방법 논문

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

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DOI:

10.3791/63425

2022년 2월 2일

이 논문에서

정오 공지

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요약

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

초록

유사분열성 양극성 키네신-5 모터는 스핀들 역학에서 필수적인 기능을 수행합니다. 이 모터는 활성 복합체의 반대쪽 끝에 위치한 두 쌍의 촉매 모터 도메인을 가진 호모 사량체 구조를 나타냅니다. 이 독특한 아키텍처는 kinesin-5 모터가 반평행 스핀들 미세소관(MT)을 가교 및 분리할 수 있게 해줌으로써 스핀들 극을 분리하는 외향 지향적인 힘을 제공합니다. 이전에는 kinesin-5 모터가 독점적으로 플러스 엔드 지향으로 여겨졌습니다. 그러나 최근 연구에 따르면 여러 곰팡이 키네신 -5 모터는 단일 분자 수준에서 향하는 마이너스 엔드이며 다양한 실험 조건에서 방향성을 전환 할 수 있습니다. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8은 이러한 양방향 운동 단백질의 예입니다 : 높은 이온 강도 조건에서 Cin8의 단일 분자가 MT의 마이너스 - 끝 방향으로 움직입니다. 또한 Cin8은 주로 MT의 마이너스 말단에 모타일 클러스터를 형성하며, 이러한 클러스터링을 통해 Cin8은 방향성을 전환하고 느리고 플러스 엔드 지향 운동성을 겪을 수 있습니다. 이 기사는 S. cerevisiae 세포에서의 단백질 과발현 및 그의 정제에서부터 시험관내 단일 분자 운동성 분석에 이르기까지 GFP 태깅된 키네신-5 Cin8로 작업하는 모든 단계에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 여기에 설명 된 새로 개발 된 방법은 형광 강도에 따라 Cin8의 단일 분자와 클러스터를 구별하는 데 도움이됩니다. 이 방법은 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 운동성에 대한 별도의 분석을 가능하게하여 클러스터 크기에 대한 Cin8 운동성의 의존성의 특성을 제공합니다.

서론

진핵 세포 내의 많은 운동성 사건은 분자 운동 단백질의 기능에 의해 매개된다. 이 모터는 세포 골격 필라멘트, 액틴 필라멘트 및 미세 소관 (MTs)을 따라 움직이며 ATP 가수분해의 화학 에너지를 세포 내에서 생물학적 운동성을 유도하는 데 필요한 운동 및 기계적 힘으로 변환합니다. MT 기반 S. cerevisiae Cin8은 양극성, 호모테트라머 키네신-5 모터 단백질로, 스핀들 MT를 교차 연결하고슬라이드합니다 1. Cin8은 유사분열 동안, 스핀들 어셈블리 2,3,4 및 아나페이즈 5,6,7 동안 스핀들 신장에서 필수 기능을 수행합니다. 이전에는 Cin8이 다양한 실험 조건에서 방향성을 전환하는 양방향 모터라는 것이 입증되었습니다. 예를 들어, 높은 이온 강도 조건에서 단일 Cin8 모터는 MT의 마이너스 끝쪽으로 이동하지만 클러스터, 다중 모터 MT 글라이딩 분석 및 병렬 MT 사이에서 Cin8....

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프로토콜

1. 완충제 및 시약의 제조

  1. 버퍼
    1. -Leu aa 드롭아웃 믹스: 아데닌, 우라실, 트립토판, 히스티딘, 라이신, 메티오닌 각각 2g을 섞어 실온에서 보관한다.
    2. 효모 선택 배지와 라피노스 (1 L): 완전히 용해될 때까지 교반하여(가열 없이) 이중 증류수에 효모 질소 염기 6.7 g(황산암모늄 포함), 2 g의 -Leu aa 드롭아웃 믹스 및 20 g의 라피노오스를 혼합한다. 0.22 μm 필터를 사용하여, 용액을 멸균 병으로 여과한다.
    3. 용해 완충액: 50 mM 트리스, 30 mM 파이프, 500 mM KCl, 10% 글리세롤, 1.5 mM β-머캅토에탄올, 1 mM MgCl2, 0.1 mM ATP 및 0.1% 트리톤 X-100으로 구성된 삼중 증류수(TDW)에용액 25 mL를 준비한다. 6 M HCl을 사용하여 pH를 8로 조정한다.
    4. 용출 완충액: 50 mM 트리스, 30 mM 파이프, 500 mM KCl, 350 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 1.5 mM β-머캅토에탄올, 1 mMMgCl2, 0.1 mM ATP 및 0.1% 트리톤 X-100으로 구성된 TDW 중 용액 10 mL를 준비한다. 6 M HCl을 사용하여 pH를 7.2....

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결과

이 실험은 단일 MT에서 서로 다른 클러스터 크기의 양방향 모터 단백질 Cin8의 운동성 특성을 조사하는 것을 목표로합니다. Cin8-GFP의 대표적인 운동성은 시간에 따른 모터의 공간 위치가 표시된 그림 5A의 키모 그래프에서도 분명합니다.

Cin8-GFP의 모타일 특성의 분석을 위해, 먼저, 클러스터 크기가 각각의 MT 부착 모타일 Cin8-GFP 입자에 할당되고(단계 4.3), 이어서 조사된 Cin8 입자의 위치가 시간의 함수로서 추적된다(단계 4.4). 각 군집 크기 카테고리에 대해, 개별 Cin8-GFP의 >40개의 궤적이 기록으로부터 추출되었다(도 5B). 추적 분석으로부터 얻은 좌표를 사용하여, MD 및 MSD 분석은 각 클러스터 크기 모집단에 대해 개별적으로 수행된다. 속도는 그림 5C에 제시된 바와 .......

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토론

이 연구에서는 양방향 키네신-5 Cin8을 사용한 단일 분자 운동성 분석 및 운동성 분석을 위한 프로토콜이 제시된다. C 말단에서 천연 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 전장Cin8(18 )은 천연 숙주 S. 세레비시아로부터 정제되었다. Cin8은 핵 운동 단백질이기 때문에 액체 질소 하에서 S. cerevisiae 세포를 분쇄하는 것이 세포 용해를위한 가장 효율적인 방법임이 밝혀졌습니다. 용해 후, 금속 친화도 및 크기 배제 크로마토그래피를 조합함으로써, 고도로 순수한 Cin8이 얻어지며, 이는 단일 분자 운동성 검정에 중요하다. 조 추출물과 정제된 샘플8에서 Cin8의 운동성 특성 사이에 차이가 있다는 것이 이전에 보고되었다. 또한, 모터 및 비운동 단백질로 MT 밀집하는 것이 양방향 키네신-5 Cut722의 방향성에 영향을 미친다는 것도 보고되었다. 따라서, 야생.......

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공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 L.G.에 수여 된 이스라엘 과학 재단 보조금 (ISF-386/18)과 이스라엘 이중 국가 과학 재단 보조금 (BSF-2019008)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아데닌FORMEDIUMDOC0230
ATP시그마A7699
비오틴화-BSA시그마A8549
카제인시그마C7078
카탈라아제(C40)시그마C40
크레아틴-키나아제시그마C3755
디티오트레이톨(DTT)시그마D0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
GFPChroma49002용 형광 필터 세트: ET-EGFP(FITC/Cy2)
Chroma용 형광 필터 세트: ET-CY3/TRITC
형광 도립 현미경ZeissAxiovert 200M
갈락토스티반 생명공학GAL02
포도당시그마G8270
포도당 산화효소시그마G7141
글리세롤시그마G5516
글리실글리신머크G0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTB세포골격BST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI 소프트웨어https://imagej.net/plugins/trackmate/버전 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64비트] Windows 10
ImidazoleSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein StainAbcamab119211
렌즈Zeiss100x/1.4 oil DIC objective
LysineFORMEDIUMDOC0161
Magnesium ChlorideSigmaM8266
MethionineDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS 카메라
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
Phospho-CreatineSigmaP1937
PipesSigmaP1851
Pluronic acid F-127 (Poloxamer)SigmaP2443
염화칼SigmaP9541
RaffinoseTivan BiotechRAF01
크기 배제 크로마토그래피 설치GE HealthcareAKTA 순수
분광 광도계ThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
트리스로쉬10708976001
트리톤 X-100시그마T8787
트립토판두체파 바이오케미T0720.0100
튜불린 단백질세포골격T240
튜불린, 비오틴화세포골격T333P
튜불린, TRITC 로다민세포골격TL530M
UracilSigmaU0750-100G
효모 질소 기반FORMEDIUMCYN0401S
α-GFP 항체Santa Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoethanolSigmaM3148
Rhodamine 49004륨

참고문헌

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S.

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재인쇄 및 허가

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정오


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

태그

Kinesin 5Cin8Saccharomyces CerevisiaeGFP

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