방법 논문

원발성 섬모 운동장애의 일선 진단을 위한 고속 비디오 현미경 분석

DOI:

10.3791/63292

⸱

2022년 1월 19일

 ,  ,  , 
1Allergy Centre, Tampere University Hospital, 2Department of Pediatrics, Turku University Hospital, 3Turku Bioscience Center, University of Turku and Åbo Akademi University

이 논문에서

요약

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고속 비디오 현미경 분석은 비교적 수행하기 쉽고 빠르며 비용 효율적이며 숙련 된 손에는 원발성 섬모 운동 장애의 첫 번째 라인 진단을위한 상당히 신뢰할 수있는 도구로, 진단 및 중증 폐 질환 치료와 관련된 모든 센터에서 사용할 수 있어야합니다.

초록

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원발성 섬모 운동 장애 (PCD)는 상염색체 열성 특성에서 주로 유전되는 선천성 장애입니다. 이 장애는 섬모의 움직임에 장애를 일으켜 점액 정리 (MCC)의 심각한 손상을 일으 킵니다. 진단되지 않았거나 너무 늦게 진단되면 기관지 확장증이 발생하고 나중에 폐에 심각한 손상을 입힐 수 있습니다. PCD를 진단하는 대부분의 방법은 시간이 많이 걸리고 이를 확립하기 위해 광범위한 경제적 자원이 필요합니다. 고속 비디오 현미경 분석 (HSVMA)은 체외에서 섬모를 때리는 살아있는 호흡기 세포를 시각화하고 분석하는 유일한 진단 도구입니다. 그것은 빠르고, 비용 효율적이며, 숙련 된 손에는 PCD의 진단 도구로 매우 신뢰할 수 있습니다. 또한, 투과 전자 현미경 (TEM)과 같은 고전적인 진단 조치는 형태 학적 변화가 없기 때문에 일부 돌연변이에는 적용되지 않습니다.

이 논문은 호흡기 상피 세포를 수집하는 과정, 표본의 추가 준비 및 HSVMA의 과정을 설명합니다. 우리는 또한 클리닉이 HSVMA를 수행 할 장비를 보유하지 않은 경우 저장 및 조사 장소로 이송하기 위해 영양 배지에 보관하여 브러시 된 세포를 무사히 유지하고 때리는 방법을 설명합니다. 또한 TEM으로 진단 할 수없는 다인 팔 중쇄 11 유전자 (DNAH11)에 돌연변이가있는 환자의 병리학 적 박동 패턴을 가진 비디오가 표시됩니다. 상기도의 감염으로 인한 결정적이지 않은 HSVMA의 결과뿐만 아니라 적혈구의 중첩으로 실패한 칫솔질. 이 기사를 통해 폐학 환자 및 희귀 폐 질환을 다루는 모든 부서가 PCD에 대한 일상적인 진단의 일환으로 HSVMA를 수행하거나 HSVMA 수행 전문 센터로 표본을 보내도록 권장하고자합니다.

서론

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원발성 섬모 운동 장애 (PCD)는 드물게 유전 적 유전 질환으로 섬모를 때리는 운동에 장애를 일으 킵니다. 진단되지 않으면 MCC의 심각한 손상으로 인해 나중 심각한 폐 손상을 일으 킵니다. 과거에는 유병률이 1 : 4,000에서 50,000 사이로 추정되었습니다. 꾸준히 진단이 개선되고 상태에 대한 인식이 높아짐에 따라 PCD의 보급에 대한 업데이트는 PCD가 훨씬 더 일반적이며 아마도 1,2 대신 1 : 4,000에서 20,000의 범위 일 수 있음을 시사합니다. 그러나 PCD 환자는 여전히 과소 진단되거나 너무 늦게 진단됩니다 1,3. 따라서 선천성 시투스 내성 및 / 또는 이종 택시 또는 주산기 비루, 신생아 호흡 곤란, 코 막힘 및 수유 장애가있는 유아는 PCD의 용의자가되어야합니다. 후기에는 만성 중이염, 재발 성 폐렴, 비부비동염 및 MCC 장애로 인한 만성적이고 전형적인 습식 기침이 기관지 확장증 및 폐 기능 장애와 함께 성인기까지 계속되는 PCD의 특징적인 증상입니다2.

PCD를 앓고있는 것으로 의심되는 환자는 다른 진단 도구를 사용하여 진단 할 수 있습니다. TEM은 과거에 일선 진단의 황금 표준으로 여겨져 왔습니다. 그러나 PCD 사례의 최대 30 %가 비정상적인 초음파 구조 1,3,4,5,6을 나타내지 않아 다른 진단 접근법을 요구합니다. 따라서 점점 더 많은 센터와 유럽 호흡기 학회 (ERS)의 지침에 따라 비강 산화 질소 (nNO)와 HSVMA의 조합이 1 차 진단1,7,9,10으로 제안됩니다. HSVMA 및 nNO는 또한 PCD11을 가진 환자를 식별하는 데 가장 비용 효율적인 옵션입니다. 그러나 유전자 검사가 진단에 포함되더라도 현재 100 % 확실성 8,9,10을 가진 PCD를 배제 할 수있는 독립형 검사 또는 검사 조합이 없다는 것을 명심해야합니다.

사용 가능한 진단 옵션 중 HSVMA는 살아있는 섬모 코팅 호흡 세포에 초점을 맞추고 섬모 비트 패턴 (CBP) 및 섬모 비트 빈도 (CBF)를 평가하는 유일한 검사입니다. TEM과 달리 HSVMA의 결과는 일반적으로 시험 당일에 신속하게 사용할 수 있지만 TEM 결과는 표본을 채취 한 후 몇 달 후에 도착할 수 있습니다. HSVMA는 모든 연령대에 적용 할 수 있지만 nNO는 높은 수준의 준수를 요구합니다. 5 세 미만으로 사용하려는 시도는 일반적으로 성공하지 못합니다10. 숙련 된 손에서 HSVMA는 PCD를 각각 100 % 및 96 % (12 %)로 진단하는 데 탁월한 민감도와 특이성을 가지고 있습니다.

이 논문은 코의 열등한 터비네이트로부터 섬모 코팅 호흡기 세포의 수확, 조사 부위로의 수송을 위한 세포 영양 배지에서 수확된 세포의 보존, CBF 및 CBP를 결정하기 위한 현미경 비디오 분석의 과정을 포함하여 HSVMA를 수행하기 위한 단계별 절차를 설명한다. 또한 환자의 일부 비디오 클립이 표시되어 정상 CBP 및 CBF를 비정상적인 섬모 기능 (비디오 3, 비디오 4, 비디오 5, 비디오 6, 비디오 7 및 비디오 8)과 비교합니다.

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프로토콜

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윤리 선언문:

이 연구는 지역 윤리위원회 (69 / 2017)의 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.

1. 호흡기 상피 세포의 수집 및 수송

  1. 솔 질
    1. 칫솔질하기 전에 환자에게 아목시실린-클라불란산을 경구 투여하여 섬모 기능을 방해하는 생물막을 박멸하십시오. 항생제가 절차 2 일 전에 종료되었는지 확인하십시오.
    2. 닦은 상피 세포 스트립에 점액 물질이 오버레이되는 것을 줄이려면 환자에게 코를 완전히 날려 버리도록 요청하십시오. 부모들에게 어린 자녀들이 코를 불 수 있도록 도와달라고 부탁한다.
    3. 칫솔질의 경우 0.6mm 크기의 치간 브러시를 사용하십시오 ( 재료 표 참조). 환자의 머리를 한 손으로 고정시키고 다른 한 손으로 양쪽 콧구멍의 열등한 터비네이트를 닦아 충분한 상피 세포 스트립을 수집하십시오.
      참고 : 치간 브러시를 열등한 잔디 아래에 깊이 삽입 할 때 약간의 저항이 일반적으로 발생합니다. 비강 칫솔질은 약 2 초 동안 빠른 회전과 따기로 수행됩니다. 길고 강렬한 칫솔질은 심한 상피 손상과 연속적인 상피 융기를 유발할 수 있습니다.
    4. 기관지 내시경 검사가 의심되는 PCD 이외의 이유로 계획된 경우, 카리나 또는 기관지 상피를 닦거나 생검13을 통해 기관지 내시경 검사 중에 샘플을 수집하십시오.
    5. 수확된 세포 스트립을 세포 영양 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)이 들어있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 떨어뜨린다.
      참고 : 상피 세포 스트립은 일반적으로 브러시를 튜브 벽에 던지고 돌려서 브러시를 더 쉽게 떨어 뜨립니다.
    6. 마이크로 원심분리 튜브의 뚜껑을 닫고 튜브를 광원에 대고 고정시킵니다. 튜브를 흔들어 수확 된 세포 스트립과 대기업을 발견하십시오.
  2. 표본의 수송
    1. 마이크로 원심분리 튜브를 단단히 닫힌 폴리스티렌 상자에 넣고 튜브의 뚜껑이 제대로 닫히고 튜브가 상자 내부에 고정되어 있는지 확인하십시오.
    2. 콜드 팩을 추가하십시오. 그러나 시편을 얼리지 마십시오.
      참고: 조사 전에 시편을 보존하기 위한 최적 온도는 약 4-8°C(39.2-46.4°F)입니다.
    3. 보존된 샘플이 다음 24시간 동안 분석되었는지 확인하십시오.
      참고 :이 실험에서 칫솔질과 HSVMA 사이의 평균 시간은 3 시간이었습니다.

2. 고속 비디오 현미경 분석 (HSVMA)

  1. 샘플의 비디오 현미경 검사
    1. 샘플을 함유하는 마이크로원심분리 튜브를 수용한 후, 이를 37°C(98.6°F)까지 가온하여 생체내 유사 환경에서 최적 의 모방한다.
    2. 현미경에 가열 장치가 장착되어 있으면 튜브를 후드 아래에 놓고 따뜻하게하십시오. 또는 인큐베이터를 사용하여 샘플을 예열하십시오.
    3. PC에서 카메라와 비디오 장치의 소프트웨어를 시작합니다.
    4. 피펫을 사용하여 소량의 샘플을 채취하여 큐벳이나 유리 바닥 접시에 두 방울을 넣으십시오 ( 재료 표 참조). 뚜껑으로 큐벳이나 접시를 덮고 현미경 아래에 놓습니다.
    5. 샘플 평가를 위해 냉광원이 장착된 차동 간섭 현미경과 고속(최소 200프레임/초)으로 녹화할 수 있는 비디오 카메라를 사용하십시오. 100x 배율의 오일 침지 렌즈를 사용하고 광학 표면에 침지 오일 한 방울을 넣으십시오.
      참고: 아래에서 렌즈가 접근하는 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.
    6. 현미경 렌즈로 접시 바닥에 접근하고 적혈구가없고 점액 함량이 낮은 세포 클러스터를 검색하십시오. 대표적인 관심 영역(ROI)을 찾은 후, 가장 큰 섬모 움직임으로 섬모를 때리는 특정 그룹에 초점을 맞추고 비디오 시퀀스를 녹화합니다. 옆구리와 위에서 박동하는 섬모로 세포를 기록하십시오. 그런 다음 다른 대표적인 세포 클러스터를 검색하고 기록을 반복하십시오.
      참고: 섬모 코팅 세포는 1,000x 배율로 조사해야 하며, 박동 섬모는 200/s 이상의 프레임 속도(이 프로토콜에서 256/s)로 설정된 디지털 고속 비디오(DHSV) 카메라로 기록해야 합니다. 녹화 된 비디오 클립에서 얻은 데이터는 하드 드라이브에 많은 공간이 필요하기 때문에 외장 SSD 하드 드라이브를 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 비디오 시퀀스 분석
    1. CBF 및 CBP를 확인하려면 비디오 클립을 프레임별로 다시 재생합니다.
    2. CBF를 결정하려면 프레임 속도를 15프레임/초로 슬로우 모션으로 설정하고 10개의 연속 비트를 계산합니다.
    3. 10 비트의 단일 사이클 동안 지나가는 프레임 수를 기록하고 결과를 Eq (1)에 삽입하십시오. 기록된 모든 섬모 박동 주기의 평균을 계산하여 빈도를 결정하고 그 결과를 연령에 대한 기준값과 비교한다( 표 1 참조)14.
      figure-protocol-1 (1)
      여기서 X는 10비트의 사이클 동안 지나가는 프레임의 수입니다.
    4. CBP를 평가하려면 박동 섬모의 움직임이 전체 범위( 그림 1 참조)이고 동기화되었는지 확인합니다. 두 개의 독립 운영자가 선택 편향을 방지하기 위해 CBP를 평가하도록 합니다.
    5. HSVMA 분석 결과가 PCD와 호환되거나, 가능성이 낮거나, 결정적이지 않도록 보고합니다.

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결과

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비디오 1 및 비디오 2는 CBF 및 CBP가 정상 범위에 있는 정상 제어를 보여줍니다(그림 1 참조). 비디오 3, 비디오 4, 비디오 5 및 비디오 6은 DNAH11 유전자에서 동형접합성 돌연변이를 갖는 PCD 환자의 두 사례를 나타낸다(c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. 이 대표적인 영상은 DNAH11 유전자의 돌연변이 표현형이 형태학적 변화 3,4,5의 부재로 인해 TEM에 의해 진단될 수 없기 때문에 주목할 만하기 때문에

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토론

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여기서, HSVMA를 이용한 PCD에 대한 진단 프로세스는 일차 진단에 비추어 설명되고 논의된다. 비교적 쉽게 수립할 수 있고, 비용 효율적이며(11), 숙련된 손(12)에서 신뢰할 수 있는 방법임에도 불구하고, HSVMA는 함정이 없는 진단 수단이 아니다. 비정상적인 CBF 및 CBP는 이차 감염으로 인해 기관지 호흡기 상피(15)의 염증을 유발할 수 있으며, 같은 이유로 흡연자는 비정상적인 박동 빈도(16,17)를 가질 수 있다. 또한, 낭포성 섬유증은 PCD의 진단을 확립하기 전에 배제되어야한다. 환자 샘플의 분석이 PCD와 호환되는 것으로 판단되기 전에 독립적으로 수집 된 두 개의 샘플로 비정상적인 결과를 확인해야하며 새로운 칫솔질과 CBF 및 CBP의 재분석이 필요합니다. 이것은 특히 어린...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 칫솔질에 대한 훌륭한 도움을 주신 소아과 간호사 Johanna Juvankoski 부인에게 특별한 감사를 표합니다. 우리는 또한 Heymut Omran 교수 (University Clinic Münster, UKM)에게 웹 사이트에서 정상적인 섬모 운동의 도식 그림을 사용할 수있는 권한을 부여한 것에 대해 특별한 감사를 표합니다. 마지막으로, 원고를 교정해 주신 PGCE의 Alan Brown BA (Hons) 씨에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Amoxiciline-clavulanic acidOrion Oyj40 mg/kg을 2회 용량/일로 나누고, 성인용 875/125 mg 1정 x2/일
카메라 소프트웨어HamamatsuHCI 이미지
보존 및 운송을 위한콜드 팩미
분 간섭 현미경Carl Zeiss반전, 세포 관찰 현미경
Digitial High 스피드 비디오 카메라HamamatsuOrca Flash 4.0, 디지털 카메라 유형 C11440
Dulbecco´ s Modified Eagle MediumThermo Fisher10565018기저 세포 배양 배지
Eppendorf 튜브Eppendorf301200861.5 mL 튜브
유리 바닥 마이크로웰 접시현미경 검사용MatTekP35G-1.5-14-C
가열 장치Carl Zeiss/PeCon810-450001Carl Zeiss 배양 엘리먼트 PeCon TempModule S1 온도 제어
치간 브러시 0.6 mmDoft872267재사용 가능한 핸들과 캡이 있는 긴 와이어에 달린 치간 브러시 지퍼백에 Objective
Carl Zeiss100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC 목적
뚜껑이 있는 작은 폴리스티렌 상자운송을 위해무엇이든
큐벳

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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