Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

요약

뉴로펩타이드의 질량 분광학적 특성화는 서열, 정량 및 국소화 정보를 제공한다. 이 최적화 된 워크 플로는 신경 펩티드 연구뿐만 아니라 다른 내인성 펩타이드에도 유용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 스포팅 및 MALDI-MS 이미징을 사용하는 뉴로펩타이드의 샘플 준비, MS 획득, MS 분석 및 데이터베이스 생성을 기술한다.

초록

뉴로펩타이드는 발달, 번식, 음식 섭취, 외부 스트레스 요인에 대한 반응과 같은 거의 모든 생리적 및 행동 과정을 조절하는 신호 전달 분자입니다. 그러나 생화학 적 메커니즘과 신경 펩티드의 완전한 보완 및 그 기능적 역할은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 이들 내인성 펩티드의 특성화는 신호전달 분자의 이러한 부류 내의 엄청난 다양성에 의해 방해된다. 또한, 뉴로펩타이드는 신경전달물질보다 100x - 1000배 낮은 농도에서 생리활성이며 시냅스 방출 후 효소적 분해가 발생하기 쉽다. 질량 분광법 (MS)은 포괄적 인 선험적 지식없이 분석물을 식별, 정량화 및 현지화 할 수있는 매우 민감한 분석 도구입니다. 전 세계적으로 뉴로펩타이드를 프로파일링하고 새로운 펩타이드의 발견을 돕는 데 매우 적합합니다. 이러한 부류의 펩티드의 낮은 풍부도와 높은 화학적 다양성으로 인해, 몇몇 샘플 준비 방법, MS 획득 파라미터 및 데이터 분석 전략은 최적의 뉴로펩타이드 특성화를 허용하기 위해 프로테오믹스 기술로부터 적응되었다. 여기에서는 액체 크로마토그래피 (LC)-MS 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)-MS를 사용하여 서열 특성화, 정량 및 국소화를 위해 복잡한 생물학적 조직으로부터 신경 펩티드를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 블루 크랩으로부터 뉴로펩타이드 데이터베이스를 제조하기 위한 프로토콜로, 포괄적인 게놈 정보가 없는 유기체인 Callinectes sapidus가 포함된다. 이러한 워크플로우는 다양한 장비를 사용하여 다른 종의 내인성 펩타이드의 다른 클래스를 연구하도록 조정할 수 있습니다.

서론

신경계는 복잡하며 유기체 전체에 신호를 전달하기 위해 뉴런 네트워크가 필요합니다. 신경계는 감각 정보와 생물학적 반응을 조정합니다. 신호 전달과 관련된 복잡하고 복잡한 상호 작용에는 신경 전달 물질, 스테로이드 및 신경 펩티드와 같은 많은 다른 신호 분자가 필요합니다. 뉴로펩타이드는 스트레스 및 기타 자극에 대한 생리적 반응을 활성화시키는 데 중요한 역할을 하는 가장 다양하고 강력한 신호전달 분자이기 때문에, 이러한 생리적 과정에서 이들의 특정 역할을 결정하는 것이 관심의 대상이다. 뉴로펩타이드 기능은 이동성, 수용체 상호작용 및 친화도를 결정하는 아미노산 구조와 관련이 있다¹. 신경 펩티드가 조직의 다른 영역에서 합성, 저장 및 방출 될 수 있기 때문에 중요한 조직 화학과 같은 기술 및 전기 생리학은 신경 펩티드 구조 및 기능 ^2,3,4를 조사하기 위해 사용되었지만 이러한 방법은 신경 펩티드의 광대 한 서열 다양성을 해결하기위한 처리량 및 특이성에 의해 제한됩니다.

질량 분광법 (MS)은 신경 펩티드 구조 및 풍부도의 높은 처리량 분....

프로토콜

설명된 모든 조직 샘플링은 위스콘신-매디슨 대학교 가이드라인에 따라 수행되었다.

1. 신경펩타이드의 LC-ESI-MS 분석

1. 뉴로펩타이드 추출 및 탈염
   1. 조직 획득에 앞서,^{도 16}에 기재된 바와 같이 산성화된 메탄올(acMeOH)(90:9:1 MeOH:물:아세트산)을 준비한다.
   2. 갑각류¹⁷ 로부터 뇌 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 20 μL의 acMeOH가 들어있는 0.6 mL 튜브에 각각 하나의 조직을 즉시 배치하십시오.
      참고: 조직 해부 프로토콜은 동물과 조직 유형에 따라 크게 다릅니다. 독자는 갑각류로부터 뇌 조직 및 다수의 다른 조직 유형을 해부하는 방법에 대한 상세한 설명을 위해 프로토콜¹⁷ 을 참조한다. 샘플은 사용 전까지 -80°C에서 보관할 수 있다(이상적으로는 6개월 이내). 설명 된 볼륨은 Callinectes sapidus의 단일 뇌에 사용됩니다. 부피는 조직 크기에 맞게 조정되어야 합니다. 조직은 용매 없이 즉시 플래시 동결될 수 있지만, 내인성 단백질 분해 효소가 억제되지 않고 활성 상태를 유지....

결과

샘플 준비 및 MS 분석을 위한 워크플로우는 그림 1에 설명되어 있습니다. 신경 조직의 해부 후, 균질화, 추출 및 탈염이 수행되어 뉴로펩타이드 샘플을 정제한다. 동위원소 라벨-기반 정량화가 필요하다면, 샘플은 라벨링되고 다시 한번 탈염된다. 생성 된 샘플은 신경 펩티드 확인 및 정량을 위해 LC-MS / MS를 통해 분석됩니다.

프로테오믹스 소프트웨어를 통해 확인된 뉴로펩티드는 양호한 펩티드 단편화 서열 커버리지를 가져야 하지만, 이것은 세계적으로 정의되거나 표준화되지 않는다. 절대 식별을 위해, 모든 아미노산은 명확한 식별과 국소화를 제공하는 단편 이온을 생성해야 한다. 이것은 또한 각 단편 이온의 강도의 확인을 위해 합성된 펩티드와 비교되어야 한다. 모든 추정적 동정에 대해 이것을 수행하기 위한 비용이 실현가능하지 않기 때문에, 식별은 일반적으로 더 많은 관찰된 단편 이온이 펩티드 식별 신뢰도를 증가시키는 신뢰에 기초하여.......

토론

신경계에서 발견되는 신경 펩티드 및 내인성 펩티드의 정확한 식별, 정량화 및 국소화는 그들의 기능을 이해하는 데 결정적이다^23,24. 질량 분광법은 완전히 서열화 된 게놈이없는 유기체에서조차도이 모든 것을 달성 할 수있는 강력한 기술입니다. LC-ESI- 및 MALDI-MS의 조합을 통해 C. sapidus로부터 수집된 조직으로부터 신경펩티드를 검출, 정량화 및 국소화하는 이 프로토콜의 능력이 입증된다.

LC-ESI-MS 분석을 위한 시료 준비 중에 고려해야 합니다. MS가 민감한 기술인 반면, 신경 조직의 낮은 펩티드 농도(펨토몰 범위²⁵까지)는 심각한 한계를 제기한다. 신중한 샘플 준비는 단백질 및 지질과 같은보다 풍부하고 간섭하는 매트릭스 성분을 제거 할뿐만 아니라 각 단계^26,2.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강>화학, 시약 및 소모품
2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 매트릭스	Supelco	39319
아세트산	Fisher Chemical	A38S-500
아세토니트릴 Optima LC/MS 등급	Fisher Chemical	A955-500
중탄산암모늄	시그마-알드리치	9830
Borane pyridine	Sigma-Aldrich	179752
Bruker 펩타이드 보정 혼합물	Bruker Daltonics	NC9846988
Capillary	Polymicro	1068150019	나노 플로우 컬럼 (75 µ M 내경 x 360 & 마이크로; m 외경)
Cryostat 컵	Sigma-Aldrich	E6032	어떤 컵이나 금형이라도 작동해야 합니다
마이크로 원심 분리기 튜브	Eppendorf	30108434
포름 알데히드	시그마 - 알드리치	252549
포름 알데히드 - D2	시그마 알드리치	492620
포름산 옵티마 LC / MS 등급	피셔 화학	A117-50
젤라틴	Difco	214340	장소 37 ° C 용융을 위한 수조
소수성 장벽 펜	Vector Labs	15553953
인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 유리 슬라이드	Delta Technologies	CB-90IN-S107	25 mm x 75 mm x 0.8 mm (너비 x 길이 x 두께)
LC-MS 바이알	Thermo	TFMSCERT5000-30LVW
메탄올 옵티마 LC/MS 등급	Fisher Chemical	A456-500
파라필름	Sigma-Aldrich	P7793	소수성 필름
pH 지시자 스트립	Supelco	109450
적린 클러스터	Sigma-Aldrich	343242
역상 C18 재료	Waters	186002350	nanoflow column에 수동으로 포장
Wite-out pen	BIC	150810
ZipTip	Millipore	Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5	HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R	Eppendorf	05-401-205
cryosstat- HM 550	Thermo Fisher Scientific	956564A
건조제	드라이라이트	2088701
펜치	WPI	501764
MALDI 스테인레스 스틸 타겟 플레이트	Bruker Daltonics	8280781
Pipet-Lite XLS	Rainin	17014391	200 µ L
Q Exactive Plus 하이브리드 사중극자-Orbitrap	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF	Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100	Savant	SVC-100D
초음파 세척기	Bransonic	2510R-MTH	초음파 처리 초음파
균질기	Fisher Scientific	FB120110	FB120 음파 디스펜서 with CL-18 프로브
진공 펌프- Alcatel 2008 A	Ideal Vacuum Products	P10976	극한 압력 = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer	Corning	6775
수조(37C) - Isotemp 110	Fisher Scientific	15-460-10
데이터 분석 소프트웨어
Expasy	https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis	Bruker Daltonics
FlexControl	Bruker Daltonics
FlexImaging	Bruker Daltonics
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab	https://scils.de/
SignalP 5.0	https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ 프로그램=tblastn& PAGE_ TYPE=블래스트서치& SHOW_ 기본값=on& LINK_LOC =blasthome