Method Article

3일간의 병아리 배아를 이용한 후크 허혈-재관류 모델의 생성

DOI:

10.3791/63288

⸱

February 19th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Restorative Neurology, Department of Biotechnology, Era’s Lucknow Medical College Hospital, Era University, 2Era University, 3Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Era University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 I/R 개발 및 치료를 더 잘 이해하기 위해 척추 바늘 사용자 지정 후크를 사용하여 3 일 간의 병아리 배아에서 허혈 재관류 (I/R) 모델링을 설명합니다. 이 모델은 간단하고 빠르며 저렴합니다.

Abstract

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심근 경색, 뇌졸중 및 말초 혈관 질환과 같은 허혈 및 재관류 (I /R) 장애는 질병과 사망의 주요 원인 중 일부입니다. 많은 시험관 및 생체 내 모델은 현재 질병 또는 손상된 조직에서 I/R 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 그러나, 현재까지 , Ovo I/R 모델에서 보고 되었습니다., I/R 메커니즘및 빠른 약물 스크리닝의 더 나은 이해를 허용 할 것 이다. 이 논문은 I/R 개발 및 치료 메커니즘을 이해하기 위해 3일 병아리 배아에서 척추 바늘 사용자 지정 후크를 사용하여 I/R 모델링을 설명합니다. 우리의 모형은 DNA, RNA 및 단백질 수준에 이상을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 간단하고 빠르며 저렴합니다. 현재 모델은 독립적으로 또는 기존 시험관 내 및 생체 내 I/R 모델과 함께 사용할 수 있습니다.

Introduction

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허혈 -재관 류 조직 부상은 심장 마비, 허혈성 뇌졸중, 외상 및 말초 혈관 질환을 포함한 여러 병리학에 연결되었습니다1,2,3,4,5. 이것은 주로 질병 진행의 포괄적인 이해의 부족 및 효과적인 연구 모형의 부족 때문입니다. 허혈성 상해는 조직의 특정 지역에 혈액 공급이 끊어질 때 생깁니다. 그 결과, 허혈성 조직은 결국 괴사, 속도는 조직에 따라 달라 집니다. 따라서 혈액 공급을 복원하면 손상을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 어떤 경우에는, 그 재관류는 혼자 허혈보다 더 많은 조직 손상을 일으키는 것이 관찰되었습니다6,7,8. 따라서, 허혈-재퍼퓨전의 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것은 효과적인 치료 적 개입을 개발하는 데 필요하다. 현재 I/R 부상에 대한 효과적인 치료법은 알려져 있지 않습니다. 이러한 차이로 인....

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Protocol

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에라의 Lucknow 의과 대학 및 병원의 기관 동물 윤리위원회는 동물 실험의 통제 및 감독위원회 (CPCSEA)에 따라 이러한 실험을 수행하기 위해 공식적인 승인이 필요하지 않다는 서면 면제를 발표했다. 그러나, 표준 수술 절차는 배아 고통에 대한 가능성을 최소화하기 위해 따랐다.

1. 버퍼 준비 (표 1)

  1. 링거의 솔루션 준비
    1. 링거의 용액을 준비하기 위해, NaCl (123 mM), 0.017 g의 CaCl2 (1.53 mM), 0.037 g의 KCl (4.96 mM)의 70 mL의 멸균 증류 H2O, 최종 볼륨 100mL를 용해하십시오. pH를 7.4로 조정합니다. 완전히 녹이고 오토클레이브를 제거하십시오. 그런 다음 0.22 μm 필터를 통해 필터를 만들고, 알리쿼트를 일회용 양(약 10mL)으로 필터링하고 실온에서 보관합니다.
  2. 일반 식염수(염화나트륨 0.9%, NaCl)를 준비합니다.
    1. 멸균 증류 H2O의 70mL에서, NaCl (154 mM)의 0.9 g를 용해. 볼륨을 100mL로 구성합니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브. 필요한 경우 pH를....

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Results

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도플러 혈류 이미징 기술은 모델의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다. 요컨대, 우리는 우리의 창조의 성공을 결정하기 위해 RVA 그룹의 데이터와 제어 그룹의 데이터를 비교. 도 4A 는 대조군 동물과 관련된 일반적인 플럭스를 묘사하고 , 도 4B 는 RVA로부터 얻은 결과를 묘사한다. 숫자 1-8은 I/R 단계와 관련된 다양한 이벤트를 나타냅니다. 간단히 말해서, 숫자 1-3은 노목증의 단계에 해당하며, 3점과 4점에서 유동량이 급격히 감소하는 것은 RVA의 혈류 감소와 관련된 사건을 나타낸다. 80% 이상의 드롭다운이 달성되면, RVA는 다음 5분 동안 제기되었습니다. 이것은 허혈의 단계 (숫자 4-5)였다. RVA의 5 분 리프팅 후, RVA는 숫자 6과 7로 표시됩니다 출시되었다. 7번 지점에서 플럭스는 RVA가 정상적인 혈류 수준을 달성한 후 발생하는 재관류 단계를 나타내며, 이는 재관류의 단계였다. 이 특별한 실험.......

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Discussion

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허혈 재퍼퓨전 연구의 목표는 세포 사멸을 방지하고 회복을 촉진하는 치료 전략을 만드는 것입니다29,30. I/R 연구에서 현재의 제약을 극복하기 위해 Hook I/R 병아리 배아 모델을 설계하여 신뢰할 수 있고 재현 가능한 I/R 모델을 생성했습니다. 우리의 지식에, 우리의 것은 이제까지 일상적인 I/R 실험을 위한 3 일 병아리 태아에서 만든 첫번째 I/R 모형입니다, 스트레스 신호를 공부하는 외에 (예를 들면, 산화 및 선동적인 긴장). 개발 3일째의 크기와 접근성의 이점을 감안할 때, 병아리 배아는 모델의 높은 출력, 채용 단순성 및 일상적인 분석에 대한 적응성 때문에 72h의 발달 단계에서 사용되었습니다. 간단히 말해서, 발달 3일째에, 오보 병아리는 일반적인 생리학, 질병 병리학 및 실험적인 처리의 효력을 시각화하는.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 비디오 그래피와 편집 중에 그의 중요한 입력에 대한 하리 샨카르에 대한 감사를 표현하고 싶습니다, 음성 해설에 대한 씨 Baqer 후세인, 비디오 촬영을위한 씨 아슈가르 리즈비, 비디오 촬영을위한 씨 모하마드 하이더, 씨 모하마드 덴마크 시디키 실험 하는 동안 도움을.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(-80° C) 냉동고Haier,China-1.5mL
원심분리기 튜브TARSONS, India500010X
100mm Petri dish (sterile)Tarsons, India460050
18G Needle (18G× 1.5 (1.25&회; 38mm)Ramsons, India13990
1mL 주사기DISPO VAN-26G
바늘 (26G× 1/2 (10.45x13mm)DISPO 밴, 인도30722D
37° C 계란 인큐베이터 조절 가능한 백분율 습도Gentek, IndiaGL-100
37° C 실험실 인큐베이터SCIENCE TECH, 인도CB 101-14
3-메틸아데닌(3-MA)Sigma Aldrich, 미국M9281
3mL 목초지 피펫TARSONS, 인도940050
50mL 비커TARSONS, 인도-
5mL 주사기DISPO VAN, 인도IP53
70% 에탄올Merck Millipore, 미국64-17-5
접착 테이프 / 첼로 테이프Sunrise,India-Ambra1
프라이머Applied Biosystems, 포스터 시티, 미국Hs00387943_m1
안티 마우스 IgG세포 신호 기술, 미국7076S
안티 토끼 IgG잭슨 면역 연구소, 미국711-035-152
Atg7R & D Systems, 미국MAB6608
Atg7 프라이머Applied Biosystems, 포스터 시티, 미국Hs00893766_m1
오토클레이브 백Tarsons, 인도550022
오토클레이브 기계현지 제작, 러크나우, 인도-
Beclin-1Proteintech, 미국66665-1-IG
베타 액틴면역태그, 미국ITT07018
소 혈청 알부민 Himedia, 뭄바이, 인도TC194
염화칼슘Himedia, 뭄바이, 인도GRM534
CatalaseImmunoTag, 미국ITT5155
청소용 물티슈Kimberly-Clark, India370080
Cleaved Caspase3ImmunoTag, 미국ITT07022
디소듐 인산수소 헵타하이드레이트Himedia, 인도 뭄바이GRM39611
도플러 혈류계무어 기기, 영국moorVMS-LDF1
계란 선반-
계란 선반-
GAPDHImmunoTag, 미국M1000110
GAPDH 프라이머Applied Biosystems, 포스터 시티, 미국
GlycineHimedia, 인도 뭄바이MB013
신장 트레이HOSPITO-LC3A
/B세포 신호 기술, 미국4108S
메탄올Rankem 연구소, 인도 뭄바이M0252
MicromanipulatorNarishige, 일본M-152
N-아세틸-L-시스테인 (NAC)Sigma Aldrich, USAA7250
NaringeninSigma Aldrich, USA67604-48-2
NF-kβThermo Fisher Scientific, 미국51-0500
NLRP3ImmunoTag, 미국ITT07438
코 플라이어현지 제작, Lucknow,India-Ocular
ForcepsStoelting, Germany52106-40
Ocular irisTufft Surgical Instruments, Jaipur, IndiaHard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8"
OHP 마커 펜Camlin,
ImmunoTag, 미국ITT08329
뾰족한 날카로운 모서리 가위Stoelting, 독일52132-11
염화칼Himedia, 뭄바이, 인도MB043
인산칼륨 일염기성 무수Himedia, 뭄바이, 인도MB050
프로테아제 억제제Abcam, 미국Ab65621
SOD-1ImmunoTag, 미국ITT4364
염화나트륨Fisher Scientific, 인도 뭄바이27605
황산나트륨Himedia, 인도 뭄바이GRM886
척추 바늘 25GA; 3.50IN (90.51 X 90mm)Ramson, IndiaGS-2029
스테레오 줌 수술용 현미경Olympus, 일본SZ2-STU3
주사기 폐기기BIOHAZARD882210
톱니집게Stoelting, 독일52102-30
Tris BaseG Biosciences, 미국RC1217
Tris Hydrochloric AcidHimedia, 인도 뭄바이MB030
Tween 20G Biosciences, 미국RC1227
화이트 레그혼 치킨 0일 달걀--
Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMKMP Biomedicals, LLC, 미국FK009
Hs02758991_g1 India-ORP-150 륨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fauzia, E., et al. Chick Embryo: A Preclinical Model for Understanding Ischemia-Reperfusion Mechanism. Frontiers in Pharmacology. 21 (9), 1034(2018).
  2. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nature Med....

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