Method Article

연질 물질 나노인덴테이션을 위한 실험 및 데이터 분석 워크플로우

DOI:

10.3791/63401

⸱

January 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 하이드로겔 및 세포를 포함한 연질 물질 나노인덴테이션 실험을 위한 완전한 워크플로우를 제공합니다. 첫째, 힘 분광법 데이터를 획득하기 위한 실험 단계가 자세히 설명되어 있습니다. 그런 다음 이러한 데이터의 분석은 GitHub에서 무료로 다운로드할 수 있는 새로 개발된 오픈 소스 Python 소프트웨어를 통해 자세히 설명됩니다.

Abstract

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나노인덴테이션은 마이크로메트릭 힘 프로브를 사용하여 연질 생체 재료 및 세포의 국부적 기계적 특성을 정량화하는 실험 기술의 한 종류를 말합니다. 이 접근법은 기계 생물학, 생체 재료 설계 및 조직 공학 분야에서 중심적인 역할을 수행하여 단일 세포 크기 (μm)에 필적하는 해상도로 연질 재료의 적절한 기계적 특성을 얻습니다. 이러한 실험 데이터를 얻는 가장 인기있는 전략은 원자력 현미경 (AFM)을 사용하는 것입니다. 이 기기는 힘(pN까지) 및 공간(sub-nm)에서 전례 없는 분해능을 제공하지만 영률(E)과 같은 기계적 특성의 적분 지표의 일상적인 측정을 방해하는 복잡성으로 인해 유용성이 제한되는 경우가 많습니다. 광섬유 감지 기술을 기반으로 하는 것과 같은 차세대 나노인덴터는 최근 μm 공간 분해능으로 nN 이하 힘을 적용할 수 있는 동시에 통합이 용이하여 하이드로겔 및 세포의 국부적 기계적 특성을 조사하는 데 적합하다는 점에서 인기를 얻고 있습니다.

이 프로토콜에서는 상용 페룰 탑 광섬유 감지 나노인덴터를 사용하여 하이드로겔 및 세포에 대한 나노인덴테이션 데이터를 획득하는 실험 절차를 자세히 설명하는 단계별 가이드를 제공합니다. 일부 단계는 본원에 사용된 기기에 특정되는 반면, 제안된 프로토콜은 다른 나노인덴테이션 장치에 대한 가이드로서 취해질 수 있으며, 일부 단계는 제조업체의 가이드라인에 따라 적응될 수 있습니다. 또한 나노인덴테이션 데이터 분석을 위한 사용자 친화적인 그래픽 사용자 인터페이스를 갖춘 새로운 오픈 소스 Python 소프트웨어가 제공되어 잘못 획득된 곡선의 스크리닝, 데이터 필터링, 다양한 수치 절차를 통한 접점 계산, 기존의 E 계산, 특히 단일 세포 나노인덴테이션 데이터에 적합한 고급 분석이 가능합니다.

Introduction

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생물학에서 역학의 근본적인 역할은 오늘날 확립되어 있습니다 1,2. 전체 조직에서 단일 세포에 이르기까지 기계적 특성은 조사중인 생체 재료의 병태 생리 학적 상태를 알릴 수 있습니다 3,4. 예를 들어, 암에 의해 영향을받는 유방 조직은 건강한 조직보다 뻣뻣하며, 이는 인기있는 촉진 테스트5의 기초가되는 개념입니다. 특히, 최근 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 인한 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)는 SARS-CoV-2-순진한 개인의 혈액 세포와 비교하여 적혈구 변형성 감소, 림프구 및 호중구 경직 감소를 포함한 혈액 세포의 기계적 특성 변화로 강조되는 것으로 나타났습니다6.

일반적으로 세포와 조직의 역학은 본질적으로 얽혀 있습니다 : 각 조직은 구성 세포와 세포 외 기질 (ECM)5의 특성에 동시에 영향을 미치고 의존하는 특정 기계적 특성을 가지고 있습니다. 이....

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Protocol

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1. 나노인덴테이션 측정을 위한 기질/세포의 준비

  1. 나노인덴테이션 실험을 위한 PAAm 하이드로겔/세포 준비를 위한 보충 프로토콜 에 제공된 단계를 따르십시오. 절차는 그림 2에 요약되어 있습니다.
    참고: PAAm 하이드로겔은 기계생물학 분야에서 사용되는 가장 일반적인 하이드로겔이기 때문에 선택되었습니다. 그러나, 상기 프로토콜은 모든 유형의 히드로겔(25 )에 동일하게 적용가능하다( 방법의 논의, 변형 참조).

2. 장치 시작, 프로브 선택 및 프로브 교정

  1. 장치를 시작하기 위한 보충 프로토콜에 제공된 단계를 따릅니다. 광섬유 페룰 탑 나노인덴터의 작동에 대한 기술적 세부 정보는 다음 참조17,18을 확인하십시오.
  2. 아래 설명된 대로 나노인덴테이션 프로브를 선택합니다.
    참고: 이 프로토콜에 사용되는 것과 같이 상업적으로 이용....

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Results

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프로토콜에 따라 F-z 곡선 세트가 얻어집니다. 데이터 세트에는 양호한 곡선과 분석을 계속하기 전에 폐기해야 할 곡선이 포함될 가능성이 큽니다. 일반적으로 곡선의 모양이 그림 4A에 표시된 것과 다른 경우 버려야 합니다. 그림 5AI는 NanoPrepare GUI에 업로드된 예상 E 0.8 KPa35의 소프트 PAAm 하이드로겔에서 얻은 ~100개의 곡선 데이터 세트를 보여줍니다. 대부분의 곡선은 명확하고 평평한 기준선, 전이 영역 및 재료(13)의 겉보기 강성에 비례하는 경사 영역을 나타냅니다. 그러나 소수의 곡선은 기준선의 부재, 접촉 누락 또는 경사 기준선과 같이 그림 4A에 표시된 형상의 변화를 보여줍니다. 이러한 곡선은 NanoPrepare(그림.......

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Discussion

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이 프로토콜은 하이드로겔과 단일 세포 모두에서 상업적으로 이용 가능한 페룰 탑 나노인덴터를 사용하여 힘 분광법 나노인덴테이션 데이터를 강력하게 획득하는 방법을 보여줍니다. 또한 나노인덴테이션 데이터 분석을 위한 정확한 워크플로를 포함하는 Python으로 프로그래밍된 오픈 소스 소프트웨어의 사용에 대한 지침이 제공됩니다.

프로토콜의 중요한 단계
다음 단계는 이 프로토콜을 따를 때 특히 중요한 것으로 확인되었습니다.

샘플 준비

측정을 시작하기 전에 측정의 제한 사항을 염두에 두고 샘플을 준비하는 것이 중요합니다. 즉, 샘플은 표면에 부착되어야하며 가능한 한 평평해야합니다. 이는 하이드로겔과 같이 세포처럼 표면에 자연적으로 부착되지 않는 샘플을 준비할 때 특히 중요합니다. 첫째, 샘플이 용액에 떠 있으면 측정을 방해하고 잠재적으로 프로브가 손상될 수 .......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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GC와 MAGO는 CeMi의 모든 회원을 인정합니다. MSS는 EPSRC 프로그램 보조금(EP/P001114/1)을 통해 지원을 인정합니다.

GC : 소프트웨어 (소프트웨어 개발 및 알고리즘에 대한 기여), 공식 분석 (나노인덴테이션 데이터 분석), 검증, 조사 (폴리 아크릴 아미드 겔에 대한 나노 압흔 실험), 데이터 큐레이션, 작성 (원본 초안, 검토 및 편집), 시각화 (그림 및 그래프). MAGO : 조사 (젤 및 세포 샘플 준비, 세포에 대한 나노인덴 테이션 실험), 쓰기 (원본 초안, 검토 및 편집), 시각화 (그림 및 그래프). NA : 검증, 작성 (검토 및 편집). IL : 소프트웨어 (소프트웨어 개발 및 알고리즘에 대한 기여), 검증, 작성 (검토 및 편집); MV : 개념화, 소프트웨어 (원본 소프트웨어 및 알고리즘의 설계 및 개발), 검증, 리소스, 작성 (원본 초안, 검토 및 편집), 감독, 프로젝트 관리, 자금 조달 MSS : 리소스, 작성 (검토 및 편집), 감독, 프로젝트 관리, 자금 조달. 모든 저자는 최종 원고를 읽....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12mm 커버 슬립VWR631-1577P
35mm 세포 처리 배양 접시Greiner CELLSTAR627160
아크릴 아미드시그마 - 알드리치A4058
아크릴 실란알파 AesarL16400
과황산 암모늄Merk7727-54-0
BisacrylamideMerk110-26-9
Chiaro 나노 인덴터광학 11 Life  카톨로그 번호 없음
에탄올일반
태아 소 혈청Gibco16140071
고혈당 DMEMGibco11995065
이소프로판올일반
KimwipeKimberly Clark21905-026
현미경 유리 슬라이드VWR631-1550P
MilliQ systemMerk MilliporeZR0Q008WW
OP1550 간섭계Optics11 수명카탈로그 번호
없음 광학 11 수명 프로브(k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5um)광학 11 수명카톨로그 번호 없음
광학 11 수명 프로브(k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)광학 11 수명카톨로그 번호
없음 페니실린/스트렙토마이신Gibco15140122
RainX 방수 RainX26012
표준 페트리 접시(90mm)Thermo Scientific101RTIRR
테트라메틸에틸렌디아민Sigma-Aldrich110-18-9
진공 건조제Thermo Scientific531-0250
Software
데이터 수집 소프트웨어(v 3.4.1)Optics 11 Life
GitHub Desktop(선택 사항)Microsoft
Python 3Python Software Foundation
Visual Studio Code(선택 사항)Microsoft

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  3. Gu....

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