방법 논문

시험관 내에서 약물 유발 간 독성 평가를위한 인간 간 미세 생리 학적 시스템

DOI:

10.3791/63389

⸱

2022년 1월 31일

 ,  ,  ,  ,  , 
1CN Bio Innovations Ltd

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

약물 유발 간 손상 (DILI)은 약물 실패의 주요 원인입니다. 간 미세생리학적 시스템(MPS)을 사용하여 화합물의 DILI 책임을 정확하게 예측하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 간 모델은 치료에 대한 세포 반응을 평가하기 위해 일차 간 세포와 번역 관련 종점의 공동 배양을 사용합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DILI는 잠재적으로 인간에게 DILI를 유발하는 것으로 알려진 1000개 이상의 FDA 승인 약물과 함께 약물 개발에서 소모의 주요 원인입니다. 안타깝게도 DILI는 약물이 임상 단계에 도달할 때까지 검출되지 않는 경우가 많아 환자의 안전을 위협하고 제약 산업에 상당한 손실을 초래합니다. 표준 2D 모델이 DILI 검출에 한계가 있다는 점을 고려하면 데이터 변환 가능성을 향상시키기 위해 더 예측 가능한 in vitro 모델을 개발하는 것이 필수적입니다. DILI의 인과 관계 및 기계 론적 측면을 자세히 이해하기 위해 인간 일차 간 실질 및 비 실질 세포 (NPC)로 구성되고 관류 상태에서 엔지니어링 된 스캐 폴드에서 3D 마이크로 조직에서 배양 된 인간 간 MPS가 개발되었습니다. 동결 보존 된 1 차 인간 간세포 (PHH) 및 Kupffer 세포 (HKC)를 최대 2 주 동안 MPS 플랫폼에서 미세 조직으로 공동 배양하고, 각 관심 화합물을 최대 4 일 동안 7 가지 시험 농도로 간 미세 조직에 반복적으로 투여했습니다. 간 기능을 평가하기 위해 기능적 간 특이적 종점(알라닌 아미노전이효소, ALT와 같은 임상 바이오마커 포함)을 분석했습니다. 다양한 DILI 중증도의 화합물에 대한 급성 및 만성 노출은 단일 및 다중 투여 미세 조직에 대한 반응을 비교하여 평가할 수 있습니다. 이 방법론은 광범위하고 경미한 간독성 화합물로 검증되었습니다. 여기에서는 간 기능 부전을 유발하기 위해 시장에서 철수 된 잘 알려진 간독성 화합물 인 피오글리타존과 트로글 리타 존에 대한 데이터를 보여줍니다. 전반적으로, 간 MPS 모델은 DILI 및 간 기능의 변화와의 연관성을 평가하는 데 유용한 도구가 될 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 모델은 새로운 화합물이 별개의 환자 하위 집합에서 어떻게 작용하는지, 독성 프로파일이 간 질환 상태 (예 : 바이러스 성 간염, 지방간 질환)에 의해 어떻게 영향을받을 수 있는지 평가하는 데 추가로 사용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DILI는 미국과 유럽에서 급성 간부전의 가장 흔한 원인으로 남아 있으며 약물 개발 과정에서 화합물 소모의 주요 원인입니다1. 거의 모든 종류의 약물은 간독성을 유발할 수 있으며, 중추 신경계 제제와 항생제는 환자2에서 DILI를 유발하는 가장 일반적인 치료법입니다. 약물 유발 간독성은 유전 적, 비 유전 적 및 환경 적 요인의 복잡한 상호 작용에 의해 유발되어 담관 세포 및 내피 세포를 포함한 간세포 및 기타 간 세포 유형의 사망을 초래합니다 1,3.

DILI 유발 인자는 예측 가능한 용량 의존적 간 손상을 유발하는 물질 또는 드물고 약물 용량, 경로 또는 투여 기간과 독립적으로 발생하지만 미국에서 모든 급성 간부전의 최대 6 분의 1을 담당하는 특이성 DILI를 유발하는 요인으로 분류 할 수 있습니다4. 불행히도 DILI는 약물이 약물 개발 과정의 임상 단계에 도달할 때까지 감지되지 않는 경우가 많습니다. 약물 유발 간 손상 순위 (또는 DILIrank)는 DILI를 유발할 가능성에 따라 4 가지 등급으로 나뉘는 1,000 개 이상의 FDA 승인 의약품으로 구성되며 환자에서의 사용을 면밀히 모니터링해야합니다5.

약물 간독성의 메커니즘을 연구하는 것은 여전히 매우 어렵기 때문에 DILI의 메커니즘을 탐구하기 위해 많은 전임상 모델이 개발되었습니다. 전임상 개발에서 DILI를 예측하는 데 사용되는 현재의 시험관 내 및 생체 내 모델은 살아있는 인체에서 복잡하고 다면적인 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하는 데 몇 가지 한계가 있습니다. 2D로 배양된 암성 간 세포주(즉, HepG2, HepaRG)는 후보 화합물6의 독성을 평가하기 위한 약물 개발 초기 단계에서 여전히 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 이러한 세포주는 단일 기증자에서 왔으며 비정상적인 수준의 간 기능을 보이며 DILI 7,8의 검출에 항상 높은 민감도를 나타내는 것은 아닙니다. 암성 간 세포주의 대안으로 PHH는 약물과의 짧은 배양 시간, 상대적으로 짧은 수명, 간 유전자 발현 손실 및 약물 대사 기능의 변화와 같은 배양에 몇 가지 제한이 존재하지만 시험관 내에서 적절하게 배양하면 인간의 간 생리학을 더 잘 나타냅니다.9,10,11 . PHH는 표준 2D 세포 배양 플레이트에서 세포외 기질 단백질에서 배양할 수 있지만 단점으로 기능의 급격한 감소는 DILI 예측12에 대한 민감도(<50%)가 낮다는 것을 의미합니다.

반면에 동물 모델에 대한 테스트는 느리고 비용이 많이 들며 인간에게 예측을 외삽하기 위해 종 간 번역이 필요합니다. 새로 개발된 대부분의 약물은 승인을 얻지 못하여 이 과정이 비용이 많이 들고 위험합니다5. 더욱이, 새로운 인간 특이적 양식을 시험하기 위해, 동물 모델은 인간 대 유전자 서열 또는 면역학적 반응 차이로 인해 덜 적합하다13.

결과적으로 보다 발전된 3차원(3D) 체외 간 모델에 대한 관심이 기하급수적으로 증가했습니다. 매달린 방울 또는 초저 부착 표면에서 중력 응집에 의해 생성된 구상 구조로서 PHH를 배양하는 것은 복합 부채를 평가하기 위한 고처리량 방법을 나타낸다14. PHH 스페로이드는 병이 있는 배경(예: 지방증 및 담즙정체)에서 DILI를 평가하는 데 사용되었습니다.15. 기질 섬유아세포(16), 3D 바이오-프린팅된 간 조직(17), 간 비실질 세포(15)를 포함하거나 포함하지 않는 간세포의 도금된 마이크로-패턴 공배양물(17), 3D 스페로이드 배양물을 포함하도록 매우 다양한 모델이 개발되었다. 그러나 이러한 모든 방법에는 여전히 단점이 있으며 생리학적으로 관련된 미세 환경에서 PHH를 배양하면 잠재적인 간독성 물질에 장기간 노출되는 것을 조사할 수 있도록 장기간 더 높은 수준의 기능을 제공할 수 있습니다. 추가적으로, 임의의 진보된 시험관 내 PHH 배양의 번역 관련성을 개선하기 위해, 임상적으로 관련된 기능적 종점 또는 독성 출력 바이오마커를 활용하여 데이터를 생체내 또는 임상 시나리오18과 비교할 수 있도록 해야 한다.

이 연구에서 우리는 시험관 내 간 모델 인 Organ-on-a-Chip (OOC)이라고도하는 MPS가 간 독성의 상세한 기계 론적 측면을 이해하는 데 사용될 수 있는지 여부를 평가했습니다. MPS는 이전에 최대 4주 동안 고기능성 3D 간 미세 조직을 유동 상태로 유지하는 것으로 나타났습니다19. 상기 시스템은 최근 FDA에 의해 시험되었으며, 약물 독성, 대사 및 세포내 축적을 수행할 때 높은 재현성을 갖는 것으로 나타났다20. 더욱이, 스페로이드 및 샌드위치 배양과 비교할 때, 시스템은 여러 약물의 독성을 검출하는데 있어서 더 안정한 기능 및 더 높은 감도를 가졌다(20). 현재까지 MPS는 ADME 21, 질병 모델링(HBV 22, NAFLD 23,24,25) 및 약물-약물 상호 작용26을 포괄하는 광범위한 응용 분야에서 사용되어 왔으며, 잠재적으로 급성 및 만성 DILI를 평가하는 데 매우 적합합니다. 여기에 제시된 기술은 보다 전통적인 세포 배양과 동물 모델 및 인간 임상 시험 간의 격차를 좁힐 수 있는 대안을 제공하며, 약물 개발 프로세스의 전임상 단계에서 후보 화합물의 간 독성 평가를 지원하기 위해 인간 생물학적 조건의 시뮬레이션으로 발전합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 작업은 엄격한 건강 및 안전 절차와 자체 실험실 위험 평가 및 SOP에 따라 실험실에서 수행되었습니다. 사용 된 모든 장비는 제조업체의 지침에 따라 서비스됩니다. 미생물 안전 캐비닛 (MBSC)은 매년 서비스되며 Ki-Discus (요오드화 칼륨)는 영국 표준에 따라 테스트됩니다. 이 프로토콜은 영국 인체 조직 당국(HTA) 행동 강령 및 지침을 따르며 사전 동의(45 CFR §46.116 및 §46.117) 및 우수 임상 관행(GLP)(ICH E6), 규제 및 윤리 위원회에 대한 일반 요구 사항을 완전히 준수하는 공급업체에서 제공하는 윤리적으로 공급된 1차 인간 세포를 사용합니다.

1. 세포 배양 배지 준비

알림: -1일째에 시딩 고급 DMEM 배지를 준비하고 4°C에서 보관하십시오. 1일째에 유지보수 고급 DMEM 배지를 준비하고 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.

  1. PHH 및 HKC 공동 배양을 위한 고급 DMEM 배지 시딩: 500mL 고급 DMEM 배지(재료 표) 1병에 칵테일 A 18mL(최종 농도 3.6%) 및 FBS 25mL(최종 농도 5%)를 보충합니다.
  2. PHH 및 HKC 공동 배양을 위한 유지보수 고급 DMEM 배지: 500mL 고급 DMEM 배지(재료 표) 1병에 칵테일 B 20mL(최종 농도 4%) 및 500nM 하이드로코르티손을 보충합니다.
    알림: 하이드로 코르티손은 사용 당일에 신선 해지며 원액 및 필요한 희석액을 준비하는 방법에 대한 단계는 아래에 언급되어 있습니다.
  3. 유지 보수 고급 DMEM 배지에서 500nM 하이드로코르티손의 제조
    1. 출발 원액(20 mM)의 제조: 1 mL 유리 바이알에 7.24 mg의 히드로코르티손(재료 표)을 칭량한다. 무게를 측정한 하이드로코르티손의 정확한 양을 기록하고 다음 계산을 사용하여 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 부피를 결정합니다.
      figure-protocol-1
    2. 작동 100 μM 히드로코르티손 원액의 제조: 5 μL의 시작 20 mM 원액을 995 μL의 고급 DMEM에 첨가한다.
      참고: 1단계의 DMSO 용액 25μL를 물 또는 매체에 희석하면 DMSO 농도가 0.5%가 됩니다. 최종 용액에서 DMSO 농도는 0.0025%입니다. 이 경우, 5 μL의 추가 부피는 총 부피의 미미한 변화를 초래한다.
    3. 고급 DMEM에서 작동하는 500nM 히드로코르티손 용액의 준비: 고급 DMEM에서 1mL의 500nM 히드로코르티손 용액을 준비하려면 100μM 히드로코르티손의 스톡 용액 5μL를 유지 관리 고급 DMEM 배지의 995μL에 추가합니다.

2. MPS 설정 및 프라이밍 (-1 일차)

  1. 컨트롤러를 세포 배양 인큐베이터의 도킹 스테이션 하우스에 연결하고 컨트롤러 뒷면에 있는 건조제 용기에 새 건조제(재료 표)가 추가되었는지 확인합니다.
    알림: 컨트롤러 장치는 시간이 지남에 따라 인큐베이터에서 수분을 끌어오고 새 건조제를 사용하여 건조한 상태로 유지됩니다.
  2. 뒤에 있는 보트 로커 스위치를 눌러 컨트롤러를 켜고 시스템이 안정화되고 압력에 도달할 때까지 5분 동안 기다립니다. 그런 다음 공압 보고서 화면을 확인하여 (i) 압력 저장소 출력이 ~2000mBar에 도달하고 (ii) 진공 저장소 출력이 ~850mBar에 도달했는지 확인합니다.
  3. 포장에서 각 플레이트를 제거하고 모든 우물을 육안으로 검사하여 가능한 결함(비계 누락, 균열 등)이 있는지 확인합니다.
  4. 드라이버(플레이트가 켜진 상태)를 도킹 스테이션에 삽입하여 도킹 스테이션과 컨트롤러에서 드라이버를 인식하는지 확인합니다. 압력 저장소 출력이 100mBar 미만으로 떨어졌고 진공 저장소 출력이 500mBar 미만으로 증가했는지 확인하십시오.
  5. 500μL의 시딩 고급 DMEM 배지(37°C로 예열)를 저장소 측에 추가하여 각 웰을 프라이밍합니다.
  6. 유체가 필터 지지대를 통과할 때까지 컨트롤러 화면(3μL/s에서 2.5분 동안 최대 흐름)에서 Prime 프로그램을 선택합니다. 알림: '상향 흐름'은 매체가 저장소에서 LC12 플레이트의 비계를 통해 위쪽으로 흐를 수 있도록 하는 컨트롤러의 설정입니다.
  7. 표면 채널을 덮기 위해 1.1mL의 추가 시딩 고급 DMEM 배지로 모든 웰을 채웁니다. 그러면 모든 웰의 전체 작업 부피가 1.6mL가 됩니다.
  8. 플레이트가있는 드라이버를 37 ° C 및 5 % CO2 인큐베이터에 놓고 도킹 스테이션에 연결하고 Incubate 프로그램을 실행하십시오.
    참고 : 실험에 사용 된 모든 프로그램 (프라임, 인큐베이트, 시드, 미디어 체인지)은 MPS 시스템에 사전 설정되어 있습니다. 씨를 뿌릴 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 접시를 프라이밍하십시오.

3. MPS에 간 세포 파종 (0 일차)

  1. 모든 PHHS 및 HKC를 사전 검증합니다. 모든 PHH 및 HKC 로트는 세포 배양 실험을 수행하기 전에 사내에서 사전 검증됩니다( 보충 자료 참조).
  2. PHHs 및 HKCs 세포의 바이알(Table of Materials)을 해동하여 바이알을 37°C 수조에서 꾸준히 유지하여 작은 얼음 조각만 남을 때까지 한다.
  3. PHH를 사전 예열된(37°C) 동결 보존 간세포 회수 배지 CHRM 배지(튜브당 최대 2개의 바이알)의 튜브에 직접 피펫팅합니다.
  4. 세포를 부드럽게 피펫팅한 다음 CHRM 1mL를 사용하여 저온관에서 남아 있는 세포를 세척합니다. 해동하고 원추형 튜브로 옮길 때 세포를 매우 부드럽게 사용하십시오.
    주의 해동 중에 바이알을 흔들지 말고 내용물을 위아래로 피펫팅하지 마십시오.
  5. 15mL 원심분리 튜브에 담긴 10mL의 얼음처럼 차가운 시딩 고급 DMEM 배지에 HKCs 세포를 부드럽게 파이펫팅합니다.
    알림: 최대 2개의 HKC 바이알을 결합할 수 있습니다.
  6. 두 세포 유형을 실온(RT)에서 100 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  7. 따뜻한 시딩 고급 DMEM 배지에 PHH를 재현탁하고 HKC를 얼음처럼 차가운 시딩 고급 DMEM 배지(세포 응집을 줄이기 위해)에 재현탁하고, 튜브에 추가된 세포 바이알당 1mL를 사용하여 세포를 얼음 위에 놓습니다. 부드러운 흔들림 동작을 사용하여 세포를 다시 부유시킵니다.
    주의 : 피펫 작용으로 PHH를 재현 탁하면 세포 사멸로 이어질 수 있으므로 다시 부유하지 마십시오.
  8. 여러 튜브의 세포 현탁액을 결합하되(해당되는 경우 - 즉, 모든 PHH가 동일한 공여자의 경우) 세포 유형을 혼합하지 마십시오.
  9. 셀 수를 세십시오. 생존율(세포 유형, PHH 및 HKC 모두에 대해 85% 이상이어야 함)과 총 세포 수를 기록합니다. 세포 생존율이 85% 미만으로 떨어지면 새로운 세포 바이알을 해동하고 세포 생존율을 재평가합니다.
  10. 다음 공식을 사용하여 세포 생존율을 계산하십시오.
    figure-protocol-2
  11. 각 웰에 파종할 세포 현탁액의 원하는 부피와 총 파종 부피를 400μL로 만드는 데 필요한 추가 시딩 고급 DMEM 배지의 부피를 계산합니다. 웰당 세포 수: 웰당 0.4 x 10 6 PHH 및 0.04 x 10 6 HKC 및 0.25 x 106 PHHs/mL의 세포 밀도, 각각 0.025 x 106 HKC / mL.
  12. 도킹 스테이션에서 드라이버를 분리하고 MBSC에 넣습니다.
  13. 위의 비계에서 정지 지점 (고정 링의 깊은 노치 아래로 내려감), 채널 및 저장소로 미디어를 흡입합니다. 배양 우물에 0.2mL의 "죽은 부피"를 남겨두고 스캐폴드 바로 위에 도달합니다. 기포가 형성되지 않도록 스캐폴드 위에서 전체 매체를 제거하지 않도록 주의해야 합니다.
  14. 400μL의 시딩 어드밴스드 DMEM 배지를 웰 챔버에 넣고 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션에 다시 넣고 배지 교환 프로그램을 3분 동안 실행합니다. 프로그램은 3 분 후에 자동으로 일시 중지됩니다.
  15. 완료되면 도킹 스테이션에서 드라이버를 분리하고 MBSC에 다시 넣습니다.
  16. 위의 비계에서 정지 지점과 각 우물의 저장소 끝까지 미디어를 흡입합니다.
  17. 튜브를 부드럽게 흔들어 PHH를 조심스럽게 재현탁시킨 다음 필요한 양의 세포 현탁액을 각 배양 우물에 추가합니다. 세포 현탁액을 조심스럽게 피펫팅하여 세포가 플레이트의 스캐폴드에 고르게 분산되도록 합니다.
    알림: 스캐폴드 전체에 걸쳐 좋은 적용 범위를 보장하려면 천천히 소용돌이 치는 동작을 사용하여 세포를 스캐폴드 위로 피펫팅합니다.
  18. 유사하게, HKC를 조심스럽게 재현탁시키고 세포 현탁액을 각 배양 웰에 추가합니다.
    알림: 느린 소용돌이 동작을 사용하여 HKC를 시드하여 비계 전체에 좋은 적용 범위를 보장합니다. 두 개의 시드 하위 단계를 분리하거나 두 세포 유형을 적절한 밀도로 미리 혼합하고 동시에 시딩할 수 있습니다.
  19. 모든 웰에 두 가지 유형의 셀이 모두 포함되어 있으면 MPS 드라이버를 물리적으로 연결하지 않고 인큐베이터의 도킹 스테이션에 놓고 1시간 동안 그대로 두십시오.
  20. 1시간 후, 400μL에 도달하기 위해 필요한 양의 추가 시드 고급 DMEM 배지로 각 웰을 채우고 시드 프로그램을 실행합니다.
  21. 2분 후 프로그램이 자동으로 일시 중지되고 인큐베이터에서 드라이버를 제거한 다음 1000μL의 Seeding Advanced DMEM 배지를 채널(웰 챔버보다 저장소 끝에 더 가까움)에 천천히 추가하여 총 부피 1.4mL를 달성합니다(채널에 200μL 데드 볼륨이 추가됨).
  22. 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 나머지 Seed 프로그램을 8 시간 동안 실행하십시오.
    알림: 흐름은 8 시간 후에 자동으로 Incubate 프로그램으로 전환됩니다.

4. 미디어 변경(1일차)

  1. 도킹 스테이션에서 드라이버를 분리하고 MBSC에 넣습니다.
  2. 웰 챔버에서 시드 고급 DMEM 배지를 정지 지점까지 제거하여 배지 교환 을 수행합니다.
  3. 400μL의 유지보수 고급 DMEM 배지를 웰 챔버에 추가하고 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션에 다시 넣고 미디어 교환 프로그램을 3분 동안 실행합니다. 프로그램은 3 분 후에 자동으로 일시 중지됩니다.
  4. 도킹 스테이션에서 드라이버를 분리하고 MBSC에서 저장소 챔버, 채널 및 스캐폴드 위의 정지 지점에서 매체를 흡입합니다. 이 시점에서 문화 우물은 죽은 볼륨으로 돌아갑니다.
  5. 1.4mL의 신선한 예열(37°C) 유지보수 고급 DMEM 배지로 저장소 챔버를 채웁니다.
  6. 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션으로 되돌리고 Incubate 프로그램을 실행하십시오.

5. 간 미세 조직 품질 관리 (QC), 배지 수집, 배지 변경 및 약물 투여 (4 일차)

  1. 4일차에 유지 관리 고급 DMEM 미디어 및 QC 검사를 사용하여 미디어 변경을 수행하여 시드가 성공했는지 확인합니다.
    참고: QC는 젖산 탈수소효소(LDH)와 요소를 측정하여 형성된 미세 조직의 상태를 확인하는 데 사용되는 프로세스입니다.
  2. QC를 실행하기 전에 테스트할 각 화합물에 대한 새로운 스톡 용액을 준비합니다(각 화합물의 용해도에 따라 유지 관리 고급 DMEM 배지 또는 0.1% DMSO를 포함하는 유지 관리 고급 DMEM 배지에서). 각 화합물에 대한 시험 농도를 산출하기 위해 그에 따라 희석액을 준비합니다.
  3. 도킹 스테이션에서 드라이버와 플레이트를 분리하고 MBSC로 전송합니다.
  4. 피펫을 사용하여 각 웰에서 50μL의 배지를 96웰 플레이트로 옮겨 샘플링 전에 LDH 분석(재료 표)을 수행하고 요소 분석(재료 표)의 경우 25μL를 수행합니다.
    알림: LDH 및 요소 분석은 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다.
  5. LDH 판독값이 2 AU/10 6 세포보다 낮고 요소가 40 μg/day/106 세포 이상인 경우 QC 후 실험을 계속합니다.
    참고: 알부민은 당일 실행하는 데 시간이 오래 걸리기 때문에 QC로 사용되지 않으며 4일째에 채취한 샘플에서 실험이 완료되면 나중에 분석됩니다.
  6. QC에 실패한 웰이 있으면 실험 설계에서 제거합니다.
  7. 실험 레이아웃이 확인되면 각 웰에서 나머지 배지를 샘플링하여 스캐폴드를 만져 세포 배양을 방해하지 않도록 합니다. 수집된 배지(사전 용량 샘플로 표시됨)를 이후 분석을 위해 -80°C에서 보관하십시오.
  8. 4.3-4.5단계에 따라 MBSC에서 미디어 변경을 수행합니다. 실험 설계에 따라 적절한 약물 농도의 유지 보수 고급 DMEM 배지로 웰을 변경하십시오.
  9. 완료되면 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션으로 되돌리고 Incubate 프로그램을 실행하십시오.

6. 미디어 수집, 미디어 변경 및 약물 투여 (6 일차)

  1. 테스트할 각 화합물에 대한 새로운 스톡 용액을 준비합니다(각 화합물의 용해도에 따라 유지 관리 고급 DMEM 배지 또는 0.1% DMSO를 포함하는 유지 관리 고급 DMEM 배지). 플레이트 계획에 따라 각 화합물에 대한 시험 농도를 산출하기 위해 그에 따라 희석액을 준비합니다.
  2. 도킹 스테이션에서 드라이버와 플레이트를 분리하고 MBSC로 전송합니다.
  3. 피펫으로 각 웰(~1mL)에서 수동으로 배지를 수집하여 스캐폴드를 만져 세포 배양을 방해하지 않도록 하고 LDH 및 요소를 분석합니다. 수집된 나머지 배지는 추후 분석을 위해 -80°C에 보관하고 투여 후 48시간 샘플에 라벨을 붙입니다.
  4. 4일째와 동일한 약물 농도로 각 웰을 재투여하고 플레이트 계획에 따라 4.3-4.5단계에 따라 배지 변경을 수행합니다.
  5. 완료되면 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션으로 되돌리고 Incubate 프로그램을 실행하십시오.

7. 실험 종료(8일차)

  1. 도킹 스테이션에서 드라이버와 플레이트를 분리하고 MBSC로 전송합니다.
  2. 피펫을 사용하여 수동으로 각 웰의 샘플 배지를 스캐폴드를 만져 세포 배양을 방해하지 않도록 합니다.
  3. 회수된 배지를 LDH 및 우레아에 대해 분석하고, 수집된 배지의 나머지는 이후 분석을 위해 -80°C에서 보관한다.
  4. CYP3A4-glo 분석 실행 중.
    1. 이 분석을 사용하여 실험 종료 시 PHH에서 시토크롬 P450 CYP3A4 활성에 대해 테스트된 약물의 효과를 측정합니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 검출 시약(CYP3A4 분석의 경우 재료 표 참조)을 재구성합니다. 검출 시약이 이전에 재구성 및 동결된 경우 -20°C 냉동고에서 꺼내 RT에서 해동합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 20mM 스톡 D- 루시페린 표준을 준비하십시오.
    4. 유지 보수 고급 DMEM 배지(웰당 발광 기질 배지 2mL)에서 루시페린 IPA를 1:1000 희석하여 작동하는 발광 기질 배지를 준비합니다.
    5. 발광 기판 매체를 사용하여 4.3-4.5단계에 설명된 대로 미디어 변경을 수행합니다. 500 μL의 발광 기판 매체를 입력 재료로 1.5mL 유리 바이알(재료 표)에 저장합니다.
    6. 드라이버를 인큐베이터의 도킹 스테이션으로 되돌리고 1.5 시간 동안 Incubate 프로그램을 실행하십시오.
    7. 제조업체의 지침에 따라 1.5mL 튜브의 배양 배지에서 D-루시페린 표준 곡선을 준비하고 배양 배지를 블랭크 또는 0μM로 사용하여 흰색 불투명 96웰 플레이트( 재료 표 참조)에 각 표준물질의 피펫 50μL를 이중으로 준비합니다.
    8. 시간이 경과하면 도킹 스테이션에서 드라이버를 제거하고 7.4.9-7.4.13단계에 따라 CYP3A4 분석용 샘플 매체를 제거합니다.
    9. 배양 후 각 웰에서 50μL의 샘플 배지를 옮기고 재료를 표준물질이 포함된 96웰 불투명 백색 루미노미터 플레이트로 옮깁니다. 표준물질과 샘플 사이의 불투명 플레이트에 최소 두 개의 빈 행을 남겨 두어 상위 표준물질과 샘플 판독값 사이의 가벼운 이월을 방지하십시오.
    10. 각 웰에 50μL의 루시페린 검출 시약을 추가하여 발광 반응을 시작합니다.
    11. 플레이트를 RT에서 플레이트 진탕기 상에서 20분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시킨다.
    12. 광도계 또는 CCD 카메라를 사용하여 발광을 기록합니다.
    13. 각 점의 평균을 취한 다음 공백의 평균을 빼서 표준 곡선을 플로팅합니다. 선의 방정식을 사용하여 나머지 샘플의 대사율(pmol/min/106 세포)을 계산하고 수행된 희석을 포함하는 것을 기억하십시오.
  5. 한 쌍의 핀셋을 사용하여 플레이트에서 스캐폴드를 제거하고 미세 조직을 방해하지 않도록 주의하면서 각 웰에 500μL의 D-PBS(Ca++ 및 Mg++ 제외)가 포함된 24웰 플레이트에 넣습니다.
  6. 도립 광학 현미경을 사용하여 각 스캐폴드의 스냅샷을 10배 배율로 촬영합니다.
  7. 제조업체의 지침에 따라 ATP 분석( 재료 표 참조)을 실행합니다.
    1. RT에서 시약을 해동합니다.
    2. 각 세척 단계에 대해 500μL의 D-PBS(Ca++ 및 Mg++ 제외)로 스캐폴드를 두 번 세척합니다.
    3. 각 스캐폴드에 120μL의 시약과 120μL의 PBS를 추가하고 빈 웰에 동일한 부피를 추가합니다(이것은 공백 역할을 함). 알루미늄 호일로 덮인 플레이트를 셰이커에 놓고 5분 동안 격렬하게(500rpm) 흔든 다음 발광 신호를 안정화하기 위해 30분 동안 배양합니다.
    4. 용해된 시료 100μL를 이중으로 투명한 평평한 바닥 96웰 분석 플레이트로 옮겨 측정합니다. 빈 웰이 고발광의 다른 측정 웰 옆에 놓이지 않도록 하십시오.
    5. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 발광을 기록한다.
    6. 샘플의 발광도를 표준물질의 발광과 비교하여 샘플에서 시약에 의해 검출된 ATP를 결정합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원고는 DILI를 평가하는 데 사용되는 간 MPS 모델을 설명합니다. MPS는 최대 4주 동안 흐름 하에서 높은 기능을 유지하는 3D 간 미세 조직의 생성을 촉진합니다. PHH / HKC는 콜라겐 코팅 스캐 폴드에 파종되어 성장 배지로 관류되는 간 미세 조직을 형성하고 QC 검사를 통과 한 후 화합물을 투여합니다. 여기에서는 구조적으로 유사하지만 DILI 심각도가 다른 두 가지 화합물인 트로글리타존과 피오글리타존에 대한 데이터를 보여줍니다.

4일째에 약물 투여 전에 형성된 간 미세 조직의 QC 검사를 평가하고 LDH 방출 및 요소 합성으로 구성됩니다(그림 1A). QC는 간 MPS가 매우 일관되고 기능하는 간 미세 조직을 생성하는지 확인하는 것을 목표로합니다. 여기에 제시된 데이터는 세 가지 실험에서 생성되었으며 낮은 연구 내 및 연구 간 변동성으로 우수한 수준의 재현성을 보여줍니다. 8일 배양 후 여러 건강 및 간 지표(알부민, 요소, CYP3A4, ATP)를 평가하고 대조군 미세 조직이 높은 수준의 간 기능과 재현성을 보여줍니다(그림 1B, C). 간 미세 조직의 조영제 현미경 검사 및 IF 염색 ( 보충 자료 참조)은 스캐 폴드의 마이크로 채널 전체에서 높은 파종 일관성을 보여주고 PHH 미세 조직에서 HKC의 분포를 나타냅니다 (그림 1D).

figure-results-1
그림 1: 간 MPS는 재현성이 높은 데이터와 일관된 미세 조직을 생성합니다. (A) 4일째의 3D 간 미세조직 QC 메트릭, 및 8일째의 연구 종료 시 기능 평가 - (B) 알부민 및 요소, (C) CY3A4 및 ATP). 데이터는 3 번의 실험에서 수집됩니다. 각 실험에서 3개의 비히클 제어 반복이 있었습니다. 표시된 데이터는 평균 ± SD, N = 9입니다. (D) DILI를 평가하기 위해 간 MPS 플랫폼에서 PHH와 HKC를 공동 배양하여 생성된 3D 간 미세 조직의 위상차 현미경(10x 및 20x) 및 IF. HKC를 시각화하기 위해, HKC를 시드하기 전에 eGFP를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입하였다( 보충 자료 참조). 대표적인 현미경 사진이 도시되어 있다. 형질도입 및 영상화는 세포 국소화를 입증하기 위한 독립형 실험으로서 수행되었고, 설명된 DILI 프로토콜로는 수행되지 않았다. HKC 세포는 실험 세포 배양에 사용하기 전에 사내에서 사전 검증되며 해동 후 활성화 수준이 낮아야 합니다. 이는 바이오마커 IL-6 및 TNF-알파를 측정함으로써 평가된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

트로글리타존은 심각한 DILI를 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 제 2 형 당뇨병 치료에 대한 면허에 따라 사용과 관련된 간 손상 빈도로 인해 시장에서 3 년 만에 FDA에 의해 철회되었습니다. 현재까지 발표 된 동물 연구는 트로글 리타 존이 심각한 간 손상을 일으킬 가능성을 예측하지 못했습니다. 이 화합물의 독성은 또한 표준 시험관내 2D 간 분석14에서 검출되지 않았다.

MPS의 간 미세 조직에 트로글 리타 존을 96 시간 동안 투여 한 결과, 트로글 리타 존에 급성 노출 된 후 ALT 및 LDH 방출과 약 15 x C max에서 알부민 및 요소 생산의 급격한 감소에 의해 검출 된 급성 독성 반응 인 Cmax driven을 유발했습니다 (그림 2A). 96시간 노출 후 샘플링한 세포 종말점(ATP 함량) 및 CYP3A4 활성(대사 생물변형 평가용)은 트로글리타존으로 인한 독성을 추가로 확인했으며 EC:50 값은 다른 종점과 매우 유사했습니다(그림 2B). MPS에서 8일 배양 후 촬영한 명시야 현미경 이미지는 상위 2개 테스트 농도에서 양성 대조군 및 트로글리타존으로 처리된 복제물에서 볼 수 있듯이 일반화된 조직 사멸/분해와 대조적으로 스캐폴드(비히클 대조군) 전체에 균일하게 파종된 건강한 간 미세 조직을 보여줍니다(그림 2C).

figure-results-2
그림 2: 여러 간독성 종점을 사용한 트로글리타존의 DILI 위험 결정. 간 미세 조직을 96 시간 동안 트로글 리타 존의 7 가지 시험 농도에 노출시키고 (A) LDH 방출, ALT 방출, 알부민 생산, 요소 합성, CYP3A4 활성 및 ATP 함량을 비교했습니다. 파란색 선 - 48시간 노출(미디어 엔드포인트만 해당), 빨간색 선 - 96시간 노출. 양성대조군은 100 μM 클로르프로마진이었다. 모든 종점은 동일한 간 MPS 배양물로부터 측정된다. 나타낸 데이터는 평균 ± SD, N=3이다. (B) 데이터에서 생성 된 E : 50 숫자 요약. N.D. = 데이터를 플롯할 수 없습니다. 라인 = 분석되지 않음. (C) 8일 배양 후 간 미세조직의 대표적인 명시야 현미경 검사(배율 10x). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

피오글리타존에 노출 된 후 간 독성도 조사되었습니다. 피오글리타존은 낮은 DILI 우려4로 알려진 화합물이며 고전적인 2D 일차 간세포 배양 및 일부 고급 3D 모델10,11에서도 간독성을 나타내지 않았습니다. 두 테스트 시점 모두에서 경미한 간독성 효과가 관찰되었습니다(그림 3). LDH 또는 ALT 방출이 검출되지 않았습니다. 그러나 48시간 후 알부민 및 요소 생성의 경미한 감소가 관찰되었으며,이는 최대 약 25xC(그림 3A)입니다. 높은 피오글리타존 농도에서도 ATP 함량의 매우 미미한 감소가 관찰되었지만 이는 유의하지 않았습니다. 용량-반응 곡선에서 생성된 EC:50 값은 그림 3B에 나와 있습니다. 현미경 검사 결과 두 가지 가장 높은 테스트 농도에서 피오글리타존에 96시간 노출된 후 약간의 미세 조직 변화가 나타났습니다(그림 3C). 결과는 경미한 DILI 우려가 있는 화합물의 독성을 검출하는 간 MPS의 능력을 보여줍니다.

figure-results-3
그림 3: 여러 간독성 종점을 사용한 피오글리타존의 DILI 위험 결정. 간 미세 조직을 96 시간 동안 피오글리타존의 7 가지 시험 농도에 노출시키고 (A) LDH 방출, ALT 방출, 알부민 생산, 요소 합성, CYP3A4 활성 및 ATP 함량을 비교했습니다. 파란색 선 - 48시간 노출(미디어 엔드포인트만 해당), 빨간색 선 - 96시간 노출. 양성대조군은 100 μM 클로르프로마진이었다. 모든 종점은 동일한 간 MPS 배양물로부터 측정된다. 나타낸 데이터는 평균 ± SD, N=3이다. (B) 데이터에서 생성 된 EC : 50 숫자 요약. N.D. = 데이터를 플롯할 수 없습니다. 라인 = 분석되지 않음. (C) 8일 배양 후 간 미세조직의 대표적인 명시야 현미경 검사(배율 10x). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

생체 내 또는 임상 시나리오(LDH 방출, 요소 합성, 알부민 생산, CYP3A4 활성, ATP 함량, ALT 방출)를 나타낼 수 있는 모든 기능적 종점 및 독성 출력 바이오마커를 평가하고 48시간 및 96시간 동안 7점 용량 범위에서 투여된 두 테스트 화합물에 대해 생성된 데이터를 확증함으로써 "간독성의 시그니처"를 산출하기 위해 히트맵이 생성되었습니다. 다양한 수준의 DILI 우려를 가진 화합물을 식별하는 데 도움이 됩니다(그림 4).

figure-results-4
그림 4 : 간 MPS로 "독성의 서명"을 결정합니다. 7점 용량 범위에 48시간 및 96시간 노출 후 6가지 기능적 간 특이적 평가변수(LDH 방출, 요소 합성, 알부민 생성, ALT 방출, CYP3A4 활성 및 ATP 함량)에서 트로글리타존 및 피오글리타존을 보여주는 히트맵. 각 값은 평균, N = 3으로 생성되고 대조군 샘플로 정규화됩니다. 색 막대의 값은 기준 컨트롤에 비해 접힌 증가를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 자료: 미세 조직의 형광 현미경 이미징 및 세포의 사전 검증 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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MPS는 시험관내에서 인간 장기의 기능 단위를 요약하도록 설계되었으며 기존 3D 세포 배양 모델(27)의 한계를 해결하기 위해 개발되었습니다. 간은 MPS를 사용하여 가장 모델링 된 기관 중 하나이며 다양한 시스템이 개발되었습니다. 인간의 간은 약물 대사 및 독성 약물 대사 산물의 생성을 담당하며, 그 기능은 화합물28의 DILI 책임 평가를 포함하여 약물 개발을 모델링하는 핵심 요소입니다. 여기에서는 간 MPS를 사용하여 DILI를 평가하는 새로운 방법을 소개했습니다. 이 프로토콜을 사용하면 분석된 각 화합물에 대해 기계론적 통찰력을 추구하여 DILI를 유발할 수 있는 방법을 결정할 수 있을 뿐만 아니라 매우 민감하고 강력한 분석이 될 수 있습니다. 간 미세 조직은 PHH와 HKC의 공동 배양 인 MPS 플레이트에서 형성되며 표준 시험관 내 간 모델20에 비해 높은 수준의 알부민 및 요소 생산뿐만 아니라 높은 수준의 CYP3A4 활성으로 고기능성입니다.

여기에 설명된 DILI 모델은 약물 개발 프로세스에서 전임상 테스트의 후반 단계에서 유용한 도구로 사용될 수 있지만 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 현재 시장에서 사용 가능한 대부분의 MPS는 처리량이 적은 플랫폼이므로 대규모 약물 스크리닝 활동에 사용하기가 더 어렵습니다. PHH와 HKC를 공동 배양하여 형성된 미세 조직으로 구성된 DILI 모델은 또한 인간 간의 복잡성을 완전히 포착 할 수 없으며 다른 유형의 세포 (예 : 면역 세포)를 통합하여 추가로 최적화하면 기존 모델에 가치를 더하는 데 도움이됩니다. 이 단일 기관 MPS는 또한 공통 매체를 공유하고 세포 또는 내분비 수준에서 장기 혼선을 허용할 수 있는 다른 장기 플랫폼과 결합될 수 있으며, 이는 간 자체에만 국한되지 않는 독성에 대한 기계론적 통찰력을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 비교적 새로운 기술과 마찬가지로 비용이 많이 들고 접근성이 제한된 것으로 간주 될 수 있습니다.

MPS는 단일 또는 다중 인간 조직의 유기형 모델을 개발하는 데 사용되는 플랫폼입니다. 이 시스템은 컨트롤러, 탯줄 케이블 및 플레이트가 삽입되는 MPS 드라이버로 구성됩니다(그림 5A). 각 간 MPS 플레이트에는 엔지니어링된 스캐폴드에서 1차 간 세포를 3D로 배양하기 위한 12개의 독립적인 개방형 웰이 있습니다. 요약하면, 시스템은 QC를 체크하고, 플레이트는 -1일째에 프라이밍되고, PHHs 및 HKC는 0일에 플레이트에 시딩된다(도 5B, 1 참조). 임베디드 마이크로 펌프는 스캐폴드를 통한 세포 배양 배지의 순환을 촉진하여 3D 마이크로조직의 형성을 촉진합니다(그림 5B, 2 참조). 형성된 마이크로조직은 4일째에 QC를 받고, 4일 동안 48시간마다 각 화합물의 상이한 농도로 투여되고, 8일째에 종말점 바이오마커에 대해 분석된다(도 5C). MPS 플레이트에서 DILI 분석의 실험 타임라인이 도 5D에 도시되어 있다.

figure-discussion-1
그림 5: 표준 DILI 분석의 미세생리학적 시스템 및 실험 타임라인. (A) 컨트롤러(1), 제대 케이블(2), 도킹 스테이션(3), MPS 드라이버(4) 및 LC12 플레이트(5)의 구성 요소가 있는 미세생리학적 시스템. (B) 1일째에 LC12 플레이트에 PHH 및 HKC를 시딩하고(1) 내장된 마이크로펌프는 스캐폴드에 시딩된 3D 마이크로조직을 통해 조정 가능한 유속으로 세포 배양 배지의 순환을 촉진합니다(2). (C) 연구가 끝날 때 비계를 철거합니다. (D) 실험 타임라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜을 수행할 때 시작하기 전에 강력한 시스템 QC 검사를 수행하고 시스템이 공압식으로 올바르게 작동하는지 확인하고 소모품을 시각적으로 검사하고 효율적으로 프라이밍하여 모든 웰에서 균일한 기능을 보장하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에는 고품질의 일차 인간 세포를 보유하는 것이 필수적이며, 간세포는 세포 배양 실험에서 일관되게 부착하고 3D 상호 작용을 형성하는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 세포를 해동하는 것도 중요한 단계인데, 이는 일차 간세포가 빠르게 세포 사멸로 이어질 수 있으므로 피펫팅 작용에 의해 재현탁되어서는 안 되기 때문입니다. 다량의 세포 파편이 3D 미세 조직 형성을 방해하기 때문에 성공적인 파종을 위해서는 세포 생존율이 85% 이상인 것이 중요합니다. 4일차에 형성된 간 미세 조직의 QC 검사도 중요하며, 범위를 벗어난 매개변수는 품질이 좋지 않은 조직 형성을 나타낼 수 있고 간단한 문제 해결을 허용할 수 있으므로 사용자는 허용 가능한 수준의 LDH 및 요소를 측정해야 합니다. 마지막으로, 세포 배양 배지에 사용되는 하이드로 코르티손은 간세포의 대사 기능을 유지하는 데 필요하기 때문에 세포 배양 기능에 영향을 줄 수있는 원치 않는 분해를 방지하기 위해 사용 당일에 신선하게 준비해야합니다.

상당한 복잡성에도 불구하고 간 MPS는 인간 간의 모든 세포 유형을 포함하지 않습니다. 생리학적 관련성을 높이기 위해 모델24,29에 세포 유형을 추가하는 것이 가능하지만, 이들은 사용 맥락에 대한 명확한 정당성과 함께 추가되어야 한다. DILI PHH를 연구하기 위해 핵심 세포 유형이며이 모델에 HKC를 통합하면 일부 면역 반응을 결정할 수 있습니다. 또한 인간 간에서 분리 된 PHH와 상업적으로 이용 가능한 동결 보존 PHH는 로트마다 약간의 변형을 나타내는 경향이 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 고품질의 세포 제제와 함께 사용될 때 재현 가능한 결과를 생성한다는 것을 여기에서 입증했습니다. 그러나 일부 로트 로트 변동이 예상되며 이는 여러 기증자를 공동으로 사용하여 더욱 극복할 수 있습니다. 이러한 한계는 PHHs의 많은 기능적 특성을 요약하고 약물 개발 공정에서 사용되어 온 iPSC로부터 분화된 간세포 유사 세포를 사용함으로써 극복될 수 있다(30). HKC는 또한 많은 변동성과 해동 시 높은 수준의 활성화를 보여줍니다. 따라서 HKC 기증자는 실험적 세포 배양(검증된 PHH와의 공동 배양)에 사용하기 전에 사내에서 사전 검증되었으며 해동 후 활성화 수준이 낮아야 합니다. 이는 바이오마커 IL-6 및 TNF-알파를 측정하여 평가한다(보충 자료 참조).

여기에 제시된 데이터는 분석이 DILI를 정확하게 검출하여 2D10,11 및 일부 3D 모델에서 검출되지 않을 수 있는 간독성 물질을 식별하는 데 도움이 될 수 있음을 확인합니다. MPS에서 생성된 데이터는 현장 간 재현성20을 포함한 공정 표준화 및 조화의 부족으로 인해 제약 산업에서 규제 제출 또는 약물 스크리닝 목적으로 표준으로 사용되지 않습니다. 여기에 시연된 데이터 및 실험적 접근 방식은 이를 해결하여 간 모델을 DILI 스크린에서 일상적이고 강력하게 사용하여 새로운 화합물의 책임을 정확하게 예측할 수 있음을 보여줍니다.

"간독성의 시그니처"를 생성하기 위해 다양한 종말점을 측정함으로써 다양한 수준의 DILI 우려가 있는 화합물(다른 시험관 내 방법으로는 검출할 수 없는 화합물 포함)과 밝혀진 독성 메커니즘을 식별하는 데 도움이 됩니다. 이 기술은 전통적인 세포 배양과 한쪽의 동물 모델과 인간 임상 시험 사이의 격차를 좁힐 수 있으며, 약물 개발 프로세스의 일부로 간 독성의 전임상 평가를위한 인간 생물학적 조건의 시뮬레이션으로 발전 할 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 저자는 CN Bio Innovations Limited의 직원입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CN Bio Innovations Ltd.가이 연구에 자금을 지원했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24웰 세포 배양 클러스터 플레이트, 플랫 바텀Corning3524
96웰 투명 어세이 플레이트, 플랫 바텀, 투명 플라스틱,Greiner655101
96웰 플레이트, 검은색 플랫 바텀Corning3915
96웰 화이트/투명 바닥 플레이트, TC SurfaceThermoScientific165306
Advanced DMEM (1x)Gibco12491015세포 배양 배지.
AssayMax 알부민 ELISA 키트AssayProEA3201-1희석 1:250. 시점 4일, 6일, 8일째.
세포 유지 관리 칵테일 B, (1차 간세포 유지 보조제)GibcoCM4000
CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석PromegaG9682희석 1:1. 시점 8일차.
Chlorpromazine HClSigma AldrichC8138
크로마콜 블루 뚜껑, 9 mm 자동시료주입기 바이알 스크류 캡ThermoScientific9-SCK(B)-ST1유리 바이알
크로마콜 바이알, 9 mm 투명 유리 스크류 바이알ThermoScientific2-SVW
클래스 2 미생물 안전 작업대 - Trimat2 1500 배기밀폐 공기 용액
원뿔형 튜브 50 mLGreiner227261
냉동 보존 간세포 회수 배지(CHRM)ThermoFisher ScientificGibco CM7000
냉동 보존 일차 인간 간세포BioIVT EuropeLot. RAS
CytoTox 96 세포 독성(LDH) 분석 키트PromegaG1781희석 - 없음. 시점 4일, 6일, 8일
> 그래프와 EC:50 곡선을 생성하는 데 사용된 데이터 분석 모델은 비선형 회귀(곡선 맞춤) 비대칭 시그모이드, 5PL, 여기서 X는 로그(농도GraphPad Prism 9
일회용 PES 필터 유닛 500mLFisher Scientific15913307
일회용 피펫 세면대 50mlFisher Scientific12369175
DMSO(Dimethyl sulfoxide)시그마 알드리치시그마 D2650
둘베코' s Ca2+ 및 Mg2+ (D-PBS) 없는 인산염 완충 식염수ThermoFisher Scientific14190-144
이지 리더 원뿔형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 15 mL피셔 사이언티11889640
태아 소 혈청Gibco10500064
Human ALT ELISA KitAbcam  ab 234578희석 1:5. 시점: 6일차와 8일차.
인간 냉동 보존된 Kupffer 세포Lonza EuropeLot. 190088KC
하이드로코르티손MerckH0888-1G
인큐베이터 모델: New Brunswick  Galaxy 170 S, 뉴브런즈윅  갤럭시 170 R 및 CellXpert® C170입니다.EppendorfAll은 매년 서비스를 제공하며, 요청 시 서류를 사용할 수 있습니다.
도립 현미경Leica DMIL LED
MPS는 OOC(Organ-on-a-Chip)로 알려져 있습니다.Bio Innovations Ltd.
MPS LC-12 플레이트CN Bio Innovations Ltd.
Neubauer Improved C-Chip 일회용 혈구계(2채널)Cambridge BioscienceDHC-N01-50
P450-Glo CYP3A4 분석 및 스크리닝 시스템PromegaV9002희석 - 없음. 시점: 8일차
PhysioMimix MPS 플랫폼CN Bio Innovations Ltd.
PioglitazoneMedChemExpress TocrisHY-13956/CS-1700
Quantichrom Urea Assay Kit – 생물 검정 시스템생물 검정 시스템DY970-05초기 판독값이 너무 높으면 희석 1:2. 시점: 4일, 6일, 8일째.
모든 그래프를 분석하고 생성하는 데 사용된
Stripettes 10 mLFisher Scientific11839660
Stripettes 25 mLFisher Scientific11839181
TroglitazoneMedChemExpress Tocris97322-87-7
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Tubes 1.5 mLGreiner616201
계량 저울 - 모델 PA214C 및 AV213COhaus Corp
, , , , 째 픽 CN : , 실리카겔 Sigma-Aldrich S7625 소프트웨어는 GraphPad Prism 9 Thawing Plate Cocktail A, (1차 간세포 해동 및 도금 보조제)Gibco CM3000이었습니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
  2. Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
  3. Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
  4. Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
  5. Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403(2021).
  6. Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
  7. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
  8. Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  9. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
  10. Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
  11. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  12. Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148(2016).
  13. Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
  14. Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
  15. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  16. Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
  17. Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
  18. Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
  19. Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
  20. Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
  21. Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
  22. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682(2018).
  23. Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
  24. Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
  25. Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
  26. Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
  27. Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407(2020).
  28. Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
  29. Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
  30. Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083(2021).

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