이 프로토콜은 절단 된 신경을 통해 형광 칼슘 염료를 마우스 운동 신경 말단에 로딩하는 방법을 설명합니다. 또한, 컨포칼 현미경을 사용하여 말초 신경 종말에서 빠른 칼슘 과도 현상을 기록하는 독특한 방법이 제시됩니다.
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방법 논문
Confocal 현미경을 사용한 높은 시간 분해능을 가진 마우스 신경근 접합부의 칼슘 과도 상태 등록
이 논문에서
요약
초록
시냅스 전 칼슘 수준의 추정은 시냅스 전 세포로의 칼슘 유입이 신경 전달 물질 방출로 이어지는 일련의 사건을 유발하기 때문에 시냅스 전달을 연구하는 핵심 작업입니다. 또한, 시냅스 전 칼슘 수준의 변화는 많은 세포 내 단백질의 활성을 매개하고 시냅스 가소성에 중요한 역할을합니다. 칼슘 신호 전달을 연구하는 것은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 방법을 찾는 데에도 중요합니다. 신경근 접합부는 한 가지 유형의 신경 전달 물질 만 가지고 있기 때문에 시냅스 가소성을 연구하는 데 적합한 모델입니다. 이 기사에서는 절단 된 신경 다발을 통해 칼슘에 민감한 염료를 마우스의 운동 신경 종말에 넣는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 기저 칼슘 수준 및 칼슘 과도 상태와 같은 세포 내 칼슘 변화와 관련된 모든 매개 변수를 추정 할 수 있습니다. 세포 외부에서 신경 말단으로 칼슘이 유입되고 칼슘에 민감한 염료에 대한 결합/결합 해제가 몇 밀리초 범위 내에서 발생하기 때문에 이러한 이벤트를 기록하려면 빠른 이미징 시스템이 필요합니다. 실제로 고속 카메라는 빠른 칼슘 변화를 등록하는 데 일반적으로 사용되지만 이미지 해상도 매개 변수가 낮습니다. 칼슘 과도 기록을 위해 여기에 제시된 프로토콜은 컨포칼 현미경이 제공하는 매우 우수한 공간-시간 분해능을 허용합니다.
서론
흥분성 세포에서 빠른 칼슘 파를 측정하는 문제는 중추 및 말초 신경계에서 신호 전달을 연구하는 가장 중요하고 도전적인 측면 중 하나입니다. 칼슘 이온은 신경 전달 물질 방출, 시냅스 가소성 및 다양한 세포 내 단백질 1,2,3,4,5의 활성 조절을 유발하는 데 중요한 역할을합니다. 칼슘 신호 전달을 연구하는 것은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 방법을 찾는 데에도 중요합니다6. 칼슘 수준의 변화를 측정하기 위해 형광 칼슘 민감성 염료가 일반적으로 사용되며 형광 수준의 변화가 분석됩니다 7,8,9.
칼슘 염료를 세포에 로딩하는 것은 다른 방법으로 달성 될 수 있습니다. 주로 세포 투과성 염료가 사용됩니다10,11
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프로토콜
실험은 마우스 BALB/C(20-23g, 2-3개월)41로부터 레바토르 아우리스 롱구스(m. LAL)의 분리된 신경-근육 제제에 대해 수행되었습니다. 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 카잔 연방 대학 및 카잔 의과 대학의 실험실 동물 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 실험 프로토콜은 유럽 공동체 이사회 지침 86 / 609 / EEC의 요구 사항을 충족했으며 카잔 의과 대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 링거 및 파일링 용액의 준비
- NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl 2 (2 mM), MgCl 2 (1 mM), NaH 2 PO4 (1 mM), NaHCO3 (11.9 mM) 및 포도당 (11 mM)의 성분을 혼합하여 포유류 근육에 대한 링거 용액을 준비하십시오. 95 % O 2 및 5 % CO 2로 용액을 거품을 내고 필요한 경우 HCl / NaOH를 첨가하여 pH를 7.2-7.4로 조정합니다.
- 염료 로딩 용액을 준비하십....
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결과
제시된 기술에 따라 염료로 제제를 로딩 한 후, 신경 그루터기에 가깝게 위치한 대부분의 시냅스는 충분한 수준의 형광을 가졌다 ( 도 2 참조). 염료로 준비하고, 기재된 등록 및 이미지 처리 방법을 적용한 후, 원하는 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 칼슘 과도 현상이 얻어졌다( 도 4 참조). 칼슘 과도 현상은 제안 된 방법으로 회수되었습니다 ( 그림 3 참조).
회수된 신호의 진폭 및 시간 파라미터도 분석하였다. 평균 데이터는 표 1에 나타내었다.
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토론
신경 그루터기를 통해 Ca2+ 민감성 염료를 마우스 신경 종말에 넣고 컨포칼 현미경을 사용하여 빠른 칼슘 과도 상태를 등록하는 방법이이 기사에 나와 있습니다. 이 로딩 방법의 구현 결과, 신경 그루터기에 가깝게 위치한 대부분의 시냅스는 운동 신경의 저주파 자극에 반응하여 신경 종말에 칼슘이 들어가는 것을 등록 할 수있는 충분한 수준의 형광을 가졌습니다.
그루터기를 통해 칼슘 염료를 로딩하기 위해 이전에 제시된 프로토콜과 달리이 프로토콜은 포유류 시냅스에 사용하도록 설계되었습니다. 냉혈 동물 제제에 사용 된 이전 프로토콜은 하룻밤 배양이 필요했습니다43. 이 프로토콜에서 염료와 함께 필요한 배양은 불과 2 시간입니다. 절단 후 남아있는 신경 분절의 길이에 따라 염료 로딩 속도 및로드 된 단자의 수가 다를 수 있습니다. 더 짧은 신경 그루터기를 위해 염료 용액에서 배양 시간을 더욱 줄일 수있었습니다. 유사한 방법이 파리 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구에 대한 형광 연구는 러시아 과학 재단 보조금 (프로젝트 번호 19-15-00329)의 재정 지원으로 수행되었습니다. 이 방법은 RAS АААА-А18-118022790083-9의 FRC 카잔 과학 센터에 대한 정부 할당의 자금 조달로 개발되었습니다. 이 연구는 연방 연구 센터 "RAS의 카잔 과학 센터"의 장비를 사용하여 개발되었습니다. 저자는이 원고를 비판적으로 읽어 주신 Victor I. Ilyin 박사에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Capillary Glass | Clark Electromedical instruments, 영국 | GC150-10 | |
| 공초점 및 다광자 현미경 시스템 Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 | Sutter Instrument, 미국 | P-97 | |
| 유량 조절기 | KD Medical GmbH Hospital Products, Germany | KD REG | 유량 조절기가 있는 일회용 주입 세트 |
| HEPES | Sigma-Aldrich, 미국 | H0887 | 100mL |
| 조명 시스템 Leica CLS 150X | Leica Microsystems, 독일 | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, 미국 | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Las AF 소프트웨어 | Leica Microsystems, 하이델베르크, 독일 | ||
| Las X software | Leica Microsystems, 하이델베르크, 독일 | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| 흡입 튜브가 있는 마그네틱 홀더 | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, 라트비아 | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Fine science tools, Canada | 26002-20 | |
| 멀티 스핀 MSC 3000 | Biosan, 라트비아 | BS-010205-AAN | |
| 오레곤 그린 488 BAPTA-1 펜타칼륨 염 | 분자 프로브, 미국 | O6806 | 500 μ g |
| 피펫 | Biohit, 러시아 | 720210 | 0.5-10 &마이크로; L |
| 피펫 팁 | Biohit, 러시아 | 781349 | 10 µ L |
| Plasticine | 현지 생산자 | ||
| 일회용 피하 주사 바늘 | Bbraun | 100 Sterican | 0.4× 40mm |
| 스프레드시트 프로그램 | Microsoft, 미국 | Microsoft Office Excel | |
| 실체현미경, Leica M80 | Leica Microsystems, 독일 | ||
| 흡입 | Kazakov A. 생물학적 물체의 전기 자극을 위한 단순 흡입전극 / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 엘라스토머 | 다우 코닝, 미국 | ||
| 주사기 | 현지 생산 | 0.5 mL | |
| 60 mL |
참고문헌
- Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
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