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방법 논문

안정적으로 transfection된 흑색종 세포 클론의 분리

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63371

⸱

2022년 8월 4일

 ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wrocław

이 논문에서

요약

유리 실린더를 사용하여 안정적으로 형질주입된 흑색종 세포 클론을 분리하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 우리는 전체 절차의 성공에 결정적인 영향을 미칠 수 있는 실용적인 조언에 중점을 둡니다.

초록

게놈 정보에 안정적인 변화가 있는 세포 집단은 과학자들에 의해 연구 모델로 널리 사용됩니다. 반복적인 세포 transfection은 이질적인 세포 집단과 다양한 transfection 효율을 유발하여 재현성에 영향을 미칠 수 있으므로 반복적인 transfection이 필요하지 않습니다. 또한 대규모 분석에 적합합니다. 안정적인 세포 클론의 생성은 유전자 기능 및 재조합 단백질 생산에 대한 연구와 같은 광범위한 응용 분야에 유용합니다. 초기 일시적 형질주입 시 균질한 세포 집단을 얻기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. 여기에서는 유리 실린더를 사용한 단일 세포 클론의 분리에 대해 설명합니다. 이 방법은 한동안 알려져 왔지만 몇 가지 중요한 단계가 있으며 이를 무시하면 실패로 이어질 수 있습니다. 우리는 이 방법을 성공적으로 사용하여 관심 단백질(POI)을 안정적으로 과발현하거나 관심 유전자(GOI)의 녹아웃으로 클론을 얻었습니다. 약물 농도 선택의 최적화, 유리 실린더의 준비, PCR, 웨스턴 블롯 분석, 면역염색 또는 gDNA 염기서열분석(유래 클론의 유형에 따라 다름)에 의한 GOI 발현의 원하는 변화가 있는지 여부에 대한 검증과 같은 준비 단계를 설명합니다. 또한 잘 확립된 세포주의 표현형 이질성에 대해서도 논의하는데, 이는 안정적인 세포 클론을 얻는 데 문제가 될 수 있기 때문입니다.

서론

포유류 세포의 안정적인 transfection은 암 연구를 포함한 여러 세포 배양 응용 분야에서 일상적으로 사용되는 방법입니다. 일시적 형질주입에 비해 도입된 외래 유전 물질은 숙주1의 게놈에 통합되기 때문에 환경적 요인(예: 세포 포화 또는 복제 단계) 및 세포 분열로 인해 손실되지 않는다는 장점이 있습니다. 안정적으로 발현되는 세포주를 개발하는 것은 힘들고 까다로울 수 있지만, 장기간에 걸쳐 유전자를 지속적으로 발현해야 하는 경우 안정적인 세포주를 유도하는 것이 선호되는 옵션입니다. transfection의 가장 일반적인 목적은 발현의 과잉 생산 또는 하향 조절을 통해 특정 유전자 또는 유전자 산물의 기능을 연구하는 것입니다. 그러나 재조합 단백질과 유전자 요법을 생산하기 위해서는 세포 내로 외부 유전 물질을 도입해야 합니다2.

클론은 하나의 개별 세포에서 파생된 세포 집단으로 정의됩니다. 단일 세포 클론의 분리는 유전형 및 표현형 변동성을 가진 세포를 연구할 때 세포 생물학의 중요한 측면입니다. 세포 클론을 추출하기 위해 세 가지 주요 기술이 사용됩니다: 희석 기술, 클로닝 링 기술3 및 세포 분류 기술4. 각각에는 장점과 단점이 있습니다. glass cylinder 기법을 사용하여 흑색종 세포 클론을 분리하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 방법의 장점은 세포가 낮은 밀도의 세포 배양에서 적당한 클론 성장을 나타낸다는 것입니다. 더욱이, 선택된 세포는 이미 콜로니(colony)를 형성했기 때문에 이미 증식 능력을 입증했다5. 이 절차는 형질주입된 세포를 드물게 파종(diefection)하되 희석을 제한하지 않는 방식으로 큰 용기에 파종(seeding)하여 선택적 항생제가 있는 상태에서 2-3주 동안 세포가 팽창하고 콜로니를 형성할 수 있도록 합니다. 그런 다음 개별 콜로니는 콜로니 위에 배치되고 실리콘 그리스를 사용하여 용기에 부착되는 유리 실린더를 사용하여 격리할 수 있습니다. 다음으로, 세포를 트립신으로 분리한 다음 선택적 배지가 있는 상태에서 추가 배양을 위해 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.

클론의 분리를 설명하는 많은 연구가 있지만, 여기서는 클론 선택 후 2주 후 클론의 크기, 클론 분리 중 클론의 위치를 표시하는 방법, 선택을 위한 적절한 항생제 농도를 선택하는 방법과 같은 세부 사항을 보여주는 데 중점을 둡니다. 우리는 전체 절차의 성공에 결정적인 영향을 미칠 수 있는 실용적인 조언에 중점을 둡니다. 제시된 프로토콜을 통해 2-4주 이내에 안정적인 세포 클론을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 쉽고 저렴하며 복잡한 장비가 필요하지 않습니다. 우리는 GSN KO 클론 6,7,8을 포함한 많은 연구 모델을 얻을 수 있는 기술을 공유합니다.

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프로토콜

1. 약물 농도 최적화를 위한 세포 계대배양 및 파스팅

  1. 세포 배양 배지(이 경우, NaHCO3, 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS), 1%(v/v) L-글루타민 및 1%(v/v) 항생제-항진균제의 농도(1.5g/L)가 감소된 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지) 및 트립신 용액을 수조에서 37°C로 가열합니다.
  2. T25 세포 배양 플라스크에서 성장하는 A735 세포에서 세포 배양 배지를 흡인하고 폐기합니다. 세포주는 상업적 공급원에서 얻습니다.
  3. 플라스크를 1mL의 트립신 또는 PBS 용액으로 세척하여 세포에 남아 있는 세포 배양 배지를 씻어냅니다.
  4. 세포에서 트립신 또는 PBS 용액을 흡인하고 버립니다.
  5. 플라스크에 트립신 용액 1mL를 넣고 37°C에서 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 세포의 분리를 주의 깊게 관찰합니다.
  6. 3mL의 새로운 완전 세포 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하고 세포가 분리될 때 세포 배양 플라스크를 헹굽니다.
  7. 플라스크에서 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  8. 실온(RT)에서 5분 동안 800 x g 의 세포를 원심분리합니다.
  9. 상층액을 흡인하고 버립니다.
  10. 1mL의 신선한 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
  11. 세포 밀도를 계산하려면 자동 세포 계수기 또는 혈구계로 세포를 계수합니다.
  12. 적절한 크기의 배양 접시에 적절한 수의 세포를 파종합니다.
    참고: 이 실험에서는 A375 세포주의 450,000개 세포를 35mm 배양 접시에 2mL의 세포 배양 배지에 파종했습니다.

2. 선별된 약물 농도의 최적화

  1. 안정적인 세포 클론을 선택하는 데 사용할 약물의 제조업체에서 권장하는 농도 범위를 찾습니다.
    참고: 유전자 벡터를 이용한 transfection에 의해 세포에 도입된 selection gene은 세포에 select drug에 대한 저항성을 제공합니다. 1 μg/mL 농도의 퓨로마이신을 유전자 벡터의 안정적인 발현을 얻고 transfection되지 않은 세포를 제거하기 위한 선택 마커로 사용되었습니다.
  2. 96웰 플레이트의 웰에 세포를 파종하여 다음 날 50% 합류점에 도달하도록 합니다. 각 약물 농도와 처리되지 않은 대조군에 대해 3개의 웰을 준비합니다. 웰당 10,000개의 세포를 파종합니다. 세포 수는 사용 중인 세포주에 따라 다르며 경험적으로 결정해야 합니다.
  3. 24 시간 후, 제조업체가 권장하는 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도까지 완전한 배지에서 약물의 10 가지 희석액을 준비하고 세포에 첨가하십시오.
    참고: 이 경우 퓨로마이신이 사용되었습니다. 농도 범위는 0-10μg/mL였습니다. 3일마다 또는 배지에서 많은 죽은 세포가 관찰되면 새로운 배지로 변경합니다.
  4. 일주일 동안 매일 세포를 관찰하고 대조판과 관련하여 세포의 합류, 증식 및 사멸에 대해 기록하십시오.
    참고: 적절한 농도는 세포가 증식을 멈추고 즉시 세포 사멸을 일으키지 않지만 48-120시간 후에 처리된 모든 세포를 죽이는 농도입니다. 그러나 일부 세포주와 약물 조합의 경우 세포가 증식을 멈추고 사멸하는 단계가 없을 수 있습니다. 이러한 상황에서는 모든 세포를 죽이는 약물의 농도가 가장 낮을수록 선택에 적합합니다.

3. 세포 파종(cell seeding) 및 형질주입(transfection)

  1. 6웰 플레이트의 우물에 세포를 파종합니다.
    참고: 세포 배양 배지에서 세포 현탁액의 최종 부피는 2.5mL여야 합니다. 이 실험을 위해 웰당 450,000개의 세포를 파종했습니다. 세포 수는 시딩 48시간 후 합류점이 90%를 초과할 수 없도록 경험적으로 결정해야 합니다.
  2. 24 시간 동안 5 %CO2 를 함유하는 가습 분위기에서 37 ° C에서 세포를 배양한다.
    참고: 세포는 형질주입 전 24시간 동안 배양되었습니다. 그러나, 시딩 48시간 후, 세포가 보다 효율적으로 형질주입되는 것이 관찰되었다.
  3. 세포 위의 세포 배양 배지를 흡인하고 버립니다.
  4. 폐기된 배지를 예열된 무항생제 세포 배양 배지(10%(v/v) FBS, 글루타민 보충 DMEM)로 교체합니다.
    참고: 세포 배양 배지를 변경해야 하는 이유는 일부 형질 주입 시약으로 인한 세포 투과성 증가로 인해 세포로의 항생제 유입이 증가하여 세포가 사멸할 수 있기 때문입니다.
  5. transfection 시약을 항생제 및 혈청이 없는 DMEM으로 희석합니다. 폴리에틸렌이민(PEI), 지질 기반 형질주입 시약 또는 전기천공법을 사용합니다. 세포 transfection의 경우 DNA 4μg에 대해 1:2.175의 중량 비율로 2mg/mL 폴리에틸렌이민 용액을 사용합니다.
    참고: DNA 용액으로, 두 개의 플라스미드 혼합물을 CRISPR/Cas9(D10A) 시스템에서 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' 및 5'atccagctgcacggtaaaga3'와 같은 gRNA 염기서열과 함께 사용했습니다.
  6. RT에서 30분 동안 transfection 혼합물을 배양합니다.
  7. 배양 후, 6웰 플레이트의 웰에서 자라는 세포에 형질주입 혼합물을 조심스럽게 적가합니다.
  8. 5 %CO2 를 함유하는 가습 분위기에서 37 ° C에서 2-6 시간 동안 세포를 배양한다.
  9. 배지를 완전한 세포 배양 배지로 변경합니다.
  10. 다음 24 시간 동안 5 %CO2 를 함유하는 가습 된 분위기에서 37 ° C에서 세포를 배양한다.

4. 세포 클론의 생성

  1. 프로토콜의 섹션 1에 있는 지침에 따라 형질주입된 세포를 20mm 성형 그리드가 있는 150mm 직경의 배양 접시로 트립신화하고 전달합니다.
    참고: 고밀도의 경우 세포가 서로 병합되기 때문에 세포를 두 개의 세포 배양 접시로 균등하게 옮기는 것이 좋습니다. 배양 접시의 그리드는 클론을 찾고 이동을 추적하는 데 도움이 됩니다. 인쇄된 접시 계획서에는 나중에 클론의 위치를 표시할 수 있습니다(그림 1B). 또한, 배지의 제거와 공기에 대한 노출을 용납하지 않는 세포의 경우(사망/돌이킬 수 없는 손상을 초래함) 한 접시에서 더 적은 수의 콜로니를 분리하기 위해 표면적이 더 작은 더 많은 접시를 사용하는 것이 좋습니다. 이는 클론 분리 중 공기에 노출되는 시간을 줄이고 세포 탈수 가능성을 줄일 수 있습니다.
  2. 24 시간 동안 5 %CO2 를 함유하는 가습 분위기에서 37 ° C에서 세포를 배양한다.
  3. 세포 배양 배지를 선택적 항생제를 함유한 배지로 변경합니다.
    참고: 이 시점부터는 선택적 항생제가 있는 상태에서 세포를 배양하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 유전자에서 통합된 전이유전자를 절단할 가능성이 있습니다.
  4. 3일마다 또는 배지에 죽은 세포가 많이 떠 있을 때 배지를 교체하십시오.
    참고: 이 실험에서 세포는 1μg/mL의 농도로 퓨로마이신으로 배양되었습니다. 세포 클론 선택 단계는 약 2주가 소요됩니다. 클론의 형성은 도립 현미경 하에서 클론의 성장을 관찰하여 모니터링해야 하는데, 그 이유는 클론이 자라서 이웃 세포 클론과 접촉해서는 안 되기 때문입니다. 한 군체의 세포가 다른 군체와 함께 이동하고 성장하는 것을 막을 수 없습니다. 따라서 클론에서 세포 이동을 위해 플레이트를 관찰하고 접시 계획에 이에 대한 정보를 기록하는 것이 중요합니다.

5. 분리를 위한 클론 선택

  1. 10x 또는 20x 대물렌즈가 있는 도립 현미경에서 세포 클론에 대한 세포 배양 접시를 검사합니다.
    참고: 클론은 약 500-30,000개의 세포로 구성되어 있습니다. 그러나 사용된 세포주에 따라 다릅니다. 만족스러운 콜로니는 다른 세포 콜로니와 분리되어야 하며, 두 개 이상의 세포에서 매우 크고 뛰어난 클론이 발생할 수 있으므로 평균 크기여야 합니다(그림 1B).
  2. 도립 현미경을 사용하여 접시를 주의 깊게 검사하고 발견된 클론을 평가하여 적절한 군체를 찾으십시오. 선택한 클론의 위치에 마커를 놓고 마커는 아래 접시에 놓습니다. 동시에 인쇄된 접시 도면에 콜로니 현지화를 표시합니다(그림 1B).
    참고: 접시에서 약 20-30개의 식민지를 선택해야 합니다. 때로는 더 적은 수의 세포 클론이 얻어지며 이러한 경우 모두 분리되어야 합니다.

6. 유리 실린더의 준비

  1. 클론을 분리하기 전에 유리 실린더(직경 6.4mm, 높이 8mm)(그림 1C)를 첫 번째 유리 페트리 접시에 놓고 고압멸균합니다.
  2. 두 번째 유리 페트리 접시를 오토클레이브합니다.
  3. 두 번째 오토클레이브 유리 페트리 접시의 바닥에 실리콘 그리스를 얇게 바르십시오. 접시를 층류 캐비닛 아래에 놓고 자외선을 30분 동안 가하여 실리콘 그리스를 살균합니다.
    참고: 선택적으로 실리콘 그리스를 고압증기멸마할 수 있습니다.
  4. 오토클레이브 실린더를 실리콘 그리스로 코팅된 페트리 접시에 담그십시오. 이제 클론을 격리할 준비가 되었습니다.
  5. 클론을 분리한 후, 클론이 처리되는 세포 물질에 적용되는 규칙에 따라 실린더를 청소하십시오. 유전자 변형의 경우 차아염소산나트륨을 사용하여 살균합니다.
  6. 실린더를 자일렌으로 밤새 세척하여 실리콘 그리스를 제거하십시오.
  7. 크실렌 용액을 제거하기 위해 화학 후드 아래에서 탈이온수로 실린더를 세척하십시오.
  8. 실린더를 종이 타월에 올려 말리십시오.
  9. 실린더를 유리 페트리 접시에 보관하십시오.
  10. 이 설명서의 1번부터 시작하여 다음에 사용하기 전에 실린더를 준비하십시오.

7. 클론의 분리

  1. 각 웰에 0.5mL의 예열된 완전 세포 배양 배지를 포함하는 24웰 플레이트를 준비합니다.
  2. 150mm 접시에서 자라는 형질 주입된 세포를 15mL의 따뜻한 멸균 PBS로 3회 조심스럽게 세척합니다. PBS를 조심스럽게 흡인하고 폐기합니다.
  3. 멸균 핀셋을 사용하여 한쪽에 그리스가 있는 실린더를 옮깁니다. 표시된 클론 부위에서 배양 접시 바닥에 있는 실린더를 눌러 단일 세포 클론 기원의 성장하는 콜로니 주위에 격리된 웰을 만듭니다.
    알림: 실린더는 유체 누출을 방지하기 위해 바닥에 잘 달라붙어야 합니다.
  4. 각 실린더에 50μL의 트립신 용액을 추가하고 몇 분 동안 배양합니다. 효소로 세포가 손상되지 않도록 주의하세요. 식민지를 하나씩 처리하십시오. 콜로니가 다른 콜로니로 오염되지 않도록 각 실린더의 피펫 팁을 변경하는 것을 잊지 마십시오.
    참고: 배양 시간은 사용 중인 세포주에 따라 다르며 경험적으로 결정해야 합니다. 트립신 용액은 세포 분리를 용이하게 하기 위해 위아래로 피펫팅할 수 있습니다. 도립 현미경을 사용하여 세포 분리를 주의 깊게 모니터링합니다. 세포 분리 후 각 실린더에 50μL의 세포 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지합니다.
  5. 100μL의 세포 현탁액을 24웰 플레이트의 한 웰에 있는 배지로 즉시 옮깁니다.
    참고: 여기서, 클론 성장은 0.5μg/mL 농도의 선택적 항생제로 계속되었습니다.
  6. 24웰 플레이트에서 세포 클론의 성장을 모니터링하고 90% 합류점에 도달하면 6웰 플레이트로 옮깁니다. 프로토콜의 섹션 1에 있는 지침을 따릅니다. 트립신(0.5mL)과 정지 배지(1.5mL)의 부피만 변경합니다.
  7. 6웰 플레이트에서 성장하는 세포 클론을 모니터링하고 합류점에 도달하면 T12.5 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.
  8. T12.5 세포 배양 플라스크에서 세포 클론을 관찰하고, 클론이 합류점에 도달하면 자동 세포 계수기 또는 혈구계를 사용하는 것과 같은 적절한 방법으로 계대배양하고 계수합니다. 선택적 항생제, 20%(v/v) FBS 및 10%(v/v) DMSO가 포함된 70%의 완전한 배지를 포함하는 배지에서 세포의 절반을 동결합니다. 면역 염색을 위해 나머지 세포를 커버슬립(12mm x 12mm)에 파종하고 gDNA 분리 및 용해물 준비를 위해 6웰 플레이트의 2웰에 파종합니다.
    참고: A375 세포주의 경우, 커버슬립당 45,000개의 세포를 시딩하고 6웰 플레이트의 웰당 450,000개의 세포를 시딩합니다.

8. 생성된 세포 클론의 검증

  1. 면역염색
    참고: 세포에 대한 면역염색을 수행하여 관심 단백질(POI)의 발현 수준을 확인합니다. POI의 발현 수준을 비교할 수 있도록 야생형 세포를 염색하거나 대조군으로 클론을 대조군으로 동시에 염색하는 것이 중요합니다(그림 2A).
    1. 세포 배양 배지를 흡인 및 폐기합니다.
    2. 커버슬립에서 자라는 세포를 PBS로 세 번 씻습니다.
    3. 각 웰에 0.5mL의 4% 포름알데히드 용액을 첨가하여 세포를 고정하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
      참고: 항체에 따라 다른 고정 방법이 필요할 수 있습니다.
    4. PBS로 세포를 두 번 씻습니다.
    5. 세포를 투과화하려면 PBS의 0.1% Triton X-100에서 커버슬립을 RT에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 항체에 따라 다른 투과화 방법이 필요할 수 있습니다.
    6. PBS로 커버 슬립을 두 번 씻으십시오.
    7. 커버슬립을 염색실에 넣습니다9.
    8. 항체의 비특이적 결합을 피하기 위해 PBS 용액의 0.1%(v/v) Triton X-100 중 1%(w/v) BSA의 커버슬립을 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    9. 바늘과 핀셋을 사용하여 리그닌 조각의 가장자리가 있는 커버슬립을 올려 용액을 제거합니다.
    10. PBS에서 1%(w/v) BSA와 0.1%(v/v) Triton X-100의 1차 항체로 구성된 염색 용액을 준비합니다. 각 커버슬립에 용액 30μL를 떨어뜨리고 습한 습도 챔버에서 4°C에서 24시간 동안 배양합니다.
      참고: 이 실험에는 1:200 희석의 마우스 항-GSN 항체가 사용되었습니다.
    11. 바늘과 핀셋을 사용하여 리그닌 조각의 가장자리가 있는 커버 슬립을 놓아 용액을 제거합니다. 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣습니다.
    12. RT에서 5분 동안 PBS로 커버슬립을 세 번 세척합니다.
    13. PBS 용액에서 1%(w/v) BSA 및 0.1%(v/v) Triton X-100에 2차 항체 및 염료를 준비합니다. 각 커버슬립에 30μL의 용액을 떨어뜨리고 어둠 속에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
      참고: 당나귀 항 마우스 형광 표지된 2차 항체 488을 1:200 희석으로 사용하십시오. F-actin과 세포핵을 검출하기 위해 1:200 희석에서 phalloidin-Alexa Fluor 568을 사용하고 1:1000 희석에서 Hoechst 33342를 사용했습니다.
    14. 바늘과 핀셋을 사용하여 리그닌 조각의 가장자리가 있는 커버 슬립을 놓아 용액을 제거합니다. 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣습니다.
    15. 어둠 속에서 RT에서 5분 동안 PBS로 커버슬립을 세 번 세탁합니다.
    16. 커버슬립을 탈이온수로 한 번 씻으십시오.
    17. 현미경 유리에 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 장착합니다.
    18. 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 염색을 시각화하여 파생된 클론에서 발현된 POI의 수준을 설정합니다(그림 2A).
  2. 웨스턴 블롯 분석
    참고: 파생된 클론에서 POI 발현의 부족, 상승 수준 또는 저하 수준을 확인하려면 표준 조건10에서 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 야생형 세포를 분석하거나 클론을 대조군으로 동시에 분석합니다(그림 2B,C).
    1. 6웰 플레이트의 웰에서 자라는 세포를 PBS로 세 번 세척합니다.
    2. 스크레이퍼를 사용하여 세포를 선택한 완충액으로 수확하고 20초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다. 시료의 동결(-80 °C에서) 및 해동(4 °C에서)의 세 사이클을 수행합니다.
      참고: 세포골격 결합 단백질 추출 완충액[10mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1mM 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 1mM NaF, 20mM Na4P2O7, 2mM Na3VO4, 1%(v/v) Triton X-100, 10%(v/v) 글리세롤, 0.1%(w/v) SDS, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트] 또는 요소 완충액[50mM TRIS-HCl pH 7, 5%(w/v) SDS, 8.6%(w/v) 수크로스, 74mM 요소, 1mM DTT], 둘 다 1:100 프로테아제 억제제 칵테일, 1:100 세린 포스파타제 억제제 및 1:100 티로신 인산가수분해효소 억제제의 첨가.
    3. 용해물을 12,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 샘플의 단백질 농도를 측정합니다(예: BCA 분석).
      참고: 분석은 완충액 조성과의 호환성에 따라 달라집니다.
    5. 샘플의 웨스턴 블롯 분석을 수행하려면 폴리아크릴아미드 겔(7%-15%)의 각 웰에 30μg의 단백질을 로드합니다.
    6. SDS-PAGE 전기영동을 수행하고 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전달합니다.
    7. 적절한 항체로 멤브레인을 염색하여 POI 발현 수준을 시각화합니다(그림 2B, C).
      참고: 1:2000 희석에서 마우스 항-GSN 항체와 1:200 희석에서 마우스 항-GAPDH 항체를 사용했습니다. 자세한 내용은 논문을 참조하십시오 2,11. 노출 시간은 희미한 신호가 간과되지 않을 만큼 충분히 길어야 합니다(그림 2C).
  3. gDNA 분석
    참고: 현미경 및 웨스턴 블롯 기술로 파생된 클론에서 POI 발현 수준을 추정한 후 게놈 DNA를 분석해야 합니다. 얻어진 클론의 gDNA 주형에서 수득된 PCR 반응 산물의 길이를 비교하면 GOI의 염기서열이 편집되었는지 여부에 대한 정보를 얻을 수 있습니다(그림 2D).
    1. 6웰 플레이트의 웰에서 자라는 세포를 PBS로 세 번 세척합니다.
    2. 스크레이퍼를 사용하여 PBS 1mL에서 세포를 수확합니다.
    3. 5000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다.
    4. 상층액을 흡인하고 버립니다.
      참고: 펠릿은 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
    5. 시판되는 gDNA 추출 키트를 사용하여 파생 클론의 펠릿에서 gDNA를 분리합니다.
    6. CRISPR/Cas9 유전자 편집 부위에서 gRNA 타겟의 최소 300bp 업스트림 및 다운스트림을 어닐링하여 PCR 프라이머를 설계합니다.
      참고: 다음 프라이머가 사용되었습니다: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
    7. 제조업체의 지침에 따라 DNA Polymerase Master Mix를 사용하여 PCR 반응을 수행합니다.
      참고: PCR 반응 혼합물의 조성은 표 1에 나타나고, PCR 반응에 대한 열순환기 설정은 표 2에 나타나 있습니다.
    8. Tris-acetate-EDTA 완충액(40mM Tris pH 8.0, 20mM 아세트산, 1mM EDTA)의 1% 또는 2%(w/v) 아가로스 겔에서 PCR 산물을 분석합니다.
    9. GSN KO 클론의 PCR 산물 앰플리콘 길이를 CTRL KO 클론의 PCR 산물 길이와 비교(203 bp; 그림 2D).
  4. gDNA 염기서열분석
    1. CRISPR/Cas9(D10A) 플라스미드에 의해 코딩된 gRNA가 인식한 염기서열로부터 상류 및 하류의 염기서열과 어닐링(annealing)을 통해 PCR 프라이머를 설계합니다.
      참고: 디자인 프라이머는 다음과 같습니다: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3', Rev: 5'cgcggtaccgtcgactgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
    2. High-Fidelity DNA Polymerase(이러한 분석은 DNA 증폭 중 높은 정확도가 필요함)와 gDNA를 템플릿으로 사용하여 PCR을 수행합니다.
      참고: PCR 반응 혼합물의 조성은 표 3에 나타나 있으며, PCR 반응에 대한 열순환기 설정은 표 4에 나와 있습니다.
    3. 37°C에서 1시간 동안 배양하여 여러 클로닝 부위 내에서 제한 효소로 플라스미드를 선형화합니다.
      참고: 제한 분해 반응 혼합물의 조성은 표 5에 나타내었다. 어떤 플라스미드가 사용되는지는 중요하지 않습니다. pACGFP-C1은 EcoRI 효소로 선형화되었습니다.
    4. inserts의 농도를 추정하고 agarose gel 전기영동으로 plasmid를 절단합니다.
    5. DNA 조립 반응을 준비합니다.
      참고: 전통적인 복제 방법 또는 다른 방법을 사용할 수 있습니다.
    6. 유능한 박테리아를 변형시킵니다(예: 열 충격 절차에 의해)12.
    7. 플라스미드를 분리합니다(예: 제조업체의 지침 또는 인용된 프로토콜에 따라 구성물당 6개의 박테리아 콜로니에서)13.
    8. insert가 plasmid에 성공적으로 복제되었는지, 그리고 restriction digestion 및 DNA 전기영동을 통해 그 길이가 적절한지 확인합니다.
      참고: 선택한 콜로니에 인서트가 있는 플라스미드가 포함되어 있지 않은 경우, 플라스미드는 후속 박테리아 콜로니에서 분리되어야 합니다.
    9. 플라스미드 염기서열분석(plasmid sequencing)을 통한 유전자 편집을 확인합니다(그림 3).
      참고: 두 개의 유전자 대립유전자가 존재하기 때문에 각 파생 세포 클론에 대해 최소 두 개의 다른 DNA 염기서열분석 결과를 얻어야 합니다. 다배체 세포주(2n 초과)의 경우, 얻어진 세포의 모든 유전자 사본의 염기서열을 얻기 위해 더 많은 플라스미드를 염기서열분석해야 합니다. 유전자의 모든 사본의 복제된 염기서열을 가진 플라스미드가 분리될 때까지 필요한 만큼 콜로니를 분리하십시오. 연구된 유전자의 유전자 자리 수를 추정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용할 수 있습니다.
    10. 다중 염기서열 정렬 프로그램을 사용하여 GSN KO 및 CTRL KO 클론에 대해 얻은 gDNA 염기서열을 비교합니다(그림 3).
시약음량
DNA 중합효소 마스터 믹스7.5 μL
포워드 프라이머(10μM)1.5 μl
리버스 프라이머(10μM)1.5 μl
멸균수3.5 μl
지DNA10ng gDNA를 함유하는 1μl

표 1. PCR 반응 혼합물의 조성.

단계온도 [°C]시간 [분: 초]
19504:00
29500:30
35700:30
47200:45
52, 35x로 이동X
67210:00
78∞

표 2. PCR 반응을 위한 Thermocycler 설정.

시약음량
5 x High-Fidelity DNA 중합효소 완충액4 μl
dNTP(10mM)0.4 μl
포워드 프라이머(10μM)1 μl
리버스 프라이머(10μM)1 μl
멸균수12.4 μl
지DNA10ng gDNA를 함유하는 1μl
High-Fidelity DNA 중합효소0.2 μL

표 3. PCR 반응 혼합물의 조성.

단계온도 [°C]시간 [분: 초]
19800:30
29800:30
36100:30
47201:00
52단계로 이동하여 35회X
67210:00
78∞

표 4. PCR 반응을 위한 Thermocycler 설정.

시약분량
10 x 버퍼3 μl
제한 효소1 μl
멸균수20.7 μL
플라스 미드DNA의 5 μg을 함유하는 5.3 μl

표 5. 제한 소화 반응 혼합물의 조성물.

9. 세포주의 표현형 이질성을 평가합니다.

  1. POI 발현 수준을 결정하기 위해 세포의 면역염색을 수행합니다.
  2. 컨포칼 현미경에서 60x 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 확대 없이 사진을 촬영합니다.
  3. 서로 다른 수준의 세포의 분포 비율을 설정하려면 대부분의 현미경 이미지 분석 프로그램에서 일반적으로 사용할 수 있는 "과다/과소 노출" 도구를 사용하십시오. 노출이 부족한 부위를 보이는 세포를 낮은 수준의 POI를 생성하는 것으로 처리합니다. 과다 노출된 세포는 POI 발현 수준이 높은 세포로 분류하고 나머지 세포는 중간 수준에서 POI를 발현하는 세포로 분류합니다.

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결과

제시된 프로토콜을 사용하여 glass cylinder 방법을 사용하여 안정적으로 transfection된 흑색종 세포 클론의 분리에 대한 자세한 시연을 제공합니다(그림 1A). 우리의 연구는 흑색종 세포 생물학과 관련이 있으며, 우리가 사용하는 가장 일반적인 연구 모델은 부착성이 높고 침습성이 높은 A375 흑색종 라인입니다. 본 연구에서 흑색종 세포가 다른 유형의 암에 비해 높은 수준으로 겔솔린(GSN)을 생산하는 것으로 나타났기 때문에14 흑색종 진행에서 이 단백질의 역할을 조사하고 있습니다. GSN은 흑색종 세포의 운동성에 중요한 역할을 하는 액틴 결합 단백질입니다15. 그것은 6 개의 도메인으로 구성되어 있으며 동형16에 따라 82-84 kDa의 분자량을 갖습니다. GSN은 세포질, 핵 및 원형질막에 국한되어 있으며 흑색종 세포의 F-acti...

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토론

당사는 유리 실린더를 사용하여 안정적으로 transfection된 흑색종 세포 클론의 분리에 대한 자세한 설명을 제공했습니다. 유전자의 발현이 변경된 클론을 유도할 때 대조 클론을 얻는 것이 중요한데, 그 이유는 표적 변형 클론에 대해 얻은 결과를 항상 대조군에 대해 얻은 결과와 비교해야 하기 때문입니다. 이러한 방식으로, 도입된 유전자 변형과 같은 다른 요인 대신 형질주입 자체 또는 선택적 항생제를 사용한 배양이 실험 결과에 영향을 미치지 않는지 여부를 확인할 수 있습니다. 세포 클론 준비를 계획할 때 테스트된 세포주가 POI 생산에서 동질적인지 확인하는 것이 좋습니다. A375 세포의 GSN 발현과 대조적으로 대조군 클론을 얻은 후 이질성을 유지하지 않는 이질적인 POI 발현을 갖는 것(그림 2E)을 선택 시 고려해야 합니다.

클로닝 절차와 관련된 가장 일반적인...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 폴란드 국립과학센터(National Center for Science)의 지원을 받았습니다(프로젝트 #2016/22/E/NZ3/00654, AJM에 부여).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 ml 원심분리기 튜브GoogleLab ScientificG66010522
150 mm 세포 배양접시, 20 mm 그리드Falcon353025
24웰 플레이트VWR International10062-896
35 mm 배양 접시EppendorfEP0030700112
6웰 플레이트EppendorfEP0030700113
96웰 플레이트VWR 인터내셔널10062-900 
아세트산, 80% 용액Chempur115687330
AgaroseProna-AboBLE500
항생제-항진균제Gibco15240062
항-GAPDH 항체Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-47724
항-GSN 항체  - 클론 C20Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-6405
항-GSN 항체  - 클론 GS-2C4Sigma-AldrichG44896
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA3294
Color Taq PCR 마스터 믹스 (2x)EurXE2525
Control Double Nickase PlasmidSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-437281
Coverslipsbionovo16283
Dako 마운팅 미디어 클론텍S3023
DMSO -  Dimethyl sulfoxideapplichemA3672,0250
DNA 정제 키트 EurX3555-02
당나귀 안티-마우스-Alexa Fluor 488Invitrogen# A-21202
DTT - 1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10197777001
EcoRI Thermo Fisher ScientificFD0274
EDTA- 에틸렌디아민테트라아세트산 Poch (Pol-Aura)593280117
EGTA - 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸 에테르)- N,N,N',N'-테트라아세트산 Sigma-AldrichE0396
FBS - 태아 소 혈청 Gibco10270-106
Gelsolin CRISPR 플라스미드Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-401005-NIC
포름알데히드시그마-알드리치P6148
글리세롤시그마-알드리치L-4909
고포도당 Dulbecco' s 변형 된 독수리' NaHCO3 의 농도가 감소된 배지(1.5g/l);폴란드 과학 아카데미, Wrocfigure-materials-1aw, 폴란드11-500
Hoechst 33342 Thermo Fisher ScientificH3570
L-글루타민Gibco25030-024
리그닌 BionovoB-0521
Lipofectamine 3000 트랜스펙션 시약 InvitrogenL3000-008
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
Na4P2O7Sigma-AldrichP8010
NaFSigma-Aldrich450022
NEBuilder 조립 도구 http://nebuilder.neb.com/#!/
ACGFP-C1 Clontech
PageRuler Prestained Protein Ladder써모 피셔 사이언티픽 26616
Perfect 100 bp DNA ladderEurXE3134
phalloidin-Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma-AldrichP5726
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma-AldrichP0044
Phusion High-fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher ScientificF530S
Pierce BCA 단백질 분석 키트 써모 피셔 사이언티픽 23225
폴리에틸렌 (PEI)Sigma-Aldrich408727
프로테아제 억제제 칵테일Sigma-AldrichP8340
puromycinInviviGenant-pr
SDS - sodium dodecyl sulfate 시그마-알드리치L4509
실리콘 CX80 Polska
나트륨 염화물 - NaClChempur7647-14-5
나트륨 데옥시콜레이트Sigma-AldrichD6750259
자당Poch (Pol-Aura)PA-06-772090110
유리 실린더 Sigma-AldrichC3983-50EA
조직 배양 플라스크 25mLVWR International10062-868
티슈 배양 75 cm2 플라스크VWR10062-872
Trisma 베이스Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichX100
트립신 폴란드 과학 아카데미, Wrocfigure-materials-2aw, 폴란드20-500
요소Sigma-Aldrich8656
크실렌 용액Chempur115208603

참고문헌

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