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방법 논문

Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

2.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63322

⸱

2022년 5월 31일

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

뉴로펩타이드의 질량 분광학적 특성화는 서열, 정량 및 국소화 정보를 제공한다. 이 최적화 된 워크 플로는 신경 펩티드 연구뿐만 아니라 다른 내인성 펩타이드에도 유용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 스포팅 및 MALDI-MS 이미징을 사용하는 뉴로펩타이드의 샘플 준비, MS 획득, MS 분석 및 데이터베이스 생성을 기술한다.

초록

뉴로펩타이드는 발달, 번식, 음식 섭취, 외부 스트레스 요인에 대한 반응과 같은 거의 모든 생리적 및 행동 과정을 조절하는 신호 전달 분자입니다. 그러나 생화학 적 메커니즘과 신경 펩티드의 완전한 보완 및 그 기능적 역할은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 이들 내인성 펩티드의 특성화는 신호전달 분자의 이러한 부류 내의 엄청난 다양성에 의해 방해된다. 또한, 뉴로펩타이드는 신경전달물질보다 100x - 1000배 낮은 농도에서 생리활성이며 시냅스 방출 후 효소적 분해가 발생하기 쉽다. 질량 분광법 (MS)은 포괄적 인 선험적 지식없이 분석물을 식별, 정량화 및 현지화 할 수있는 매우 민감한 분석 도구입니다. 전 세계적으로 뉴로펩타이드를 프로파일링하고 새로운 펩타이드의 발견을 돕는 데 매우 적합합니다. 이러한 부류의 펩티드의 낮은 풍부도와 높은 화학적 다양성으로 인해, 몇몇 샘플 준비 방법, MS 획득 파라미터 및 데이터 분석 전략은 최적의 뉴로펩타이드 특성화를 허용하기 위해 프로테오믹스 기술로부터 적응되었다. 여기에서는 액체 크로마토그래피 (LC)-MS 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)-MS를 사용하여 서열 특성화, 정량 및 국소화를 위해 복잡한 생물학적 조직으로부터 신경 펩티드를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 블루 크랩으로부터 뉴로펩타이드 데이터베이스를 제조하기 위한 프로토콜로, 포괄적인 게놈 정보가 없는 유기체인 Callinectes sapidus가 포함된다. 이러한 워크플로우는 다양한 장비를 사용하여 다른 종의 내인성 펩타이드의 다른 클래스를 연구하도록 조정할 수 있습니다.

서론

신경계는 복잡하며 유기체 전체에 신호를 전달하기 위해 뉴런 네트워크가 필요합니다. 신경계는 감각 정보와 생물학적 반응을 조정합니다. 신호 전달과 관련된 복잡하고 복잡한 상호 작용에는 신경 전달 물질, 스테로이드 및 신경 펩티드와 같은 많은 다른 신호 분자가 필요합니다. 뉴로펩타이드는 스트레스 및 기타 자극에 대한 생리적 반응을 활성화시키는 데 중요한 역할을 하는 가장 다양하고 강력한 신호전달 분자이기 때문에, 이러한 생리적 과정에서 이들의 특정 역할을 결정하는 것이 관심의 대상이다. 뉴로펩타이드 기능은 이동성, 수용체 상호작용 및 친화도를 결정하는 아미노산 구조와 관련이 있다1. 신경 펩티드가 조직의 다른 영역에서 합성, 저장 및 방출 될 수 있기 때문에 중요한 조직 화학과 같은 기술 및 전기 생리학은 신경 펩티드 구조 및 기능 2,3,4를 조사하기 위해 사용되었지만 이러한 방법은 신경 펩티드의 광대 한 서열 다양성을 해결하기위한 처리량 및 특이성에 의해 제한됩니다.

질량 분광법 (MS)은 신경 펩티드 구조 및 풍부도의 높은 처리량 분석을 가능하게합니다. 이것은 상이한 MS 기술, 가장 일반적으로 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화 MS (LC-ESI-MS)5 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 MS (MALDI-MS)6를 통해 수행될 수 있다. 고정밀 질량 측정 및 MS 단편화를 활용하여, MS는 그들의 기능 7,8을 확인하는 것을 돕기 위해 선험적 지식 없이 복잡한 혼합물로부터 뉴로펩티드에 아미노산 서열 및 번역 후 변형(PTM) 상태를 할당하는 능력을 제공한다. 정성적 정보 이외에, MS는 무표지 정량(LFQ) 또는 동위원소 또는 등압 표지9와 같은 표지 기반 방법을 통해 신경펩티드의 정량적 정보를 가능하게 한다. LFQ의 주요 장점은 단순성, 낮은 분석 비용 및 샘플 손실을 최소화 할 수있는 샘플 준비 단계 감소입니다. 그러나 LFQ의 단점은 실행 간 변동성으로 인한 정량적 오류를 해결하기 위해 여러 기술 반복실험이 필요하기 때문에 계측기 시간 비용이 증가한다는 것입니다. 이것은 또한 작은 변화를 정확하게 정량화하는 능력을 감소시킵니다. 라벨 기반 방법은 여러 샘플이 다양한 안정한 동위원소를 사용하여 차등적으로 표지되고, 하나의 샘플로 결합되고, 질량 분광법을 통해 동시에 분석 될 수 있기 때문에 덜 체계적인 변형을 겪습니다. 이것은 또한 처리량을 증가시키지만, 동위원소 라벨은 합성하거나 구매하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다. 전체 스캔 질량 스펙트럼(MS1) 스펙트럼 복잡성 또한 멀티플렉싱이 증가함에 따라 증가하며, 이는 단편화될 수 있는 독특한 뉴로펩티드의 수를 감소시키고, 따라서 식별된다. 반대로, 등압 표지는 MS1 수준에서 스펙트럼 복잡성을 증가시키지 않지만, 뉴로펩타이드와 같은 낮은 풍부 분석물에 대한 도전을 도입한다. 등압 정량이 단편 이온 질량 스펙트럼(MS2) 수준에서 수행됨에 따라, 저풍부 뉴로펩티드는 단편화를 위해 더 풍부한 매트릭스 성분이 선택될 수 있고 선택된 것들은 정량화되기에 충분한 풍부도를 갖지 않을 수 있기 때문에 정량화될 수 없을 수 있다. 동위원소 표지를 사용하면 확인된 모든 펩티드에 대해 정량을 수행할 수 있습니다.

식별 및 정량화 이외에도, 국소화 정보는 MALDI-MS 이미징(MALDI-MSI)10을 통해 MS에 의해 획득될 수 있다. 샘플 표면을 가로질러 레이저를 래스터링함으로써, MS 스펙트럼은 각 m/z 값에 대한 히트 맵 이미지로 컴파일될 수 있다. 조건에 걸쳐 상이한 영역에서의 일시적 뉴로펩타이드 신호 세기를 매핑하는 것은 기능 결정(11)에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 뉴로펩티드의 국소화는 뉴로펩티드 기능이 위치12에 따라 다를 수 있기 때문에 특히 중요하다.

뉴로펩티드는 신경전달물질과 같은 다른 신호전달 분자들보다 낮은 풍부도의 생체내에서 발견되며, 따라서 검출을 위한 민감한 방법들(13)을 필요로 한다. 이는 지질11,14와 같은 더 높은 풍부 매트릭스 성분의 제거를 통해 달성될 수 있다. 신경 펩티드의 분석을위한 추가적인 고려 사항은 일반적인 프로테오믹스 워크 플로우와 비교할 때 이루어져야하며, 주로 대부분의 neuropeptidomic 분석이 효소 소화를 생략하기 때문입니다. 이것은 뉴로펩타이드 데이터 분석을 위한 소프트웨어 옵션을 제한하는데, 이는 대부분 프로테오믹스 데이터와 펩티드 검출에 의해 정보화된 단백질 일치를 기반으로 하는 알고리즘으로 구축되었기 때문이다. 그러나, PEAKS15와 같은 많은 소프트웨어는 그들의 de novo 시퀀싱 능력으로 인해 뉴로펩타이드 분석에 더 적합하다. 추출 방법에서 MS 데이터 분석에 이르기까지 신경 펩티드의 분석을 위해 몇 가지 요인을 고려해야합니다.

여기에 기술된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 및 MALDI-MSI에 의한 뉴로펩티드의 샘플 제조 및 디메틸 동위원소 표지, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 방법을 포함한다. 여러 실험의 대표적인 결과를 통해 푸른 게, Callinectes sapidus에서 신경 펩티드를 식별, 정량화 및 국소화하는 이러한 방법의 유용성과 능력이 입증됩니다. 신경계를 더 잘 이해하기 위해 모델 시스템이 일반적으로 사용됩니다. 많은 유기체는 완전히 서열화된 게놈을 이용할 수 없으며, 이는 펩티드 수준에서 포괄적인 뉴로펩티드 발견을 방지한다. 이러한 도전을 완화하기 위해, 완전한 게놈 정보 없이 유기체에 대한 데이터베이스를 생성하기 위해 신규한 뉴로펩티드 및 전사체 마이닝을 확인하기 위한 프로토콜이 포함된다. 여기에 제시된 모든 프로토콜은 모든 종의 뉴로펩타이드 샘플에 최적화될 수 있을 뿐만 아니라 임의의 내인성 펩티드의 분석에도 적용될 수 있다.

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프로토콜

설명된 모든 조직 샘플링은 위스콘신-매디슨 대학교 가이드라인에 따라 수행되었다.

1. 신경펩타이드의 LC-ESI-MS 분석

  1. 뉴로펩타이드 추출 및 탈염
    1. 조직 획득에 앞서,도 16에 기재된 바와 같이 산성화된 메탄올(acMeOH)(90:9:1 MeOH:물:아세트산)을 준비한다.
    2. 갑각류17 로부터 뇌 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 20 μL의 acMeOH가 들어있는 0.6 mL 튜브에 각각 하나의 조직을 즉시 배치하십시오.
      참고: 조직 해부 프로토콜은 동물과 조직 유형에 따라 크게 다릅니다. 독자는 갑각류로부터 뇌 조직 및 다수의 다른 조직 유형을 해부하는 방법에 대한 상세한 설명을 위해 프로토콜17 을 참조한다. 샘플은 사용 전까지 -80°C에서 보관할 수 있다(이상적으로는 6개월 이내). 설명 된 볼륨은 Callinectes sapidus의 단일 뇌에 사용됩니다. 부피는 조직 크기에 맞게 조정되어야 합니다. 조직은 용매 없이 즉시 플래시 동결될 수 있지만, 내인성 단백질 분해 효소가 억제되지 않고 활성 상태를 유지하므로 권장되지 않지만, 추울 때는 느린 속도로 유지됩니다.
    3. 150 μL의 acMeOH를 샘플에 첨가한다. 초음파 균질기에서 총 초음파 처리 시간을 24 초, 펄스 시간을 8 초, 일시 중지 시간을 15 초, 진폭을 50 %로 설정하고 얼음 위에서 샘플을 균질화하십시오.
      참고: 다양한 균질화 시스템을 사용할 수 있습니다. 샘플 유형 및 장비에 따라 설정과 조건을 조정하십시오.
    4. 샘플을 20분 동안 20,000 x g 에서 4°C에서 원심분리한다. 피펫으로, 상청액을 튜브에 옮기고 대략 35°C의 진공 농축기 (266 x g, 1 x 10-4 Torr)에서 건조시킨다.
      참고: 건조된 샘플은 사용 전까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다(이상적으로는 6개월 이내). 진공 농축기 가열은 주의해서 수행해야합니다. 열이 건조 시간을 단축시키는 동안, 펩티드 분해를 최소화하기 위해 모든 액체가 증발된 직후에 샘플을 농축기로부터 제거해야 한다. 이를 피하기 위해, 가열은 이 단계와 모든 후속 단계로부터 생략될 수 있다.
    5. 탈염을 위해, 추출된 조직 샘플을 0.1% 포름산(FA)의 20 μL로 재구성하고, 잘 와류하고, 실온에서 1분 동안 수조에서 초음파 처리한다.
      참고 : 다양한 탈염 재료가 있습니다. 수지 동일성 및 뉴로펩타이드 양에 따라 용액 및 부피를 조절한다. 총 펩티드 양은 상업적 펩티드 정량 검정( 표 문헌 참조)을 사용하여 추정될 수 있다.
    6. 0.5 μL의 샘플을 pH 스트립에 도포하여 pH가 4< 것을 확인하였다. pH가 더 높으면 pH가 4가 될 때까지 10% FA의 분취량 1μL 분취량을 첨가<다.
    7. 탈염에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오18. 100 μL의 50% 아세토니트릴(ACN), 0.1% FA를 함유하는 100 μL의 평형 용액, 0.1% FA의 100 μL를 함유하는 세척 용액, 및 20 μL의 25% ACN/0.1% FA, 20 μL의 50% ACN/0.1% FA, 및 20 μL의 75% ACN/0.1% FA를 함유하는 용출 용액을 제조하였다.
    8. 10 μL 탈염 팁을 C18 수지로 얻었다( 표 참조).
    9. 탈염 팁을 15 μL로 설정된 20 μL 피펫 상에 놓는다. 탈염 팁이 젖으면 피펫이 폐기 될 때까지 용액에서 벗어날 때 피펫을 우울하게 유지하여 공기가 통과하는 것을 방지하십시오.
    10. 팁을 습윤 용액으로 3x, 평형 용액으로 3x를 흡인하십시오. 시료 10x에서 흡인물은 세척액에서 3x 세척한 후, 각 세척액을 버린다. ACN을 증가시키기 위해 각각의 용출 용액에서 10x를 흡인하여 몫을 묽는다.
      참고: 용출 분율은 추가 분석을 위해 별도로 유지하거나 결합할 수 있습니다.
    11. 사용된 탈염 팁을 버리고 용출된 뉴로펩티드를 대략 35°C의 진공 농축기(266 x g, 1 x 10-4 Torr)에서 건조시킨다.
      참고: 이 제품은 사용 전까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다(이상적으로는 6개월 이내).
  2. 조직 추출물에서 신경 펩티드의 동위원소 표지
    참고: 이 단계는 선택 사항이며 정량화가 필요한 경우에만 사용됩니다.
    1. 흄 후드에서 2-플렉스 동위원소 디메틸 라벨링 용액을 제조하였다: 물 486.5 μL의 물 중 1% CH2OH2 (13.5 μL의 스톡 37 중량/중량 퍼센트 (중량%)), 1%CH2OD2(475 μL의 물 중 20 중량% 용액의 25 μL), 및 0.03 M 보란 피리딘 (996.25 μL의 물 중 3.75 μL의 스톡 8 M 용액).
      주의: 포름알데히드는 독성이 있으므로 모든 용액은 통풍이 잘되는 후드에 보관해야 합니다. 장갑, 실험실 코트, 눈 보호 및 불침투성 신발을 착용하십시오. 콘택트 렌즈는이 재료로 작업 할 때 착용해서는 안됩니다.
      참고: 다른 동위원소 시약이 있습니다. 샘플 유형 및 원하는 라벨링 채널 수에 따라 적절한 것을 선택하십시오.
    2. 조 뉴로펩타이드 추출물을 10 μL의 물에 녹이고 10분 동안 초음파 처리한다.
    3. 10 μL의 상이한 동위원소 포름알데히드 용액 (즉, CH2OH2,CH2OD2등)을 정량적으로 측정되는 각각의 상이한 실험 조건에 첨가한다. 소용돌이를 잘 섞어서 각 샘플을 2,000 x g에서 간단히 원심분리한다.
    4. 10 μL의 0.03 M 보란피리딘을 각 샘플 튜브에 첨가한다. 소용돌이를 잘 섞어서 각 샘플을 2,000 x g에서 간단히 원심분리한다.
    5. 샘플을 수조에서 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
    6. 수조에서 샘플을 제거하고 100 mM 중탄산 암모늄 10 μL를 첨가하십시오. 소용돌이를 잘 섞어서 각 샘플을 2,000 x g에서 간단히 원심분리한다.
    7. 표지된 샘플을 하나의 2-플렉스 샘플에 결합하고, 뉴로펩티드를 대략 35°C에서 진공 농축기 (266 x g, 1 x 10-4 Torr)에서 건조시킨다.
    8. 단계 1.1.5 - 1.1.10을 재수행하여 표지된 뉴로펩티드를 탈염하고 데이터 수집을 위해 준비될 때까지 저장한다.
  3. 데이터 수집
    1. 건조된 탈염된 뉴로펩티드를 12 μL의 3% ACN/0.1% FA, 와류 웰, 37°C 수조에서 1분 동안 초음파 처리하고, 2,000 x g에서 간단히 원심분리하여 재구성한다. 각 샘플을 자동 시료 주입기 바이알로 옮깁니다.
      참고: 뉴로펩타이드 양에 따라 시료 부피를 μL 당 ∼1 μg의 펩티드 농도로 조정하십시오. 총 펩티드 양은 상업적 펩티드 정량 분석법을 사용하여 추정할 수 있다( 표 참조).
    2. 자동 시료 주입기를 사용하여 1μL의 샘플을 고해상도 나노-LC-MS/MS 기기에 주입 합니다(자료 표 참조).
    3. 이동상 A로서 물에 0.1% FA를 가졌고, 이동상 B로서 ACN에서 0.1% FA로 샘플을 실행하기 위해 대략 15cm 길이의 역상(RP) C18 컬럼( 재료 표 참조)을 사용하십시오. 샘플을 300nL/min의 속도로 3% - 95%의 기울기로 11분 이상 동안 300nL/min의 속도로 실행하십시오.
    4. 여기에 사용된 MS 기기의 경우 스프레이 전압의 경우 2.00kV, 모세관 온도의 경우 275°C의 일반적인 MS 조건을 사용합니다.
    5. 분해능 60,000개, 자동 이득 제어(AGC) 목표 1 x 106 및 150ms의 최대 이온 주입 시간(IT)으로 200 - 2,000m/z 범위의 MS 스펙트럼을 획득합니다.
    6. 30의 정규화된 충돌 에너지, 2.0m/z의 절연 창, 15,000의 분해능, 2 x 10 5의 AGC 목표 및 250ms의 최대 IT를 사용하여 고에너지 충돌 해리(HCD) 단편화를 위해 가장 강렬한 이온15개(최소 강도 3.2 x 104)를 선택합니다.
    7. 동적 제외 창을 30초로 설정합니다. 전하가 1 또는 8인 이온과 인식되지 않≥ 전하 상태를 갖는 이온을 제외합니다.
  4. 뉴로펩타이드 동정 및 정량화
    참고: 데이터베이스 검색 및 펩티드 정량화(오픈 소스 및 상용 모두)를 위한 많은 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 여기서, PEAKS Studio(프로테오믹스 소프트웨어)15 가 사용될 것이다.
    1. 1.4.2 - 1.4.6에 설명된 단계를 사용하여 데이터베이스 검색을 수행합니다.
    2. 새 프로젝트를 만들고 효소에 대해 없음 , 계측기의 경우 Orbitrap , 단편에 대한 HCD 및 수집을 위한 데이터 의존적 수집(DDA)을 선택하는 LC-MS 데이터를 추가합니다.
      참고: 데이터 수집 매개변수에 따라 적절한 매개변수를 선택하십시오.
    3. 식별을 선택하고 올바른 전구체 [DDA] 및 질량만을 선택합니다.
    4. 데이터베이스 검색을 선택하고 전구체 질량에 대해 단동위원소 질량을 사용하여 20.0ppm의 오차 허용오차를 설정하고, 단편 이온 질량에 대해 0.02Da, 효소 유형의 경우 없음, 다이제스트 모드의 경우 비특이성, 최대 누락된 절단에 대해 100개, 펩티드 당 최대 허용 변수 PTM이 3인 다음 가변 PTM을 설정합니다: 아미드화, 산화(M), E의 파이로글루, 그리고 Q의 파이로 글루.
    5. 뉴로펩타이드 데이터베이스를 선택하고, 디코이 융합으로 거짓 발견률(FDR)을 추정한다.
      참고: 질량 공차 오류는 수집된 데이터와 일치하도록 조정해야 합니다. 샘플 유형에 적합한 데이터베이스를 사용합니다. 효소를 선택하지 않은 경우, 최대 누락된 절단 파라미터는 검색에 영향을 주지 않습니다. 그러나 소프트웨어에 옵션으로 지정되지 않은 다이제스트 모드가 없는 경우 많은 수의 누락된 분리가 필요합니다.
    6. 레이블 없는 정량화가 필요한 경우 정량화를 선택하고 레이블 없음 을 선택한 다음 오류 허용 오차를 20.0ppm 으로 설정하고 보존 시간 허용 오차를 1.0분으로 설정합니다.
    7. 동위원소 표지를 위한 단계 1.2가 수행된 경우 전구체 이온 정량화를 수행한다.
      1. 정량화를 선택하고, 전구체 이온 정량화를 선택하고, 1.0분의 보존 시간 범위를 사용하고, 1%의 FDR 임계값을 사용합니다.
      2. [방법 선택] 드롭다운 메뉴에서 사전 설정 또는 사용자 지정 정량화 방법을 선택합니다.
      3. 새 사용자 지정 메서드를 만들려면 구성 창 > 레이블 Q 메서드 > 새로 만들기> 클릭합니다. 새 메서드의 이름을 지정하고 메서드 유형에 대해 전구체 이온 정량화를 선택합니다. 행 추가를 선택하고 PTM 옵션 목록에서 수정을 선택합니다.
      4. LC-MS 데이터를 추가하고 실험의 제어 조건으로부터 뉴로펩티드에 대한 변형이 될 참조 조건을 선택한다.
    8. 단계 1.4.9 - 1.4.11에 설명된 대로 검색 결과를 평가합니다.
    9. -10lgP ≥ 20을 가진 펩티드 및 단백질에 대한 요약 탭을 통해 결과를 필터링하고, 1 개의 고유 한 펩티드≥ 선택하고, 중요한 펩티드로 표지 된 상자를 선택하십시오.
    10. Protein.csv는 뉴로펩티드 식별을 나타내고 펩티드.csv는 뉴로펩티드 단편 식별을 나타내는 데이터베이스 검색 결과를 평가한다.
    11. 데이터베이스 검색에서 단백질 및 펩티드 점수, 질량 정확도 및 서열 커버리지를 검사합니다.
      참고: 각 데이터베이스 검색 소프트웨어는 고유한 점수 매기기 알고리즘을 사용하며 그에 따라 평가해야 할 수도 있습니다. 동정은 완전한 단편 이온 계열을 함유하는 확인된 펩티드에 대해 관찰된 스펙트럼을 수동으로 검사함으로써 평가될 수 있다.

2. 신경펩타이드의 MALDI-MS 스포팅 분석

  1. 샘플 준비
    1. 정량화가 필요한 경우 단계 1.2.8을 제외한 단계 1.1 또는 단계 1.1 - 1.2를 따르십시오(동위원소 표지 후 탈염은 MALDI-MS 분석 전에 필요하지 않음).
    2. 건조된 탈염된 뉴로펩티드를 0.1% FA의 5 μL, 와류 웰, 37°C 수조에서 1분 동안 초음파 처리하고, 2,000 x g에서 간단히 원심분리하여 재구성한다.
    3. 갑각류 조직에서 신경 펩티드를 발견하기 위해 매트릭스로 50 % 메탄올 (MeOH) / 0.1 % FA (v / v)에 150 mg / mL 2,5- 디히드 록시 벤조산 (DHB)을 준비하십시오.
    4. 3 μL 액적의 샘플을 소수성 필름 상에 피펫팅하고( 표 재질 참조) 3 μL의 매트릭스를 샘플 액적 상에 직접 피펫한다. 피펫을 위아래로 섞습니다.
    5. 1:1 샘플의 피펫 1 μL:매트릭스 혼합물을 MALDI 스테인리스강 표적 플레이트의 웰에 넣는다. 피펫 팁을 사용하여 각 혼합물을 샘플의 가장자리까지 잘 퍼뜨립니다. 샘플은 균일한 분포를 촉진하기 위해 우물 조각의 가장자리를 만져야 합니다(그림 4A).
    6. 스팟 1 μL의 1:1 캘리브란트:매트릭스 혼합물(상업적 또는 맞춤형 캘리브레이션 믹스, 폴리머 물질(즉, MeOH에 용해된 적색인) 또는 일반적인 매트릭스 클러스터 이온)12를 샘플 근처의 웰에 넣는다.
      참고 : 붉은 인은 발견하기 전에 매트릭스와 혼합 될 필요가 없습니다.
  2. 데이터 수집
    1. 건조된 샘플 스팟이 포함된 대상 플레이트를 MALDI 탄뎀 비행 시간(TOF/TOF) 기기에 삽입 합니다(재료 표 참조).
    2. DHB 매트릭스의 경우 레이저 파워를 95%로 설정하고, 자동 최적 검출기 게인, 스마트 - 완벽한 샘플 샘플 캐리어 이동 모드를 선택합니다. 200 - 3200 m/z 범위의 MS 스펙트럼을 획득하고 각 스팟에서 여러 스펙트럼을 함께 추가하여 뉴로펩타이드 신호 대 잡음비를 증가시킵니다.
      참고: 레이저 출력 비율, 검출기 이득을 최적화하고 적절한 샘플 캐리어 이동 모드를 선택하여 모든 수집이 대략 전체 지점을 커버하고 후속 획득이 이전 위치로 이동하지 않도록 합니다.
    3. 계측기를 보정합니다.
      참고: 원하는 뉴로펩타이드 범위를 포함하도록 질량 범위를 조정하십시오.
  3. 데이터 분석
    1. 데이터 분석 소프트웨어에서 MALDI-MS 파일을 열고( 자료 표 참조) 여기에 사용된 소프트웨어의 기준선 빼기를 클릭합니다.
    2. 질량 목록 찾기를 클릭하여 피크 선택을 수행합니다. 피크가 너무 적으면 질량 목록 편집을 선택하여 수동으로 질량 목록을 편집하고 스펙트럼에서 피크를 클릭하여 질량 목록에 추가하십시오.
    3. 질량 목록을 [M+H]+ m/z 값을 포함하는 뉴로펩타이드 데이터베이스와 비교하여 정확한 질량 정합을 수행합니다(± 200ppm 오차).
      참고: [M+K]+, [M+Na]+ 및 [M+NH4]+와 같은 일반적인 염 부가물도 정확한 질량 일치 대상 목록에 포함되어야 합니다.
    4. 식별된 피크를 확인하려면 관심 있는 m/z 목록을 생성하고 MS/MS 실험을 수행합니다.

3. 뉴로펩타이드의 MALDI-MS 영상화 분석

  1. 시료 준비
    참고: 임베딩 및 단면화 단계는 너무 얇아서 단면화할 수 없는 조직에는 필요하지 않습니다.
    1. 냉동 컵 반 개를 젤라틴 (37 °C, 탈 이온수 중 100 mg / mL)으로 채우고 실온에서 응고되도록하십시오. 남은 액체 젤라틴을 37°C 수조에서 따뜻하게 유지하십시오.
    2. 동물로부터 원하는 신경 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 조직을 즉시 탈이온수가 들어있는 0.6 mL 튜브에 1 초 동안 담그십시오.
      참고: 신경 조직 해부에 대해서는 1.1.2단계 참고를 참조하십시오.
    3. 조직을 고체 젤라틴 위에 놓고 나머지 냉동 컵을 액체 젤라틴으로 채 웁니다. 포셉을 사용하여 조직을 배치하십시오.
    4. cryostat 컵을 평평한 표면에 놓고 드라이 아이스로 얼립니다.
      참고: 샘플을 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오(이상적으로는 6개월 이내).
    5. 단면화 준비를 위해, 젤라틴 포매된 샘플을 몰드를 절단하여 냉동 주형으로부터 분리한다.
    6. 매립된 조직을 1 mL 탈이온수 방울을 척 상에 피펫팅하고 매립된 조직을 액적 상에 즉시 눌러서 냉동 척 상에 장착한다.
    7. 일단 얼면, 피펫은 조직 주위에 더 많은 탈이온수를 제거하여 척에 더 고정시킨다. -20°C로 설정된 냉동 박스 내부( 재료 표 참조) 내부에서 이러한 단계를 수행하십시오.
    8. 조직을 대략 두께의 한 세포(샘플 유형에 따라 8-20 μm)로 섹션하고, 각 섹션을 인듐 주석 산화물(ITO)이 코팅된 유리 슬라이드 상에 장착하고, 슬라이드의 한쪽 면을 섹션 근처에 배치하고 슬라이드의 다른 측면에 손가락을 올려 놓음으로써 유리를 천천히 따뜻하게 하고 섹션이 슬라이드에 달라붙도록 한다.
      참고: 조직 절편은 핀셋(-20°C로 냉각)으로 젤라틴의 한쪽 가장자리를 집어 들고 ITO 코팅 유리 슬라이드 위에 놓고 슬라이드의 다른 쪽에 손가락을 올려 놓고 유리를 천천히 따뜻하게 하고 섹션이 슬라이드에 달라붙도록 하여 해동 장착할 수도 있습니다.
    9. 소수성 펜을 사용하여 조직 섹션 근처에 작은 원을 그리고 원 내부의 교정제를 스팟팅하여 교정제로 사용할 샘플을 스팟팅합니다(교정 옵션에 대해서는 단계 2.1.6 참조).
    10. 슬라이드의 각 모서리를 날카로운 모서리(예: x)가 포함된 작은 모양의 화이트아웃 펜으로 표시하여 티치 포인트로 사용합니다.
    11. 유리 슬라이드를 MALDI 슬라이드 어댑터 플레이트에 넣고 스캐너를 사용하여 고해상도(≥2400 DPI) 광학 이미지 스캔을 수행합니다.
    12. 자동 분무기를 사용하여 조직 섹션에 매트릭스를 분무합니다 (분무기 세부 사항 및 지침은 재료 표 참조).
    13. 갑각류 조직에서 신경 펩티드의 MSI의 경우 매트릭스로 50% 메탄올/0.1% FA(v/v)에서 40mg/mL DHB를 사용하고, 노즐 온도를 80°C로, 속도를 1,250mm/분으로, 유량을 0.1mL/분으로, 패스 수를 12개로, 자동 분무기를 위해 각 패스 사이에 30초로 설정합니다.
  2. 데이터 수집
    1. 매트릭스와 함께 분무된 해동 장착형 조직 절편을 함유하는 완전히 건조된 표적 플레이트를 삽입한다.
    2. 레이저 직경이 래스터 스텝 크기보다 작도록 MS 이미징 수집 파일 파라미터를 설정하십시오.
    3. 스캔한 광학 이미지를 로드하고 x 티치 포인트를 사용하여 샘플 플레이트를 보정합니다. 실제 조직 절편보다 약간 더 크게 측정되는 관심 조직 영역을 정의하여 매트릭스만을 포함하는 영역도 포함한다.
    4. 계측기를 교정하고 200 - 3200 m/z 범위의 스펙트럼을 획득합니다. 원하는 뉴로펩타이드 범위를 포괄하도록 질량 범위를 조정한다.
  3. 데이터 분석
    1. 데이터를 처리하려면 MS 이미징 데이터 세트를 원하는 소프트웨어로 가져오고, 기준 제거 알고리즘을 선택하고, 총 이온 수를 사용하여 데이터를 정규화합니다.
      참고: 중앙값, RMS(평균 제곱근) 값 또는 기준 m/z 값의 강도와 같은 다른 정규화 알고리즘을 선택하면 많은 m/z 값의 공간 분포가 변경될 수 있습니다. 원하는 분석물에 가장 적합한 정규화 알고리즘을 선택합니다.
    2. 이론적 피크 목록에서 각 m/z 값에 대한 이미지를 생성하려면 뉴로펩타이드 [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+ 등이 포함된 쉼표로 구분된 값(CSV) 파일을 업로드합니다. 파일 > 가져오기를 클릭하여 최대 > 목록을 가져옵니다. 피크 목록의 이름을 지정합니다.
    3. 적절한 ppm 오차 역치를 추정하기 위해, 먼저 MS 스펙트럼에서 뉴로펩티드 피크를 수동으로 확인하고 이를 뉴로펩티드 이론적 질량과 비교한다. ppm 오류를 계산하고 파일 > 파일 속성 > 간격 너비 및 입력 ppm 오류를 클릭합니다.
    4. 드롭다운 메뉴에서 피크 목록을 선택하고 피크 목록의 모든 간격에 대해 m/z 이미지 만들기를 클릭합니다.
    5. 각 m/z 이미지의 스크린샷 저장을 클릭하여 각 m/z 이미지를 저장합니다.
      참고: 추정적 신경펩티드 식별은 분석물 신호가 주변 매트릭스가 아닌 조직 내에서만 국한되는 m/z 이미지를 식별하여 수행할 수 있습니다.
    6. 피크 ID를 확인하려면 관심 있는 m/z 목록을 생성하고 MS/MS 실험을 수행합니다.

4. de novo 시퀀싱을 이용한 신규한 추정적 뉴로펩타이드 발견

  1. 1.4.2 - 1.4.5단계를 수행합니다.
  2. PEAKS 소프트웨어에서 .csv 펩티드만 내보내기 데노보(ALC) 점수의 평균은 ≥ 75입니다.
    참고: de novo 시퀀싱을 수행하는 데 사용할 수 있는 많은 소프트웨어가 있으며, 각 소프트웨어에는 자체 점수 매기기 알고리즘이 있으므로 그에 따라 평가해야 합니다.
  3. 특정 뉴로펩티드 패밀리(19)에 속하는 뉴로펩티드를 나타내는 공지된 서열 모티프에 대해 펩티드 리스트를 검색한다.
    참고 : 모티프는 일반적으로 종에 걸쳐 잘 보존되지만, 검색 된 모티프는 샘플 유기체를 고려하여 선택되어야합니다.

5. 예측된 뉴로펩타이드 서열에 대한 전사체 마이닝

참고: 이 단계는 선택 사항이며 기존 뉴로펩타이드 데이터베이스에 추가하거나 새 뉴로펩타이드 데이터베이스를 구축하는 데만 사용됩니다.

  1. 관심있는 알려진 프리 프로 호르몬 아미노산 서열을 선택하고 tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE 을 사용하십시오.
    _TYPE=블래스트서치&SHOW_DEFAULTS=온&링크
    _LOC=blasthome)을 사용하여 nr/nt, Refseq_genomes, EST 및 TSA를 포함한 데이터베이스에 대해 미리 프로호르몬 서열을 검색합니다.
    참고: 단백질 데이터베이스에 대해 쿼리 시퀀스를 검색하려면 BLASTp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE 를 사용하십시오.
    _TYPE=블래스트서치&SHOW_DEFAULTS=온&블라스트
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. 표적 유기체(세금 ID)를 선택하고 낮은 점수 정렬을 포함하도록 기대 역치 알고리즘 파라미터를 1000 으로 변경한다.
    2. BLAST 프로그램을 실행한 다음, 상당한 정렬을 생성하는 질의와 피험자 서열 사이의 높은 상동성 점수에 대한 결과를 확인한다. 뉴클레오티드 서열이 포함된 FASTA 파일을 저장합니다.
      참고: 유사한 상동성 스코어를 갖는 몇몇 피험체 서열이 있는 경우, 추정 서열20,21을 좁히기 위해 MAFFT 정렬을 수행하십시오.
  2. Expasy Translate tool (https://web.expasy.org/translate/)를 사용하여 preprohormone 뉴클레오티드 서열을 preprohormone 펩티드 서열로 번역하십시오. C. sapidus의 경우, 유전자 코드에 대해 무척추동물 미토콘드리아를 선택합니다.
  3. SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP)를 사용하여 펩티드 서열에서 신호 펩티드 서열 및 전구호르몬 절단 부위를 확인한다.
    참고: 알려진 프리프로호르몬 처리 계획과의 상동성은 또한 프로호르몬 절단 부위를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 신호 펩티드에 대한 가능한 번역후 변형은 원하는 경우 예측될 수 있다. 술피네이터(https://web.expasy.org/sulfinator/)는 티로신 잔기의 술페이션 상태를 예측하는데 사용될 수 있다. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/)는 이황화 결합 연결성을 예측하는 데 사용될 수 있습니다.

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결과

샘플 준비 및 MS 분석을 위한 워크플로우는 그림 1에 설명되어 있습니다. 신경 조직의 해부 후, 균질화, 추출 및 탈염이 수행되어 뉴로펩타이드 샘플을 정제한다. 동위원소 라벨-기반 정량화가 필요하다면, 샘플은 라벨링되고 다시 한번 탈염된다. 생성 된 샘플은 신경 펩티드 확인 및 정량을 위해 LC-MS / MS를 통해 분석됩니다.

프로테오믹스 소프트웨어를 통해 확인된 뉴로펩티드는 양호한 펩티드 단편화 서열 커버리지를 가져야 하지만, 이것은 세계적으로 정의되거나 표준화되지 않는다. 절대 식별을 위해, 모든 아미노산은 명확한 식별과 국소화를 제공하는 단편 이온을 생성해야 한다. 이것은 또한 각 단편 이온의 강도의 확인을 위해 합성된 펩티드와 비교되어야 한다. 모든 추정적 동정에 대해 이것을 수행하기 위한 비용이 실현가능하지 않기 때문에, 식별은 일반적으로 더 많은 관찰된 단편 이온이 펩티드 식별 신뢰도를 증가시키는 신뢰에 기초하여...

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토론

신경계에서 발견되는 신경 펩티드 및 내인성 펩티드의 정확한 식별, 정량화 및 국소화는 그들의 기능을 이해하는 데 결정적이다23,24. 질량 분광법은 완전히 서열화 된 게놈이없는 유기체에서조차도이 모든 것을 달성 할 수있는 강력한 기술입니다. LC-ESI- 및 MALDI-MS의 조합을 통해 C. sapidus로부터 수집된 조직으로부터 신경펩티드를 검출, 정량화 및 국소화하는 이 프로토콜의 능력이 입증된다.

LC-ESI-MS 분석을 위한 시료 준비 중에 고려해야 합니다. MS가 민감한 기술인 반면, 신경 조직의 낮은 펩티드 농도(펨토몰 범위25까지)는 심각한 한계를 제기한다. 신중한 샘플 준비는 단백질 및 지질과 같은보다 풍부하고 간섭하는 매트릭스 성분을 제거 할뿐만 아니라 각 단계26,2...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 R01DK071801 보조금을 통해 국립 과학 재단 (CHE-1710140 및 CHE-2108223)과 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. A.P.는 NIH 화학-생물학 인터페이스 교육 보조금(T32 GM008505)에 의해 부분적으로 지원되었다. N.V.Q.는 국립 심장 폐 및 혈액 연구소에서 위스콘신-매디슨 심혈관 연구 센터 (T32 HL007936)에 이르기까지 루스 L. 키르슈타인 국립 연구 서비스 상 (Ruth L. Kirschstein National Research Service Award)에 따라 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지원을 받았다. L.L.은 NIH 보조금 R56 MH110215, S10RR029531 및 S10OD025084뿐만 아니라 위스콘신 동문 연구 재단 및 위스콘신 - 매디슨 약학부에서 제공하는 자금으로 Vilas Distinguished Achievement Professorship 및 Charles Melbourne Johnson 교수직의 자금 지원을 인정하고자합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>화학, 시약 및 소모품
2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 매트릭스Supelco39319
아세트산Fisher ChemicalA38S-500
아세토니트릴 Optima LC/MS 등급Fisher ChemicalA955-500
중탄산암모늄시그마-알드리치9830
Borane pyridineSigma-Aldrich179752
Bruker 펩타이드 보정 혼합물Bruker DaltonicsNC9846988
CapillaryPolymicro1068150019나노 플로우 컬럼 (75 µ M 내경 x 360 & 마이크로; m 외경)
Cryostat 컵Sigma-AldrichE6032어떤 컵이나 금형이라도 작동해야 합니다
  마이크로 원심 분리기 튜브Eppendorf30108434
포름 알데히드시그마 - 알드리치252549
포름 알데히드 - D2시그마 알드리치492620
포름산 옵티마 LC / MS 등급피셔 화학A117-50
젤라틴Difco214340장소 37 ° C 용융을 위한 수조
소수성 장벽 펜Vector Labs15553953
인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 유리 슬라이드Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0.8 mm (너비 x 길이 x 두께)
LC-MS 바이알ThermoTFMSCERT5000-30LVW
메탄올 옵티마 LC/MS 등급Fisher ChemicalA456-500
파라필름Sigma-AldrichP7793소수성 필름
pH 지시자 스트립Supelco109450
적린 클러스터Sigma-Aldrich343242
역상 C18 재료Waters186002350nanoflow column에 수동으로 포장
Wite-out penBIC150810
ZipTipMilliporeZ720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 REppendorf05-401-205
cryosstat- HM 550Thermo Fisher Scientific956564A
건조제드라이라이트2088701
펜치WPI501764
MALDI 스테인레스 스틸 타겟 플레이트Bruker Daltonics8280781
Pipet-Lite XLSRainin17014391200 µ L
Q Exactive Plus 하이브리드 사중극자-OrbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics
SpeedVac - SVC100SavantSVC-100D
초음파 세척기Bransonic2510R-MTH초음파 처리 초음파
균질기Fisher ScientificFB120110FB120 음파 디스펜서 with CL-18 프로브
진공 펌프- Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976극한 압력 = 1 x 10-4 Torr
Vortex MixerCorning6775
수조(37C) - Isotemp 110Fisher Scientific15-460-10
데이터 분석 소프트웨어
Expasyhttps://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysisBruker Daltonics
FlexControlBruker Daltonics
FlexImagingBruker Daltonics
PEAKS StudioBioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Labhttps://scils.de/
SignalP 5.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTnhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
프로그램=tblastn& PAGE_
TYPE=블래스트서치& SHOW_
기본값=on& LINK_LOC
=blasthome

참고문헌

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