭니다(도 2).
- RVA 위에 도플러 혈류 영상 프로브를 놓습니다. 도플러 혈류 이미징 프로브가 허혈 부위에서 1mm ± 5± 배치되어 RVA의 단부 끝으로 배치되도록 하십시오. 플럭스 판독값을 2분 30초(또는 원하는 경우 더 길게)합니다. 이것은 노목 단계 판독이 될 것입니다.
- 한편, 코 펜치와 이빨이 있는 집게를 사용하여 척추 바늘의 가장자리를 후크 모양으로 수동으로 성형합니다(그림 3). 약 1mm 에 대한 척추 바늘의 가장자리를 구부려이 작업을 수행합니다. 크기가 클수록 I/R 시술 중에 척추 바늘을 삽입하고 제거하는 것이 더 어려워집니다.
- 미세 조작기를 사용하여 오른쪽 진동 동맥 바로 아래에 척추 바늘을 삽입합니다.
참고: RVA 또는 인접한 동맥을 손상시키지 않도록 척추 바늘을 극도로 주의 깊게 삽입하십시오. 최적의 기술은 RVA 구멍의 오른쪽 바로 위에 정확하게 척추 바늘의 사용자 정의 후크를 조정하고, 점차적으로 오른쪽 구멍을 통해 스테레오 줌 수술 현미경의 지도하에 미세 조작기의 도움으로 노른자 낭에 척추 바늘의 사용자 정의 설계 가장자리를 삽입하는 것입니다. 척추 바늘의 후크가 노른자 낭에 들어가면 RVA 아래에 후크를 서서히 조정하여 가장자리가 왼쪽 구멍 아래에 정확하게 배치되도록합니다. 지금은 척추 바늘을 들어 올릴 때입니다. - 이제 미세 조작기의 도움으로 도플러 혈류 플럭스까지 동맥을 점차적으로 들어 올려 동맥 흐름이 80 %의 최소 감소를 나타냅니다.
- 도플러 플럭스에서 80% 이상 하락한 후 척추 바늘을 들어 올려 서 5분 동안 방치하십시오. 이것은 RVA에 있는 허혈의 기간이 될 것입니다.
참고: 허혈 기간 동안 도플러 플럭스를 모니터링하는 것이 중요합니다. 상당한 양의 변동이 발견되면 테스트를 종료합니다. - 5 분 허혈 기간 후, 점차적으로 정상적인 혈류 수준을 복원하는 동맥을 해제. 도플러 혈전 판독값이 노목시 동안 획득한 것과 비교할 수 있는 값을 표시하도록 합니다. 이것은 RVA에서 재관전 기간이 될 것입니다 (그림 4).
- I/R 시술 후, 1x PBS의 몇 방울(2-3)을 배아에 적용하고 2-3분 동안 시청하십시오.
참고: 1x PBS를 사용하면 배아가 건조되는 것을 방지할 수 있습니다. - 마지막으로, 접착제 테이프로 창을 다시 밀봉하고 달걀을 5 시간 및 55 분 동안 계란 인큐베이터에 다시 놓습니다.
- 5 시간 55 분 후, 계란 인큐베이터에서 계란을 가지고 계란 랙에 놓고 창을 다시 열고 다운 스트림 치료 프로토콜을 따르십시오.
5. 트리트먼트
- 약물, 활성제 또는 억제제를 가진 동맥의 치료를 위해 I / R 프로세스의 1 시간 후에 RVA를 소비합니다.
- 다운스트림 연구의 경우 먼저 멸균 90mm 페트리 접시에 배치하여 달걀 껍질에서 배아를 제거하십시오.
- 태아가 페트리 접시에 방출되면 스테레오 줌 수술 현미경의 지도 하에 안구 홍채를 사용하여 RVA를 소비하십시오.
- RVA의 절제 치수가 최대 15±(트렁크에서 탈단), 동맥 의 왼쪽과 오른쪽에 각각 5 ± 1mm, 트렁크쪽으로 1mm를 ±.
참고: 절제할 영역을 측정하기 위해 눈금자를 활용할 수 있습니다(선택 사항). - RVA를 절제한 후 1x PBS가 함유된 멸균 페트리 접시에 1배 PBS로 세척합니다.
- 원하는 트리트먼트를 위해 링거 용액 500μL로 채워진 1.5mL 원심분리기 튜브(살균)에 동맥을 배치합니다. 원심분리기 튜브에 RVA를 놓고 37°C 인큐베이터에 5시간 55분 간 배치합니다.
참고: 치료에 따라, 어떤 치료 없이 링거의 솔루션을 사용 하 여, 또는 원하는 볼륨 및 약물의 농도 치료, 활성제, 또는 억제제. - 5시간 55분 의 배양 후 37°C 실험실 인큐베이터로부터 RVA를 꺼내 원하는 치료법을 진행한다.
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결과
도플러 혈류 이미징 기술은 모델의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. 요컨대, 우리는 우리의 창조의 성공을 결정하기 위해 RVA 그룹의 데이터와 제어 그룹의 데이터를 비교. 도 4A 는 대조군 동물과 관련된 일반적인 플럭스를 묘사하고 , 도 4B 는 RVA로부터 얻은 결과를 묘사한다. 숫자 1-8은 I/R 단계와 관련된 다양한 이벤트를 나타냅니다. 간단히 말해서, 숫자 1-3은 노목증의 단계에 해당하며, 3점과 4점에서 유동량이 급격히 감소하는 것은 RVA의 혈류 감소와 관련된 사건을 나타낸다. 80% 이상의 드롭다운이 달성되면, RVA는 다음 5분 동안 제기되었습니다. 이것은 허혈의 단계 (숫자 4-5)였다. RVA의 5 분 리프팅 후, RVA는 숫자 6과 7로 표시됩니다 출시되었다. 7번 지점에서 플럭스는 RVA가 정상적인 혈류 수준을 달성한 후 발생하는 재관류 단계를 나타내며, 이는 재관류의 단계였다. 이 특별한 실험...
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토론
허혈 재퍼퓨전 연구의 목표는 세포 사멸을 방지하고 회복을 촉진하는 치료 전략을 만드는 것입니다29,30. I/R 연구에서 현재의 제약을 극복하기 위해 Hook I/R 병아리 배아 모델을 설계하여 신뢰할 수 있고 재현 가능한 I/R 모델을 생성했습니다. 우리의 지식에, 우리의 것은 이제까지 일상적인 I/R 실험을 위한 3 일 병아리 태아에서 만든 첫번째 I/R 모형입니다, 스트레스 신호를 공부하는 외에 (예를 들면, 산화 및 선동적인 긴장). 개발 3일째의 크기와 접근성의 이점을 감안할 때, 병아리 배아는 모델의 높은 출력, 채용 단순성 및 일상적인 분석에 대한 적응성 때문에 72h의 발달 단계에서 사용되었습니다. 간단히 말해서, 발달 3일째에, 오보 병아리는 일반적인 생리학, 질병 병리학 및 실험적인 처리의 효력을 시각화하는...
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공개 사항
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 비디오 그래피와 편집 중에 그의 중요한 입력에 대한 하리 샨카르에 대한 감사를 표현하고 싶습니다, 음성 해설에 대한 씨 Baqer 후세인, 비디오 촬영을위한 씨 아슈가르 리즈비, 비디오 촬영을위한 씨 모하마드 하이더, 씨 모하마드 덴마크 시디키 실험 하는 동안 도움을.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (-80° C) 냉동고 | Haier, | China-1.5mL | |
| 원심분리기 튜브 | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G× 1.5 (1.25&회; 38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL 주사기 | DISPO VAN-26G | ||
| 바늘 (26G× 1/2 (10.45x13mm) | DISPO 밴, 인도 | 30722D | |
| 37° C 계란 인큐베이터 조절 가능한 백분율 습도 | Gentek, India | GL-100 | |
| 37° C 실험실 인큐베이터 | SCIENCE TECH, 인도 | CB 101-14 | |
| 3-메틸아데닌(3-MA) | Sigma Aldrich, 미국 | M9281 | |
| 3mL 목초지 피펫 | TARSONS, 인도 | 940050 | |
| 50mL 비커 | TARSONS, 인도 | - | |
| 5mL 주사기 | DISPO VAN, 인도 | IP53 | |
| 70% 에탄올 | Merck Millipore, 미국 | 64-17-5 | |
| 접착 테이프 / 첼로 테이프 | Sunrise, | India-Ambra1 | |
| 프라이머 | Applied Biosystems, 포스터 시티, 미국 | Hs00387943_m1 | |
| 안티 마우스 IgG | 세포 신호 기술, 미국 | 7076S | |
| 안티 토끼 IgG | 잭슨 면역 연구소, 미국 | 711-035-152 | |
| Atg7 | R & D Systems, 미국 | MAB6608 | |
| Atg7 프라이머 | Applied Biosystems, 포스터 시티, 미국 | Hs00893766_m1 | |
| 오토클레이브 백 | Tarsons, 인도 | 550022 | |
| 오토클레이브 기계 | 현지 제작, 러크나우, 인도 | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, 미국 | 66665-1-IG | |
| 베타 액틴 | 면역태그, 미국 | ITT07018 | |
| 소 혈청 알부민 Himedia | , 뭄바이, 인도 | TC194 | |
| 염화칼슘 | Himedia, 뭄바이, 인도 | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, 미국 | ITT5155 | |
| 청소용 물티슈 | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, 미국 | ITT07022 | |
| 디소듐 인산수소 헵타하이드레이트 | Himedia, 인도 뭄바이 | GRM39611 | |
| 도플러 혈류계 | 무어 기기, 영국 | moorVMS-LDF1 | |
| 계란 선반 | - | ||
| 계란 선반 | - | ||
| GAPDH | ImmunoTag, 미국 | M1000110 | |
| GAPDH 프라이머 | Applied Biosystems, 포스터 시티, 미국 | ||
| Glycine | Himedia, 인도 뭄바이 | MB013 | |
| 신장 트레이 | HOSPITO-LC3A | ||
| /B | 세포 신호 기술, 미국 | 4108S | |
| 메탄올 | Rankem 연구소, 인도 뭄바이 | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, 일본 | M-152 | |
| N-아세틸-L-시스테인 (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, 미국 | ITT07438 | |
| 코 플라이어 | 현지 제작, Lucknow, | India-Ocular | |
| Forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP 마커 펜 | Camlin, | ||
| ImmunoTag, 미국 | ITT08329 | ||
| 뾰족한 날카로운 모서리 가위 | Stoelting, 독일 | 52132-11 | |
| 염화칼 | Himedia, 뭄바이, 인도 | MB043 | |
| 인산칼륨 일염기성 무수 | Himedia, 뭄바이, 인도 | MB050 | |
| 프로테아제 억제제 | Abcam, 미국 | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, 미국 | ITT4364 | |
| 염화나트륨 | Fisher Scientific, 인도 뭄바이 | 27605 | |
| 황산나트륨 | Himedia, 인도 뭄바이 | GRM886 | |
| 척추 바늘 25GA; 3.50IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| 스테레오 줌 수술용 현미경 | Olympus, 일본 | SZ2-STU3 | |
| 주사기 폐기기 | BIOHAZARD | 882210 | |
| 톱니집게 | Stoelting, 독일 | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, 미국 | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, 인도 뭄바이 | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, 미국 | RC1227 | |
| 화이트 레그혼 치킨 0일 달걀 | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, 미국 | FK009 |
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