본 프로토콜은 복부 이뇌팔론(Dn)에서 신경독성 6-히드록시도파민(6-OHDA)을 갖는 성인 제브라피쉬의 뇌심실(ICV) 주사 및 개방 탱크 테스트를 사용하여 수영 거동 후 후유증의 장애 및 후속 회복에 대한 평가를 설명하며, 이는 비디오 추적 소프트웨어를 이용한 분석을 수반한다.
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이 논문에서
요약
초록
파킨슨 병 (PD)에서 도파민성 뉴런 손실을 지연시키는 현재의 치료법의 한계는 이러한 뉴런을 복원 할 수있는 대체 요법의 필요성을 제기합니다. 많은 노력은 현재 전임상 생체 내 모델을 사용하여 신경 재생에 대한 더 나은 이해를 지향하고 있습니다. 그러나 자기 복구를위한 이러한 재생 능력은 포유류에서는 비효율적입니다. 따라서 제브라피쉬와 같은 비포유류 동물은 지속적으로 자기 갱신하고 인간과 가까운 뇌 상동성을 가질 수있는 능력으로 인해 우수한 신경 재생 모델로 부상했습니다. 생체 내에서 신경 재생에 관여하는 세포 사건을 밝히기 위한 노력의 일환으로, 우리는 6-하이드록시도파민(6-OHDA)-유도성인 제브라피쉬 기반 PD 모델을 확립하였다. 이는 제브라피쉬 뇌의 복부 디뇌팔론(Dn)에서 도파민성 뉴런(DpN)을 특이적으로 제거하기 위해 99.96 mM 6-OHDA의 최적화된 뇌심실(ICV) 미세주입을 통해 달성되었다. 면역형광은 병변 후 3일째에 DpN 절제의 85% 이상을 나타내었고, 병변 후 30일 후 병변 부위에서 DpN의 완전한 회복을 나타내었다. 본 연구는 이동 거리 (cm)와 평균 속도 (cm / s)의 두 가지 매개 변수가 정량화 된 개방 필드 테스트를 사용하여 병변 후 제브라 피쉬 수영 행동의 손상과 후속 회복을 결정했습니다. 이동은 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 각 그룹의 개별 물고기 기록 (n = 6)을 분석하여 평가되었습니다. 연구 결과는 sham과 비교했을 때 병변 제브라 피쉬의 속도 (cm / s) 및 이동 거리 (cm)의 유의 감소 (p < 0.0001)를 보여주었습니다. 병변 된 제브라 피쉬는 30 일 후 수영 행동의 완전한 회복을 나타냈다. 본 연구 결과는 6-OHDA 병변 성인 제브라피쉬가 PD의 신경 재생 연구를 용이하게하는 재현 가능한 품질을 갖춘 우수한 모델임을 시사합니다. 신경 재생의 기초가되는 메커니즘뿐만 아니라 과정을 조절하는 내재적 및 외인성 요인에 대한 향후 연구는 PD에 대한 새로운 세포 대체 치료 전략에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
서론
파킨슨 병 (PD)은 근육 경직, 휴식 떨림 및 서맥을 특징으로하는 질병으로 세계에서 가장 빠르게 성장하는 신경 질환입니다1,2. PD의 위험과 유병률은 특히 50 세 이상의 개인에서 나이가 들수록 빠르게 증가합니다3. PD의 병인과 병인은 지금까지 잘 이해되지 않고 있다. 이것은 종종 PD의 조기 발병을 진단되지 않은 채로 남겨 두었습니다. 현재, PD 환자에서 도파민의 부족과 도파민성 뉴런 (DpN)의 손실은 운동 증상의 징후와 강하게 관련이있다4. 이 관계를 활용하여, 도파민 대체 (즉, 레보도파)로 직접 작용하거나 DpN의 손실 (즉, 심부 뇌 자극)을 보상하기 위해 여러 가지 치료법이 설계되었습니다. 이러한 치료법은 증상 적 이점을 가져 오지만 질병의 악화 과정을 수정하지는 않습니다5. 이러한 중요한 약점을 고려하여 세포 대체 요법이 제안되었습니다. 그러나 이러한 접근법의 효능은 이식편 제제, 세포 성장 조절 및 표현형 불안정성의 도전을 고려할 때 일관성이 없다. 윤리적 문제를 제기했던 세포 대체 요법은 또한 뇌종양과 원치 않는 면역 반응을 유발할 위험....
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프로토콜
본 연구는 동물 연구 및 윤리위원회 (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [참조 번호 : UiTM CARE 346/2021, 2021 년 5 월 7 일자]의 승인을 받았습니다.
참고: 6-OHDA-병변 성인 제브라피쉬 PD 모델의 표준 축산 및 유지를 위해 공개된 프로토콜22,25,26이 활용되었다. 실험은 표준화된 길이 3.2-3.7 cm의 5개월 이상 된 성인 남성 제브라피쉬(Danio rerio)를 대상으로 수행되었다.
1. 제브라피쉬 유지 보수 및 ICV 전 미세 주사 준비
- 물고기를 폭기 된 물 탱크에서 28 ± 1.0 °C의 통제 된 온도 하에서 유지하십시오. 제브라피쉬 축산 및 유지 보수를 위해 실험 전반에 걸쳐 상업용 바다 소금 (1 g / L)으로 미네랄 화 된 증류수를 사용하십시오.27.
- 45L 탱크 당 최대 25 마리의 물고기 또는 1.8 L 물 당....
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결과
본 실험은 6-OHDA를 사용한 ICV 미세주사 후 성인 제브라피쉬 수영 행동의 변화를 평가하였다. 선택의 신경 독소로서 6-OHDA를 사용하는 이유는 관심 영역에서 DpN의 특이적이고 표적화 된 절제를 생성 한 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수 없기 때문입니다 - 복부 디뇌팔론 (Dn)16. 여기서 DpN 하위 집단은 인간의 흑질적 nigra pars compacta31에서 DpN 하위 집단과 해부학적으로 유사하다.
우리의 이전 연구22에 따라, 성인 제브라피쉬의 DpN에 대한 6-OHDA ICV 미세주사의 세포 효과는 DpN 마커-티로신 하이드록실라제 (TH)의 면역조직염색을 통해 확인되었다. 관심의 주요 뇌 영역은 Dn이었고, 시전 영역 (POA), 후부 결핵 (PT) 및 시상 하부 (Hyp)로 구성되었습니다. 99.96 mM 6-OHDA가 Dn에서 가.......
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토론
본 연구는 확립 된 6-OHDA 유도 성인 제브라 피쉬 기반 PD 모델의 운동 평가를 성공적으로 시연했습니다. 전체 실험에는 ICV 미세 주사 전 준비, 제브라 피쉬의 ICV 미세 주사 및 운동 평가의 세 가지 주요 단계가 포함되었습니다. ICV 미세 주사 절차와 좋은 실험 결과에 따라 성인 제브라 피쉬의 건강한 회복을 보장하기 위해 본 연구에서 각 단계에 대한 몇 가지 좋은 관행이 권장되었습니다.
Pre-ICV 미세주사 제제: 동물 선택은 실험 전날 가장 잘 수행되었다. 성별을 확인하고 물고기의 길이를 측정했습니다. 3.2-3.7 cm의 표준화된 길이를 갖는 수컷 성인 제브라피쉬를 별도의 실험 탱크에 넣었다. 또한, 물고기는 마취 중 역류를 피하기 위해 24 시간의 금식 기간을 겪어야합니다33. 서있는 물 탱크가 설치된 어항 (네 개의 벽이 흰 종이로 덮여 있음)은 실험 전에 외부 스트레스를 줄이고 제브라 피쉬의 회복 과정을 돕기 위해.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작업은 말레이시아 고등 교육부가 기본 연구 보조금 제도 [600-IRMI / FRGS 5/3 (033/2019)]에 따라 지원했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| 아스코르브산 | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| 일회용 파스퇴르 피펫, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브, 0.2 mL | Eppendorf, 함부르크, 독일 | 30124332 | |
| 니스 원뿔형 플라스크, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, | USA P4417 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Sodium | chloride Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
| 트리카인 메탄설포네이트 (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA-version | 7.0; 비디오 추적 소프트웨어 | |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Gö ttingen, Germany | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, 함부르크, 독일 | 5192000035 | |
| Femtotip II, 멸균 주입 모세관 | Eppendorf, 함부르크, 독일 | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, 함부르크, 독일 | 5192000027 | |
| LED 휴대용 램프 | MR. DIY, 셀랑고르, 말레이시아 | 9023251 | 20 밀리암페어 |
| PELCO Pro Superalloy, 오프셋, 미세 팁 | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Shanda 수족관 히터 | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
| 온도계 | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
| 비디오 카메라 | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |
참고문헌
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L.
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재인쇄 및 허가
