이 프로토콜은 사용자가 Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 암 세포주 유래 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 데 도움이됩니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
구상체라고 불리는 3차원 (3D) 세포 응집체는 최근 몇 년 동안 시험관 내 세포 배양의 최전선이되었습니다. 세포를 2차원, 단세포 단층(2D 배양)으로 배양하는 것과는 달리, 스페로이드 세포 배양은 세포외 매트릭스 단백질의 발현, 세포 신호전달, 유전자 발현, 단백질 생산, 분화 및 증식을 포함하여 생체 내에 존재하는 생리적 세포 구조 및 특성을 촉진, 조절 및 지원한다. 3D 배양의 중요성은 종양학, 당뇨병, 줄기 세포 생물학 및 조직 공학을 포함한 많은 연구 분야에서 인정 받고 있습니다. 지난 십 년 동안 구상체를 생산하고 신진 대사 기능과 운명을 평가하기 위해 개선 된 방법이 개발되었습니다.
세포외 플럭스(XF) 분석기는 XF24 섬 포획 플레이트 또는 XFe96 스페로이드 마이크로플레이트를 사용하여 구상체와 같은 3D 미세조직에서 미토콘드리아 기능을 탐색하는 데 사용되었습니다. 그러나, XF 기술을 이용한 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 뚜렷한 프로토콜과 최적화는 상세히 설명되지 않았다. 이 백서에서는 XFe96 XF 분석기가 있는 스페로이드 마이크로플레이트를 사용하여 단일 3D 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. XF 기술은 서로 다른 암 세포주를 사용하여 크기가 다른 것뿐만 아니라 다른 부피, 세포 번호, DNA 함량 및 유형의 3D 구상체에서 세포 호흡을 구별 할 수있는 것으로 입증되었습니다.
올리고마이신, BAM15, 로테논 및 안티마이신 A의 최적의 미토콘드리아 이펙터 화합물 농도는 3D 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사의 특정 파라미터를 조사하는 데 사용됩니다. 이 백서에서는 또한 구상체에서 얻은 데이터를 정상화하는 방법에 대해 논의하고 XF 기술을 사용하여 스페로이드 대사를 탐구 할 때 고려해야 할 많은 고려 사항을 다룹니다. 이 프로토콜은 고급 시험관 내 스페로이드 모델에 대한 연구를 추진하는 데 도움이됩니다.
서론
생물학적 연구에서 시험관 내 모델의 발전은 지난 20 년 동안 빠르게 진행되었습니다. 이러한 모델에는 이제 오르간-온-칩 양식, 오가노이드 및 3D 미세조직 구상체가 포함되며, 이들 모두는 시험관내 및 생체내 연구 사이의 번역을 개선하기 위한 공통적인 초점이 되었다. 고급 시험관 내 모델, 특히 구상체의 사용은 조직 공학, 줄기 세포 연구, 암 및 질병 생물학 1,2,3,4,5,6,7 및 유전 독성 학 8,9,10, 나노 물질 독성학 11을 포함한 안전성 테스트를 포함한 여러 연구 분야에 걸쳐 있습니다
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프로토콜
그림 1: 세포 구상체 생성을 위한 그래픽 워크플로우, 세포외 플럭스 분석 및 다운스트림 분석. 네 개의 암 세포주를 단층(A)으로 선택적으로 배양하고, 조직 배양 플라스크로부터 분리하고, 초저 부착 96-웰 마이크로플레이트에 시딩하여 구상체(B)를 형성하였다. A549 폐 암종, HepG2/C3A 간 암종, SK-OV-3 난소 선암종 및 MCF-7 유방 암종 세포를 1 × 10 3-8 × 103 세포/웰에서 시딩하고 7일까지 성장시켜 단일 구상체를 형성하고 지속적인 관찰 및 평면 측정을 통해 스페로이드 시딩 밀도 및 배양 시간을 최적화하였다. 일단 형성되면, 단일 구상체를 무혈청 XF 배지로 세척하고, 폴리-D-리신 (C)으로 예비코팅된 스페로이드 분석 마이크로플레이트에 조심스럽게 시딩하였다.....
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결과
잘 형성되고 컴팩트한 구상체를 얻기 위해, 각 세포주는 시딩 밀도 및 배양 기간 동안 개별적으로 최적화되었다(도 3). A549, HepG2/C3A 및 SK-OV-3 세포주는 초기에 느슨한 응집체를 형성하였고, 이는 배양 7일 후까지 명확하게 정의된 둘레를 갖는 둥근 구상체로 진행되지 않았다. 반대로, MCF-7 세포는 3일 이내에 구상체를 형성할 수 있었다. 모든 스페로이드 모델에 대한 배양 기간 후의 초기 세포 시딩 밀도와 스페로이드 부피 사이에는 명확한 상관관계가 있었다. 스페로이드 크기 및 형태학은 시딩 밀도에 최적화되었다. 형태학과 원형성은 모든 모델에서 스페로이드 크기가 증가함에 따라 감소하기 시작했습니다. 세포주에 대한 시딩 전략은 A549 및 SK-OV-3 세포에 대해 4 × 103 세포/웰에서 최적화되었다; HepG2 / C3A 세포는 이전에 다른 곳에서 1 × 10 3 세포 / 웰로 최적화되었으며 MCF-7 세포는 모든.......
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토론
주요 결과 및 결과
이 논문은 XFe96 XF 분석기와 함께 일련의 암 유래 세포주를 사용하여 단일 3D 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 강제 응집을 위한 세포 기피제 기술을 사용하여 A549, HepG2/C3A, MCF7 및 SK-OV-3 세포 구상체의 신속한 배양을 위한 방법이 개발되고 기술된다. 이 프로토콜은 (1) 스페로이드 배양 프로토콜의 최적화 및 기술 제조업체의 특정 스페로이드 분석 마이크로 플레이트로의 스페로이드 처리 및 전달을 포함하여 XF 기술로 스페로이드 대사를 조사하는 많은 고려 사항을 해결합니다. (2) 사용되는 호흡기 화합물의 농도 및 시간 의존성 화합물 침투; (3) 사용되는 주사 전략; (4) 실험 그룹 간의 데이터를 정규화하는 방법. 이러한 모든 고려 사항은 현재 논문에서 검토되었으며 아래에서 더 자세히 논의됩니다. 이러한 방법은 XFe96 Flux 분석기를 사용하여 단일 3D 구상체를 사용하여 일관된 대사 산소 플럭스 데.......
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공개 사항
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
N.J.C는 Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)와 함께 BBSRC MIBTP CASE Award의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A549 | ECACC | #86012804 | 폐암 세포주 |
| Agilent Seahorse XF RPMI 배지, pH 7.4 | Agilent Technologies Inc. | 103576-100 | XF 분석 배지(1mM HEPES 포함), 페놀 레드, 중탄산나트륨, 포도당, L-글루타민 및 피루브산 나트륨 없음 |
| Agilent Seahorse XFe96 세포외 플럭스 분석기 | Agilent Technologies Inc. | - | 단일 스페로이드의 스페로이드 산소 흡수율 측정용 기기 |
| Antimycin A | Merck Life Science | A8674 | 미토콘드리아 호흡기 복합체 III 억제제 |
| BAM15 | TOCRIS bio-techne | 5737 | 미토콘드리아 프로트노포어 언커플러 |
| Black-walled microplate | Greiner Bio-One | 655076 | 형광 기반 분석용 |
| CELLSTAR 세포 발수 표면 96 U 웰 마이크로플레이트 | Greiner Bio-One | 650970 | 스페로이드 생성을 위한 마이크로플레이트 |
| CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석 | Promega | G9681 | 3D 마이크로조직 스페로이드의 세포 생존율 측정을 위한 |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R& D Systems, 생명공학 브랜드 | 3439-100-01 | XFe96 스페로이드 마이크로플레이트를 코팅하기 위한 분자 세포 접착제, |
| D-(+)-Glucose | , Merck Life Sciences | G8270 | 세포 배양 성장 및 XF 분석 배지 |
| Dulbecco' s DMEM(Modified Eagle Medium) | Gibco | 11885084 | HepG2/C3A 스페로이드용 배양 배지 |
| EVOS XL 코어 이미징 시스템 | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | 위상차 이미징 현미경 |
| EZ-PCR 마이코플라즈마 테스트 키트 | Biological | Industries 20-700-20 | 세포 배양에서 마이코플라스마 스크리닝 |
| FIJI는 이미지일 뿐입니다 | 된 이미지의 J 분석 | ||
| 소 태아 혈청 | Merck Life Science | F7524 | 세포 배양 배지 보충제 |
| HepG2/C3A | ATCC | #CRL-10741 | 부모 HepG2 세포주의 클론 유도체인 간 암종 세포주, |
| Lactate-Glo | Promega | J5021 | 스페리드 배양 배지 내 젖산 측정을 위한 |
| 200mM 용액) | Merk Life Sciences | 세포 배양 성장 및 XF 분석 매체를 위한 | G7513 |
| M50 실체 현미경 | Leica Microsytems | LEICAM50 | 입체 해부 micrscope; spheorid 처리에 사용됨 |
| MCF-7 | ECACC# | 86012803 | 유방 선암 세포주 |
| 올리고마이신 Streptomyces diastatochromogenes | Merck Life Science | O4876 | ATP 합성효소 억제제 |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 배양 배지에 항생제 |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트 | Initrogen | P7589 | 스페로이드의 dsDNA 분석 |
| Rotenone | Merck Life Science | R8875 | 미토콘드리아 호흡기 복합체 I 억제제 |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875091 | A549, MCF7 및 SK-OV-3에 대한 배양 배지 스페로이드 |
| Seahorse Analytics | Agilent Technologies Inc. | 빌드 421 | https://seahorseanalytics.agilent.com |
| Seahorse XFe96 스페로이드 FluxPak | Agilent Technologies Inc. | 102905-100 | 각 Seahorse XFe96 스페로이드 FluxPak 내용물: Seahorse XFe96 스페로이드 마이크로플레이트(102978-100) 6개, XFe96 센서 카트리지 6개, Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL(100840-000) 1병 |
| , 혈청학 피펫: 세포 배양을 위한 5, 10 및 25 mL | Greiner Bio-One | 606107; 607107 760107 | 소모품 |
| SK-OV-3 | ECACC | #HTB-77 | 난소 선암 세포주 |
| 피루브산나트륨(100mM 용액) | Merck Life Science | S8636 | 세포 배양 성장 및 XF 분석 보조제 |
| 배지 T75 cm2 세포 배양 플라스크 | Greiner Bio-One | 658175 | 세포 배양 유지를 위한 조직 배양 처리 플라스크 |
| TrypLExpress | Gibco | 12604-021 | 세포 해리 시약 |
| 웨이브 컨트롤러 소프트웨어 | Agilent Technologies 주식회사 | - | |
| 페이드 처리를 위한 넓은 입구가 있는 | 와이드 오리피스 팁 | STARLAB International GmbH | E1011-8400 |
참고문헌
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).
- Amann, A., et al.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.
