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방법 논문

트리파노소마 크루지 또는 기타 병원성 유기체의 DNA 검출을 위한 즉시 사용 가능한 qPCR

1.8K 조회수

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DOI:

10.3791/63316

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2022년 1월 20일

 ,  ,  , 
1Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde (LaCTAS), Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), 2Pós-graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Paraná (UFPR), 3Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)

이 논문에서

요약

본 연구는 반응 용기에 미리 로드되어 몇 달 동안 냉장고에 보관할 수 있는 T. cruzi DNA 검출을 위해 즉시 사용 가능한 qPCR을 생산하는 단계를 설명합니다.

초록

Real-time PCR(qPCR)은 다수의 샘플에서 미량의 핵산 표적을 증폭할 수 있는 매우 민감하고 정밀한 기술입니다. 그것은 많은 연구 분야에서 광범위하게 사용되어 왔으며 유전자 변형 유기체 (GMO) 작물의 작물에서 인간 진단 및 형질 선택과 같은 분야에서 산업적 응용을 달성했습니다. 그러나 qPCR은 오류 방지 기술이 아닙니다. 모든 시약을 단일 마스터 혼합물로 혼합한 후 일반 qPCR 플레이트의 96개 웰에 분배하면 시약의 잘못된 혼합 또는 웰로의 부정확한 분주와 같은 작업자 실수가 발생할 수 있습니다. 여기에서는 겔화라고 불리는 기술이 제시되며, 마스터 믹스에 존재하는 대부분의 물은 진공 상태로 제출 될 때 졸-겔 혼합물을 형성하는 시약으로 대체됩니다. 결과적으로, qPCR 시약은 실온에서 몇 주 동안 또는 2-8 oC에서 몇 달 동안 효과적으로 보존됩니다. 각 용액 준비에 대한 세부 사항은 T. cruzi 위성 DNA (satDNA)를 검출하도록 설계된 겔화 반응의 예상 측면과 함께 여기에 나와 있습니다. 유사한 절차를 적용하여 다른 유기체를 검출 할 수 있습니다. 겔화된 qPCR 실행을 시작하는 것은 냉장고에서 플레이트를 제거하고, 샘플을 각각의 웰에 추가하고, 실행을 시작하는 것만큼 간단하므로 전체 플레이트 반응의 설정 시간을 샘플을 로드하는 데 걸리는 시간으로 줄일 수 있습니다. 또한 겔화 PCR 반응을 생산하고 품질을 위해 배치로 제어할 수 있어 시간을 절약하고 일상적인 PCR 반응을 실행하는 동안 일반적인 작업자 실수를 방지할 수 있습니다.

서론

샤가스병은 20세기 초 빈곤이 만연한 브라질의 시골 지역에서 발견되었습니다.1,2. 오늘날에도이 질병은 아메리카 대륙의 건강의 사회적, 경제적 결정 요인과 계속 연결되어 있습니다. 샤가스병은 급성기 및 만성기를 포함하는 이상성이다. Trypanosoma cruzi 기생충에 의한 감염, 곤충 매개체에 의해 전염, 선천적 경로를 통한 수혈 또는 오염 된 음식 3,4의 경구 섭취로 인해 발생합니다.

샤가스병의 진단은 임상 증상(특히 로마냐 징후), 혈액 도말 현미경, 혈청학 및 실시간 PCR(qPCR) 또는 등온 증폭 4,5,6,7,8,9와 같은 분자 검사의 관찰을 통해 이루어질 수 있습니다. 임상 증상 및 혈액 도말 현미경 검사는 급성 감염이 의심되는 경우에 사용되는 반면 항체 검색은 무증상 환자의 선별 도구로 사용됩니다. qPCR은 민감도와 특이성으로 인해 만성 환자, 혈액 내 기생충 부하를 측정하는 치료를 받는 급성 환자의 모니터링 도구 및 치료 실패의 대리 마커로 사용되는 것으로 제안되었습니다.6,8,10,11,12 . 현재 이용 가능한 검사보다 더 민감하고 구체적이지만, qPCR은 운송 및 보관을 위한 동결 온도 요구 사항으로 인해 전 세계적으로 소외된 지역에서 진단 도구로 알려지는 것을 효과적으로 방지합니다13,14,15.

이 장애물을 피하기 위해 동결 건조 및 겔화와 같은 보존 기술이 탐구되었습니다16,17. 동결 건조는 수년간 보존을 제공하지만 효소 안정화 / 보존에 일반적으로 사용되는 글리세롤이없는 특수 제작 된 시약이 필요합니다18. 겔화는 수개월 동안 보존을 제공하는 것으로 나타났지만, 이는 규칙적인 시약(19)의 사용을 허용한다. 겔화 용액은 공정에서 각각 특정 역할을 하는 4가지 구성 요소로 구성됩니다: 당 트레할로스 및 멜레지토스는 용액의 자유 물 분자를 감소시켜 건조 과정에서 생체 분자를 보호하고, 글리코겐은 더 넓은 보호 매트릭스를 생성하며, 아미노산 라이신은 생체 분자의 카르복실 사이의 산화 반응을 억제하는 자유 라디칼 제거제로 사용되며, 아미노 및 인산염 그룹. 이들 성분은 건조 과정 동안 3차 또는 4차 구조의 손실을 방지하는 졸-겔 혼합물을 정의하여, 재수화 시 생체분자의 활성을 유지하는 것을 돕는다(19). 일단 반응 튜브 내부에서 안정화되면, 반응은 일반 -20 °C 대신 2-8 °C에서 몇 달 동안 또는 21-23 °C에서 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다. 이 접근법은 이미 샤 가스 병, 말라리아, 리 슈만 편모충 증, 결핵 및 시클로 스포리아증 13,14,15,20과 같은 질병을 진단하는 데 도움이되도록 설계된 테스트에 통합되었습니다.

본 작업은 겔화 절차에 필요한 솔루션을 준비하는 모든 단계, 공정의 함정 및 8-튜브 스트립 내에서 즉시 사용 가능한 겔화된 qPCR의 예상되는 최종 측면을 설명합니다. 동일한 프로토콜을 단일 튜브 또는 96웰 플레이트에 적용할 수 있습니다. 마지막으로, T. cruzi DNA의 검출은 대조군 실행으로 표시됩니다.

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프로토콜

1. 원액 및 겔화 혼합물의 제조

참고: 4개의 스톡 용액(400mg/mL의 멜레지토스, 400mg/mL의 트레할로스, 0.75mg/mL의 라이신 및 200mg/mL의 글리코겐)을 준비하고 표 1 에 표시된 비율에 따라 혼합하여 겔화 혼합물을 생성합니다. 이 프로토콜은 10mL의 스톡 용액 생산을 설명하지만 더 적거나 더 많은 양에 맞게 조정할 수 있습니다.

  1. 멜레지토스 용액
    1. 15mL 플라스틱 튜브에 4g의 멜레지토스를 계량하고 뉴클레아제가 없는 물 6mL를 넣고 분말이 가용화될 때까지 기기의 최대 속도로 소용돌이합니다.
      알림: 가용화를 촉진하기 위해 더 많은 물을 첨가할 수 있으며 최종 부피를 초과하지 않도록 주의하십시오(아래 참조).
    2. 뉴클레아제가 없는 물로 최종 부피를 10mL로 구성합니다. 라벨을 붙이고 2-8 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
  2. 트레할로스 솔루션
    1. 15mL 플라스틱 튜브에 트레할로스 4g의 무게를 달고 뉴클레아제가 없는 물 6mL를 넣고 분말이 가용화될 때까지 기기의 최대 속도로 소용돌이칩니다.
      알림: 가용화를 촉진하기 위해 더 많은 물을 첨가할 수 있으며 최종 부피를 초과하지 않도록 주의하십시오(아래 참조).
    2. 뉴클레아제가 없는 물로 부피를 10mL로 구성하고 0.2μm 필터를 통해 용액을 여과합니다. 라벨을 붙이고 2-8 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
  3. 글리코겐 용액
    1. 15mL 플라스틱 튜브에 글리코겐 2g의 무게를 달고 뉴클레아제가 없는 물 6mL를 넣고 분말이 용해될 때까지 기기의 최대 속도로 소용돌이합니다.
      알림: 가용화를 촉진하기 위해 더 많은 물을 첨가할 수 있으며 최종 부피를 초과하지 않도록 주의하십시오(아래 참조).
    2. 글리코겐의 가용화로 인해 많은 기포가 생성되므로 용액을 2-8°C에서 8-12시간 동안 그대로 두십시오(그림 1). 뉴클레아제가 없는 물로 부피를 10mL로 구성합니다. 라벨을 붙이고 2-8 °C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
  4. 라이신 용액
    1. 15mL 플라스틱 튜브에 7.5mg의 라이신을 넣고 뉴클레아제가 없는 물 6mL를 추가합니다. 분말이 용해 될 때까지 기기의 최대 속도로 와동하십시오.
      알림: 가용화를 촉진하기 위해 더 많은 물을 첨가할 수 있으며 최종 부피를 초과하지 않도록 주의하십시오(아래 참조).
    2. 뉴클레아제가 없는 물로 부피를 10mL로 구성하고 0.2μm 필터를 통해 용액을 여과합니다. 용액을 호박색 플라스크로 옮기거나 빛으로부터 보호하십시오. 라벨을 붙이고 2-8 ° C도에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
  5. 겔화 혼합물 (GM)
    1. 50mL 플라스틱 튜브에 표 1에 따라 부피의 스톡 용액을 혼합합니다.
    2. 튜브의 10 개의 종단 간 반전으로 시약을 혼합하십시오.
      알림: 이 단계가 층류 안전 후드에서 수행되는 경우 여과 단계가 필요하지 않습니다. 이 단계가 깨끗한 환경에서 수행되지 않으면 호박색 플라스크로 옮기기 전에 0.2μm 필터를 통해 용액을 여과하십시오.
    3. 용액을 호박색 플라스크로 옮기거나 빛으로부터 보호하십시오. 라벨을 붙이고 2-8 °C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오.
      참고: 겔화 혼합물을 준비하기 위한 품질 관리 단계로서 측정된 pH, 전도도 및 밀도 값이 다음 범위 내에 있는지 확인하십시오: pH 5.55-6.66; 전도도 0.630-0.757 mS / cm; 그리고 밀도 1.08-1.11 g/cm3. 모든 측정은 25 °C에서 수행되어야 합니다.

2. 겔화를 위한 qPCR 마스터 믹스의 제조

참고: 이 단계에서는 겔화를 위한 qPCR 마스터 믹스를 준비합니다. 따라서 혼합물에 물이 첨가되지 않고 대신 겔화 혼합물이 첨가됩니다 (표 2).

  1. 냉장 용기에서 시약을 해동하십시오. 표 2에 따라 1.5mL 튜브에 시약을 혼합합니다. 5μL의 DNA 샘플을 포함하는 최종 부피가 25μL인 반응의 예가 여기에 나와 있습니다.
    참고: DNA 샘플은 이 단계에서 혼합물에 첨가되지 않습니다. 여기서는 qPCR 마스터 믹스의 각 시약의 최종 부피를 계산하는 데만 사용됩니다. DNA 샘플은 실행을 시작하기 직전에 추가해야합니다 (아래 4 단계 참조).

3. 반응 용기에서 시약의 겔화

  1. 8-튜브 스트립 또는 96-웰 플레이트의 준비를 위해 표 2 에 표시된 부피를 적절하게 곱한다.
  2. 표 2 에 나타낸 겔화 마스터 믹스의 피펫 18.5 μL를 각 반응 웰 상에 올렸다.
    참고: 이 부피는 한 반응에 사용되는 올리고뉴클레오티드 혼합물, PCR 완충액 및 겔화 혼합물의 부피를 나타내며( 표 2에 따름) 시약의 농도와 한 번의 반응에 필요한 부피에 따라 달라집니다. 겔화 마스터 믹스의 최종 부피는 물이 첨가되지 않기 때문에 일반 마스터 믹스의 부피와 다릅니다.
  3. 튜브/플레이트를 진공 오븐 내부의 열전도성 지지체(예: 알루미늄)에 놓습니다.
    참고: 열전도성 지지대는 선택 사항입니다. 작업자는 빠른 열 평형을 위해 튜브의 바닥이 진공 오븐 선반과 접촉하는지 확인해야 합니다.
  4. 두 개의 96웰 플레이트마다 하나의 벤토나이트 점토 백을 놓습니다.
    알림: 벤토나이트 점토 백은 진공에 의해 가해지는 차압에 의해 겔화 마스터 혼합물에서 제거된 물을 흡수하는 데 사용됩니다. 벤토나이트 점토 백은 2개 미만의 96웰 플레이트에 대해 불필요한 것으로 밝혀졌습니다.
  5. 겔화 마스터 믹스가 포함된 튜브/플레이트를 제어된 온도(30°C ± 1°C)에서 대기압(900-930mBar)에 도달할 때까지 진공 방출과 번갈아 가며 각각 30분의 3회 진공 사이클(30 ± 5mBar)에 적용합니다(그림 2).
    알림: 계측기는 소프트웨어를 사용하여 매개변수를 제어하며 사이클의 예는 그림 2에 나와 있습니다. 사용자는 선택한 매개 변수를 나타내는 실행에 대한 프로필을 만들어야 합니다.
  6. 사이클이 완료되면 부피가 눈에 띄게 감소하고(그림 3) 손가락으로 튜브/플레이트를 두드려도 액체가 움직이지 않는지 확인하여 시약의 적절한 겔화를 위해 튜브/플레이트를 확인하십시오.
    알림: 겔화가 발생하지 않으면 튜브를 두드릴 때 용액이 튜브 벽에 튀게 됩니다(그림 3).
  7. 사용하기 전에 튜브/플레이트를 2-8°C에서 8-12시간 동안 밀봉하고 보관하십시오.

4. 겔화된 qPCR 사용

  1. 냉장고에서 튜브 스트립 또는 플레이트를 제거하고 샘플 조작을 위해 워크스테이션에서 엽니다. 각 반응 용기에 15μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다.
    참고: 겔화된 시약의 부피는 약 5μL로 간주됩니다. 따라서 DNA 샘플 부피(아래 참조)와 함께 최종 반응 부피는 25μL입니다.
  2. 5 μL의 DNA 샘플을 추가합니다.
    참고: 모든 qPCR 품질 DNA 템플릿을 사용할 수 있습니다. 본 연구에서, DNA를 108T. 크루지 에피마스티고테스 (균주 Dm28c)로부터 추출하고, TE 완충액을 사용하여 1:10 비율로 연속 희석하였다.
  3. 튜브/플레이트를 밀봉하고 선택한 장비로 진행합니다. 실험을 실행하고 정기적인 데이터 분석을 진행합니다.

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결과

겔화 혼합물을 형성하는 시약 중 3개는 격렬한 와류 시 쉽게 용해됩니다. 그러나 글리코겐은 분말이 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 신중한 와동이 필요합니다. 불행히도, 격렬한 와류는 많은 기포를 생성하여 용액의 실제 부피를 결정하기가 어렵습니다 (그림 1A-B). 따라서 기포 안에 갇힌 대부분의 용액이 주 용액 본체로 이동할 때까지 글리코겐 용액을 냉장고에 두는 것이 중요합니다. 생산 프로토콜과 실험실 루틴을 고려할 때 겔화된 플레이트는 냉장고에 밤새(또는 약 8-12시간) 보관되어 대부분의 기포가 침전되므로 정확한 부피를 쉽게 결정하고 원하는 최종 부피로 조정할 수 있습니다(그림 1C). 그림 1B-C에서 글리코겐 튜브 사이의 기포 부피의 차이를 각각 가용화 직후와 하룻밤 침강...

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토론

최근 몇 년 동안 열대성 및 방치 된 질병을 진단하는 데 도움이되는보다 민감하고 구체적인 기술을 찾아야 할 필요성이 강조되었습니다. 역학 통제에 중요하지만 기생충 검사(광학 현미경) 및 혈청 검사는 특히 민감도 및 현장 진료 적용 가능성과 관련하여 한계가 있습니다. PCR, 등온 증폭 및 각각의 변형과 같은 DNA 증폭 기술은 실험실 환경에서 오랫동안 사용되어 왔지만 기술적 장애물로 인해 현장 환경에서 사용되지 않습니다. 주요 장애물 중 하나는 시약의 운송 및 보관을 위해 -20 ° C의 온도가 필요하다는 것입니다. 이러한 상황을 개선하기 위해, 동결건조 및 겔화와 같은 기술이 PCR 반응을 냉동고(16,18,19)로부터 저장하는데 사용되었다.

본 연구는 튜브, 튜브 스트립, 미세 유체 칩 또는 플레이트와 같은 반...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 진공 오븐에 대한 기술 지원에 대해 Aline Burda Farias와 해당 장비에 대한 액세스를 허용한 Instituto de Biologia Molecular do Parana(브라질 쿠리티바, IBMP)의 행정부에 감사를 표하고 싶습니다. 이 작업은 CNPq 445954/2020-5 보조금으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
벤토나이트 점토 백(활성화)Embamat Global Packaging Solutions (바르셀로나, 스페인)026157/STD실리카 겔 팩과 혼동하지 마십시오
글리코겐Amersham BioscienceCat# US16445
LysineAcros OrganicCat# 365650250
MelezitozeSigma-AldrichCat# 63620
Nuclease-free water선호 벤더
올리고뉴클레오티드선호 벤더
PCR 마스터믹스선호 벤더 또는 Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, 브라질 쿠리치바)Chagas NAT 키트
PCR thermocycler
GMBHVO-400
. 는 진공 오븐 Memmert Gmbh Celsius v10.0 Trehalose Sigma-Aldrich Cat# T9531 Trypanosoma cruzi DNA를 위한 선호 공급업체 소프트웨어 자체 배양 기생충 또는 ATCC Vacuum oven Memmert와 같은 공인 공급업체에서 구입했습니다.

참고문헌

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