망막병증의 마우스 모델에 대한 광학 간섭 단층 촬영의 적용

Summary

여기에서는 마우스에서 망막병증의 진단 및 정량적 측정을 용이하게 하기 위해 광학 간섭 단층 촬영을 사용하는 생체 내 이미징 기술에 대해 설명합니다.

Abstract

광학 간섭 단층 촬영 (OCT)은 망막 병증 진단을위한 비 침습적 방법을 제공합니다. OCT 기계는 망막 두께를 계산할 수 있는 망막 단면 이미지를 캡처할 수 있습니다. OCT는 임상 실습에서 널리 사용되지만 기초 연구에서의 적용은 특히 생쥐와 같은 작은 동물에서 널리 퍼지지 않습니다. 안구의 크기가 작기 때문에 생쥐에서 안저 영상 검사를 수행하는 것이 어렵습니다. 따라서 작은 동물에 대한 OCT 영상을 수용하기 위해서는 특수 망막 영상 시스템이 필요합니다. 이 기사에서는 OCT 검사 절차를 위한 작은 동물 전용 시스템과 이미지 분석을 위한 자세한 방법을 보여줍니다. 초저밀도 지단백질 수용체(Vldlr) 녹아웃 마우스와 C57BL/6J 마우스의 망막 OCT 검사 결과가 제시됩니다. C57BL/6J 마우스의 OCT 이미지는 망막층을 나타낸 반면, Vldlr 녹아웃 마우스의 이미지는 망막하 신생혈관하 및 망막 얇아짐을 보여주었습니다. 요약하면, OCT 검사는 마우스 모델에서 망막병증의 비침습적 검출 및 측정을 용이하게 할 수 있습니다.

Introduction

광학 간섭 단층 촬영 (OCT)은 조직 1,2,3,4,5,6,7,8, 특히 망막 9,10,11,12의 비 침습적 검사를 위해 생체 내 고해상도 및 단면 이미징을 제공 할 수있는 이미징 기술입니다. . 또한 망막 두께 및 망막 신경 섬유 층 두께와 같은 몇 가지 중요한 바이오 마커를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. OCT의 원리는 샘플로부터 반사된 빛의 일관성으로부터 단면 조직 정보를 획득하고 컴퓨터 시스템⁽⁷)을 통해 그래픽 또는 디지털 형태로 변환하는 광학 간섭 반사 측정법이다. OCT는 망막 장애 환자의 진단, 후속 조치 및 관리를 위한 필수 도구로 안과 클리닉에서 널리 사용됩니다. 또한 망막 질환의 발병 기전에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

임상 응용 외에도 OCT는 동물 연구에도 사용되었습니다. 병리학이 형태학적 특성화의 황금 표준이지만 OCT는 비침습적 생체 내 영상 및 종단 추적 관찰의 장점이 있습니다. 또한, OCT는 망막병증 동물 모델 11,13,14,15,16,17,18,19,20에서 조직병리학과 잘 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 마우스는 생물 의학 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 동물입니다. 그러나 작은 안구는 마우스에서 OCT 이미징을 수행하는 데 기술적인 문제를 제기합니다.

마우스^21,22에서 망막 영상에 처음 사용 된 OCT와 비교하여 작은 동물의 OCT는 이제 하드웨어 및 소프트웨어 시스템과 관련하여 최적화되었습니다. 예를 들어, OCT는 트래커와 함께 신호 대 잡음비를 크게 줄입니다. OCT 소프트웨어 시스템 업그레이드를 통해 더 많은 망막층을 자동으로 감지할 수 있습니다. 통합 DLP 비머는 모션 아티팩트를 줄이는 데 도움이 됩니다.

초저밀도 지단백질 수용체(Vldlr)는 내피 세포의 막횡단 단백질입니다. 망막 혈관 내피 세포, 망막 색소 상피 세포, 및 외부 제한막(^{23, 24}) 주위에 발현된다. 망막 신생 혈관은 Vldlr 녹아웃 마우스²³의 표현형입니다. 따라서 Vldlr 녹아웃 마우스는 망막 신생 혈관의 병인 및 잠재적 치료법을 조사하는 데 사용됩니다. 이 기사는 Vldlr 녹아웃 마우스에서 망막 병변을 감지하기 위해 OCT 이미징을 적용하는 방법을 보여 주며 작은 동물 모델에서 망막 병증 연구에 대한 기술적 참고 자료를 제공하기를 희망합니다.

Protocol

수술은 시력 및 안과 연구 협회의 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 관한 성명서에 따라 수행되었습니다. 실험 설계는 기관 동물 윤리위원회 (JSIEC의 의료 윤리위원회, EC 20171213 (4) -P01))의 승인을 받았습니다. 2개월 된 C57BL/6J 마우스와 Vldlr 녹아웃 마우스를 본 연구에 사용하였다. 각 그룹에는 7마리의 마우스가 있었고, 모두 암컷이었고 무게는 20g 내지 24g이었다.

1. 실험 조건

1. 마우스를 Vldlr 녹아웃 마우스로 구성된 실험군과 C57BL/6J 마우스로 구성된 대조군의 두 그룹에 할당합니다.
2. 생쥐에게 음식과 물을 전통적으로 먹이십시오.
3. 동물 실험실에서 실온(22°C), 습도(50-60%), 명암주기(12h-12h) 및 실내광 강도(350-400lux)의 안정적인 조건에서 마우스를 키웁니다.
4. 실험 장비 준비 : 작은 동물을위한 컨 포칼 스캐닝 레이저 검안경 (cSLO)을 사용한 광학 간섭 단층 촬영 (그림 1A).
5. 실험에 필요한 모든 물질을 준비하고(도 1B) 마우스의 무게를 측정한다(도 1C).

2. 정보 기록

1. 그룹, 코드, 생년월일, 나이, 성별, 체중 및 마취 복용량과 같은 정보를 기록하십시오.

3. 기기 시작 및 테스트

1. 컴퓨터를 켜고 소프트웨어를 시작하십시오.
2. 테스트 프로그램 버튼을 클릭하여 테스트 프로그램을 완료합니다.
3. 온도 조절기를 켜고 37 ° C의 온도로 예열하십시오.
4. 프로그램 테스트 후 OCT 모듈 프로시저를 시작합니다.
5. 새 제목을 만들고 마우스 정보를 입력합니다.
6. 전기 담요를 예열하고 수술 용 수건으로 덮으십시오.

4. 마취

1. 틸레타민과 졸라제팜을 함유하는 동결건조된 마취제를 사용하여 마취 혼합물을 제조한다.
   참고: 마취 투여의 선택, 복용량 및 경로에 대한 지역 동물 윤리 위원회의 권장 사항을 따르십시오. 적어도 1 시간 동안 움직이지 않고 통증 지각을 상실하는 마취제로 동물을 마취시킨 후 동물이 빨리 회복됩니다. 복용량은 실험 시간, 동물 무게 및 기타 요인의 길이를 기준으로해야합니다.
2. 준비된 마취 혼합물을 사용하여 동물을 마취하십시오. 회복 될 때까지 전체 절차 동안 동물을 따뜻하게 유지하십시오.

5. 산동 방울의 적용

1. 긁힘으로 마우스를 수동으로 고정하고 안구가 약간 튀어 나오게하고 한쪽 눈이 위쪽을 향하도록 마우스 헤드를 돌립니다.
2. 동공을 확장시키기 위해 산동 방울을 바르십시오 (그림 2A).
3. 10 분 후에 동공 확장을 확인하십시오.

6. 마우스 배치

1. 전기 담요 플랫폼에 마우스를 놓습니다.
2. 의료용 히알루론산 나트륨 젤로 두 눈을 코팅합니다(그림 2B).
3. cSLO 장치에 60D 이중 구면 렌즈(사전 설정 렌즈)를 나사로 고정합니다(그림 1A-5, 6).
4. 오목한 면이 각막 표면의 히알루론산 나트륨 겔에 닿도록 마우스 각막에 100D 콘택트렌즈를 놓습니다(그림 2C, D 및 그림 3A-II).
5. 마우스를 작은 항온 동물 플랫폼에 놓고 cSLO 장치의 렌즈에서 눈을 1-2mm 떨어진 곳에 둡니다(그림 3A).
6. 눈동자가 렌즈 중앙에 있도록 집게로 콘택트 렌즈의 각도를 조정하십시오.
7. 눈을 똑바로 향하도록 머리에 맞게 조정을 미세 조정합니다.

7. 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경(cSLO)

1. OCT 단추를 클릭하고 마우스 모듈을 선택한 다음 cSLO 프로그램을 시작합니다(그림 4B).
2. IR 모드(광원: 적색광)를 선택하고 매개변수를 조정합니다(범위: 2047, 그림 4D).
3. 검사할 눈을 선택합니다(오른쪽 눈: 그림 4C-1, 왼쪽 눈: 그림 4C-2).
4. 레버를 제어하고 사전 설정 렌즈를 콘택트 렌즈쪽으로 천천히 움직입니다.
5. 후방 극 이미징이 깨끗해질 때까지 디옵터 값을 조정합니다(그림 4E).
6. 망막 후방 극의 이미지를 시신경 머리를 중앙에 정렬하도록 추가로 조정하십시오.

8. 광학 간섭 단층 촬영 (OCT)

1. OCT 프로그램을 시작합니다(그림 4G).
2. OCT 이미지가 나타날 때까지 진행률 표시줄을 위아래로 클릭합니다(그림 4H).
3. 매개 변수 조정 : 최소 범위 (그림 4I) = 0-20, 범위 최대 (그림 4J) = 40-60.
4. 이상적인 OCT 이미지를 얻을 때까지 사전 설정된 렌즈 거리와 위치 방향을 조정합니다.
5. cSLO에서 표준 라인을 이동하여 스캔 위치를 선택합니다(그림 4M).
6. 시신경 머리에서 스캔을 시작하십시오.
7. 각 눈에 대해 동일한 순서로 이미지를 수집합니다. 수평선 : 시신경 머리→ 우수→ 열등; 수직선 : 시신경 머리→ 비강 → 측두.
8. 네 방향에서 이미지를 수집합니다.
9. 평균을 클릭하여 cSLO 및 OCT 이미지 신호를 오버레이합니다(그림 4F 및 그림 4O).
10. 촬영 단추를 클릭하여 SLO-OCT 이미지를 가져옵니다(그림 4P).
11. 모든 이미지를 저장하고 내보냅니다(그림 4Q, R).

9. 실험 종료 (10 월 시험 후)

1. 마우스를 전기 담요 위에 올려 깨어날 때까지 따뜻하게 유지하십시오.
   알림: 마우스는 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 모니터링해야 합니다. 수술 후 밝은 빛에 대한 노출을 최소화해야합니다.
2. 100D 콘택트 렌즈를 제거합니다.
3. 각막을 보호하기 위해 레보플록사신 아이 젤을 바르십시오.
4. 마우스를 깨운 후 케이지에 다시 넣으십시오.
   참고: 검사한 마우스가 완전히 회복될 때까지 다른 마우스의 회사로 반환되지 않도록 하십시오.
5. 소프트웨어를 끄고 컴퓨터를 끕니다.
6. 100D 콘택트 렌즈를 물로 청소하십시오. 렌즈를 말리십시오.
7. 환경을 청소하고 소독하십시오.

10. 이미지 분석

1. Vldlr 녹아웃 마우스의 OCT 이미지를 C57BL/6J 마우스의 OCT 이미지와 비교합니다.
2. 여러 위치를 관찰하십시오 : 시신경 유두를 통과하는 수직 및 수평 스캔; 우수, 열등, 비강 및 시간 스캔; 및 비정상적인 반사 부위 스캔.
3. 각 이미지에서 망막의 두께, 모양, 층위 및 비정상적인 반사율 병변과 망막과 유리체의 유리체 계면을 관찰하십시오.
4. 병변의 위치, 특성 및 수를 기록합니다.

11. 망막 층화 교정

1. OCT 인터페이스에서 부하 검사를 클릭합니다(그림 5A).
2. 팝업 창에서 마우스의 OCT 이미지를 호출합니다.
3. 이미지 선택: OCT 이미지는 시유두를 통해 수평 또는 수직으로 스캔합니다.
4. 미디어 컨테이너에서 이미지를 두 번 클릭하여 화면에 표시합니다(그림 5C).
5. 레이어 감지를 클릭하여 망막에 자동 레이어링을 완료합니다(그림 5D).
6. 분석을 위해 준비된 레이어의 양쪽에서 구분선을 선택합니다(그림 6D-10).
7. 별도의 구분선(그림 6B-6)을 선택하고 레이어 편집(그림 6A-1)을 클릭하여 빨간색 원이 나타날 때 선을 활성화합니다(그림 6B-7).
8. 간격(그림 6A-4, 예: 50) 및 제한 범위(그림 6A-5, 예: 50)를 조정합니다.
9. 빨간색 원을 이동하여 구분선을 수정합니다(그림 6B와 그림 6C의 녹색 구분선 비교; 도 6C는 수정된 결과를 나타낸다).

12. 망막 박판 간격

1. 측정 마커 단추를 클릭합니다(그림 6D-9).
2. 분석할 레이어의 구분선을 선택(예: 외부 핵층에서 목록에서 4번째와 5^번째 구분선 선택)하여 OCT 이미지에 레이어의 경계를 표시합니다(그림 6D-10).
3. 레이어와 연결(그림 6D-11) 및 이동 시 연결 유지(그림 6D-12)를 선택합니다.
4. 결과를 표시할 영역을 선택합니다(선택한 열의 색상이 지정됨, 그림 6D-13).
5. OCT 이미지에서 분석할 위치를 클릭하여 측정 선이 나타나게 합니다(가로 축에 수직이고 결과 영역의 색상과 일치함)(그림 6D-14).
6. 다음 측정을 위해 다음 열을 클릭하고 이전 데이터를 표시합니다(그림 6E-15).
7. 길이 단위(μm)(조직) 행(그림 6E, 빨간색 직사각형)에서 Vert 값(측정된 위치의 두께)을 읽습니다.
8. 마커 삭제(그림 6E-16) 및 새 마커(그림 6E-17)를 클릭하여 결과가 원래 데이터를 포함하도록 다시 테스트합니다(재측정이 필요한 경우).
9. 키보드에서 Print Scr 을 눌러 스크린샷을 저장하거나 검사 저장을 클릭하여 직접 저장합니다(그림 5H).
10. 통계 분석을 위해 스프레드시트 또는 통계 소프트웨어에 데이터를 입력합니다.

13. 전체 망막 두께 측정

1. 라인 1(ILM, 내부 제한막, 도 7B) 및 라인 7(OS-RPE, OS: 외부 광수용체 세그먼트; RPE: 망막 색소 상피층, 도 7C)를 우측 상단 모서리에 있는 목록에 표시하였다.
   참고: 전체 망막 두께는 OCT에서 ILM과 OS-RPE 사이의 망막인 망막 신경 상피층의 두께를 의미합니다.
2. 특정 간격으로 시신경 유두 양쪽의 망막 두께를 측정합니다.
   1. 예를 들어, 시신경 유두의 가장자리에있는 망막 구조의 모양에서 수평 눈금자의 200 μm 간격으로 4 개의 값을 측정하십시오 (그림 7G, H).
3. 모든 측정값을 스프레드시트에 기록합니다.
4. 여러 t-검정(행당 하나씩)을 사용하여 두 그룹에서 해당하는 각 위치의 측정값을 비교합니다.

Results

OCT의 고해상도 스캔 덕분에 마우스 망막의 층을 관찰하고 비정상적인 반사와 정확한 위치를 식별할 수 있습니다. Vldlr 녹아웃 마우스와 C57BL/6J 마우스의 망막 OCT 이미지를 이 연구에서 비교했습니다. 모든 C57BL/6J 마우스의 OCT 이미지는 반사율이 다른 다양한 망막층을 보여주었고 경계가 명확했습니다(그림 8D). 대조적으로, 모든 Vldlr 녹아웃 마우스는 OCT 이미지에서 비정상적이고 과반사성 병변을 나타냈다(도 8B).

Vldlr 녹아웃 마우스의 불완전 유리체 박리 (PVD)

OCT 결과는 Vldlr 녹아웃 마우스의 망막 표면에서 일부 중간 반사 ...

Discussion

이 연구에서는 불완전한 후방 유리체 박리, 망막 신생 혈관 및 망막 두께 얇아짐을 나타내는 Vldlr 녹아웃 마우스의 망막 변화를 평가하기 위해 작은 동물 망막 영상 시스템을 사용한 OCT 영상을 적용했습니다. OCT는 생체 내에서 망막의 상태를 검사하는 비침습적 영상 방법입니다. 대부분의 OCT 장치는 사람의 눈 검사용으로 설계되었습니다. 하드웨어 장비의 크기, 초점 거리 설정, 시스템 매개 변수 설정 및 수험자의 위치 요구 사항은 모두 사람의 눈을 기반으로합니다. 인간 전용 OCT 장비로 작은 동물을 검사하려면 렌즈 및 시스템 설정을 수정해야 합니다. 이 논문은 작은 동물 OCT 검사 절차를 제시합니다.

초점 거리는 안구의 크기가 다른 다른 작은 동물의 이미지 스캔 중에 다릅니다. 이러한 초점 거리의 차이는 매우 중요하며 명확하고 정확한 안저 이미지를 얻으려면 해결해야 합니다. 한 가지 효과적인 방법은 대물 렌즈를 다른 곡률의 렌즈로 교체하는 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-Dpt 콘택트렌즈	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		RETImap
이중 비구면 60-Dpt 유리 렌즈	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		속하는 액세서리 RETImap
전기 가열 담요	POPOCOLA	CW-DRT-01	50 x 35cm
주입 주사기(1mL)	Kaile		0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel	EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD		5 g: 0.015 g
의료용 히알루론산 나트륨 젤	Alcon	16H01E
마이크로리터 주사기	상하이 높은 비둘기 산업 및 무역 Co., LTD	Q31/0113000236C001-2017	50 µ L
포비돈 요오드 용액	Guangdong medihealth pharmaceutical Co., LTD		100 mL
RETImap	ROLAND CONSULT	19-99_50-2.1_1.2E	cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
작은 동물 귀 스터드	OSMO POCKET OT110	INS1005-1S
트로피카미드 페닐에프린 안약	Santen Pharmaceutical Co., LTD		5 mg/mL
자일라진	시그마	X1251-5G	5g
졸레틸 50	Virbac.S.A	7FRPA	틸레타민 125mg + 졸라제팜 125mg