돼지 신장과 마우스 간에서 FAHD1 단백질의 추출 및 정제

요약

이 프로토콜은 돼지 신장 및 마우스 간으로부터 푸마리아세토아세테이트 가수분해효소 도메인 함유 단백질 1(FAHD1)을 추출하는 방법을 기술한다. 열거된 방법들은 관심있는 다른 단백질에 적응될 수 있고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다.

초록

푸마리아세토아세테이트 가수분해효소 도메인-함유 단백질 1 (FAHD1)은 진핵생물에서 FAH 수퍼패밀리의 최초로 확인된 구성원이며, 미토콘드리아에서 옥살로아세테이트 데카르복실라제로서 작용한다. 이 기사에서는 돼지 신장 및 마우스 간에서 FAHD1을 추출하고 정제하는 일련의 방법을 제시합니다. 다루는 방법은 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피, FPLC를 사용한 제조 및 분석 겔 여과 및 프로테오믹 접근법입니다. 총 단백질 추출 후, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 탐구하고, FAHD1은 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 순차적 전략을 통해 추출되었다. 이러한 대표적인 접근법은 관심있는 다른 단백질(상당한 수준에서 발현됨)에 적응되고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다. 조직으로부터 정제된 단백질은 고품질 항체 및/또는 강력하고 특이적인 약리학적 억제제의 개발을 지원할 수 있다.

서론

진핵 FAH 도메인-함유 단백질 1 (FAHD1)은 이관능성 옥살로아세테이트 (OAA) 탈카르복실라제 (ODx)¹ 및 아실피루베이트 가수분해효소 (ApH)²로서 작용한다. 그것은 미토콘드리아 2에 국한되어 있으며 효소 1,2,3,4,5,6의 광범위한 FAH 수퍼 패밀리에 속합니다. 그의 ApH 활성은 단지 미미한 관련성이 있는 반면, FAHD1의 ODx 활성은 TCA 사이클 플럭스 1,7,8,9의 조절에 관여한다. OAA는 트리카르복실산 사이클에서 ....

프로토콜

모든 실험은 제도적 지침에 따라 수행되었다. 돼지 신장은 현지 슈퍼마켓에서 신선하게 얻어졌다. 간 조직은 Univ.-Doz의 감독하에 오스트리아 인스브루크 대학교 렌스벡 10, 6020 인스브루크의 생물의학 노화 연구소에서 유지된 C57BL6 야생형 마우스로부터 수확되었다. Pidder Jansen-Dürr 박사는 2013 년에 발행 된 프로젝트 리더로서 윤리적 허가를 받았습니다 (BMWF-66.008/0007-II/3b / 2013). 이 프로젝트에 대한 생쥐의 유지 보수 및 사용은 오스트리아 교육과학연구부(BMBWF)가 발행한 2020년 5월 5일부터 윤리 허가 제2020-0.242.978호에 따라 적용됩니다.

1. 준비

참고 : 프로토콜이 시작되기 전에 일반적인 화학 물질 및 물질 외에도 단백질 용해 완충액, 조조직 샘플 및 특정 항체와 같은 몇 가지 사항을 준비해야합니다.

1. 조직 순중량 100g 당 단백질 용해 완충액 250mL를 준비한다: 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg/mL 아프로티닌 및 1 mM 활성화된 오르토바나데이트를 갖는 1x PBS 250 mL. 용액을 0.22 μm 시린지 필터 유....

결과

FAHD1 단백질은 제시된 프로토콜을 사용하여 돼지 신장 및 마우스 간으로부터 추출되었다. 마우스 조직의 경우, 최종 정제 단계 후에 수 μg을 얻기 위해서는 여러 장기가 필요합니다. 이러한 이유로이 기사는 돼지 신장에서 FAHD1을 추출하는 데 중점을 둡니다.이 실험은 훨씬 더 모범적 인 실험입니다. 마우스 간에서 FAHD1의 추출은이 프로토콜의 어려움과 가능한 함정을 제시하기 위해 수행됩니다. 일반적으로 정제하려는 단백질의 높은 발현 수준을 보여주는 기관을 사용하는 것이 좋습니다. 인간 단백질 아틀라스(²² )는 모델 시스템에서의 발현을 추정하는데 도움을 줄 수 있거나, 또는 이들 수준을 평가하기 위해 상이한 조조직 용해물을 사용한 예비 웨스턴 블롯 실험을 수행할 수 있다. 모든 웨스턴 블롯 분석에 사용된 양성 대조군은 태그가 지정된 재조합 단백질이었으며, 약간 더 높은 분자량으로 실행되었다.

첫 번째 실험으로, 돼지 신장에서 FAH.......

토론

프로토콜의 중요한 단계
단백질의 취급에 대한 일반적인 지침을 따르는 것은 얼음 작업과 적당한 pH 및 소금 조건에서 작업하는 것과 같이 필수적입니다. 프로테아제 억제제의 사용은 방법에 유익한 반면, 프로테아좀 억제제의 사용은 매우 권장됩니다. 샘플을 동결 및 해동하면 항상 (적어도 부분적으로) 단백질 침전이 발생할 수 있으므로 초기 단백질 용해물의 해동 분취량 (단계 2)은 휴식없이 연속적으로 처리되어야합니다. 해동 후 원심분리 및 여과는 일반적으로 미세 침전을 제거하는 것이 좋습니다.

조직으로부터 얻은 초기 단백질 용해물은 여전히 단백질 외에 많은 물질을 함유하고 있다. 이온성 교환 크로마토그래피 컬럼은 용해물을 제거하는데 사용될 수 있다. 추출하고자 하는 단백질이 이온성 교환 컬럼에 결합하지 않더라도, 유동-관통은 입력 용액보다 훨씬 명확하고, 후속 단계에서 처리되기 쉬울 수 있다. 이것은 마우스 신장으로부터 FAHD1의 추출에 대해 도시되.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 & 마이크로; m 필터 유닛	MERCK	SLGP033RS	Millex-HP, 0.22 µ m, PES 33mm, 멸균되지 않음
0.45 µ m 필터 장치	MERCK	SLHP033NS	Millex-HP, 0.45 µ m, PES 33 mm, 멸균되지 않음
15 mL Falcon 튜브	VWR	734-0451	원심관
50 mL Falcon 튜브	VWR	734-0448	원심관
96-Well UV Microplate	Thermo-Fischer	8404	UV/VIS 투명 평면 바닥 96 웰 플레이트
아크릴아미드/비스 용액(40%, 29:1 비율)	BIO-RAD	#1610147	40% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드, 폴리아크릴아미드 gelsÄ를 던지기를 위한 29:1 (3.3% crosslinker) 해결책
; KTA FPLC 시스템	GE 헬스케어 생명 과학 / 싸이티바	-	GE 헬스케어의 FPLC 시스템을 사용; 다른 사용자 정의 버전이 존재합니다; 이 작업은 "Ä KTA pure" 시스템
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Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 단백질 농축을 위한 10 kDa	MERCK	UFC801024	원심 필터; 10 kDa 분자량 필터; 4 mL
황산암모늄 분말	MERCK	A4418	분자 생물학을 위한 황산암모늄, ≥ 99.0%
Ammoniumpersulfat 시약 등급,	아크릴아미드 겔 중합을 위한	MERCK	215589
Coomassie 브릴리언트 블루 R 250	MERCK	1125530025	쿠마시 브릴리언트 블루 R 250 (CI 42660) 전기 영동 상표 Imperial Chemical Industries PLC의 상표. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g / l, H2< / sub>O, 25 ° C)
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