뇌하수체는 신체의 내분비 시스템의 핵심 조절자입니다. 이 기사는 생물학과 기능이 제대로 이해되지 않은 땀샘의 줄기 세포 집단을 연구하기 위해 새로운 3D 시험관 내 모델로서 마우스 뇌하수체에서 오가노이드의 발달을 설명합니다.
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방법 논문
뇌하수체 줄기 세포 생물학을 탐구하기 위해 시험관 내 모델로 마우스 뇌하수체에서 오가노이드 개발
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
뇌하수체는 신체 성장, 신진 대사, 성적 성숙, 생식 및 스트레스 반응을 포함한 주요 생리 과정을 조절하는 마스터 내분비선입니다. 십여 년 전, 뇌하수체에서 줄기 세포가 확인되었습니다. 그러나, 생체내 트랜스제닉 접근법의 적용에도 불구하고, 이들의 표현형, 생물학 및 역할은 불분명하다. 이러한 수수께끼를 해결하기 위해 뇌하수체 줄기 세포 생물학을 깊이 풀기 위해 새롭고 혁신적인 오가노이드 시험관 내 모델이 개발되었습니다. 오가노이드는 정의된 배양 조건 하에서 조직(상피) 줄기 세포로부터 자가발전하고 그 줄기 세포와 그 조직의 여러 특징을 재검토하는 3D 세포 구조를 나타낸다. 마우스 뇌하수체 유래 오가노이드가 땀샘의 줄기 세포로부터 발달하고 생체 내 표현형 및 기능적 특성을 충실하게 재구성한다는 것이 여기에서 보여집니다. 그 중에서도, 이들은 이식성으로 가해진 국소 손상에 반응하여 발생하는 생체내에서 줄기 세포의 활성화 상태를 재현한다. 오가노이드는 줄기 표현형을 견고하게 유지하면서 장기간 확장 가능합니다. 새로운 연구 모델은 신생아 성숙에서 노화와 관련된 퇴색, 건강에서 병든 땀샘에 이르기까지 뇌하수체 리모델링의 주요 조건 동안 줄기 세포의 표현형과 행동을 해독하는 데 매우 중요합니다. 여기에서, 마우스 뇌하수체 유래 오가노이드를 확립하기 위한 상세한 프로토콜이 제시되며, 이는 뇌하수체 줄기 세포의 수수께끼 같은 세계로 뛰어들 수 있는 강력한 도구를 제공한다.
서론
뇌하수체는 시상 하부와 연결된 뇌 기저부에 위치한 작은 내분비선입니다. 땀샘은 말초 및 중추(시상 하부) 입력을 통합하여 조정되고 조정된 호르몬 방출을 생성함으로써 적절한 시간에 적절한 호르몬을 생산하기 위한 하류 표적 내분비 기관(예: 부신 땀샘 및 생식선)을 조절합니다. 뇌하수체는 내분비 시스템의 핵심 조절자이므로 당연히 마스터 글 랜드1이라고 불립니다.
마우스 뇌하수체는 세 개의 엽(도 1), 즉 전엽(AL), 중간엽(IL), 및 후엽(PL)으로 구성된다. 주요 내분비 AL은 성장 호르몬 (GH)을 생산하는 somatotropes를 포함하여 다섯 가지 호르몬 세포 유형을 포함; 프로락틴(PRL)을 생성하는 락토트로프; 부신피질자극호르몬(ACTH)을 분비하는 피질염 호르몬; 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 생산을 담당하는 갑상선 로프; 황체 형성 호르몬 (LH)과 여포 자극 호르몬 (FSH)을 만드는 생식선 로프. PL은 호르몬 옥시토신과 바소프레신 (항 이뇨 호르몬)이 저장되는 시상 하부의 축삭 돌기로 구성됩니다. IL은 AL과 PL 사이에 위치하고 있으며 멜라노사이트 자극 호르몬 (MSH)을 생산하는 멜....
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프로토콜
본 연구를 위한 동물실험은 KU 루벤 동물실험윤리위원회(P153/2018)의 승인을 받았다. 모든 마우스는 표준화 된 조건 (23 ± 1.5 °C의 항온, 상대 습도 40 % -60 % 및 12 시간의 주야간 사이클)하에 대학의 동물 시설에 수용되어 물과 음식 광고 리비툼에 접근 할 수있었습니다.
1. 생쥐
- 젊은 성인 연령 (8-12 주령)의 C57BL/6J 마우스와 같은 시판 마우스 균주를 사용하십시오. 일반적으로, 2-3마리의 마우스는 프로토콜에 대해 충분한 수의 AL 세포를 제공한다.
2. 마우스 AL의 분리 및 해리
참고: 배지 A, B 및 C는 미리19,20으로 준비됩니다. 조성물은 표 2에 나타내었다.
- 마우스 AL의 분리
- CO2 질식에 의해 마우스를 안락사시키고, 이어서 감금시켰다(도 2A).....
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결과
AL의 단리 및 해리 후, 수득된 단일 세포를 ECM에 시딩하고 PitOM에서 성장시킨다(도 1, 표 1). 도 3A는 시딩에서의 세포 배양 및 밀도를 표시한다(Day 0). 일부 작은 파편이 존재할 수 있지만(그림 3A, 흰색 화살촉), 통과 시 사라집니다. 시딩 후 14일 후, AL 유래 오가노이드가 완전히 발달한다(그림 3A). 오가노이드는 내강을 둘러싸고있는 상피층과 함께 낭성 형태를 나타냅니다. 이 단계에서 오가노이드는 직경 500 μm에 도달하고 통과해야합니다. 도 3B는 해리된 오가노이드 단편의 재시딩 후 지시된 시간에 계대배양 후의 AL 유래 오가노이드 배양을 보여준다.
.......
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토론
여기에 기술된 바와 같이 AL 유래 오가노이드는 시험관내에서 뇌하수체 줄기 세포를 연구하는 강력한 연구 모델을 나타낸다. 현재이 오가노이드 접근법은 일차 뇌하수체 줄기 세포를 안정적이고 견고하게 성장하고 확장 할 수있는 유일한 도구입니다. 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래 된 뇌하수체 오가노이드 모델이 이전에 보고되었으며, 이는 뇌하수체 배아 유기발생을 밀접하게 재요약한다23; 그러나 뇌하수체 발달을 연구하거나 뇌하수체 질환 23,24,25를 모델링하는 데 매우 유용하지만 ESC / iPSC에서 시작하여보고 된 프로토콜은 여기에 설명 된 프로토콜에 비해 매우 시간이 많이 걸리며 결과 오가노이드도 확장 할 수 없습니다.
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공개 사항
저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 KU Leuven Research Fund와 FWO (Fund for Scientific Research) - Flanders의 보조금으로 지원되었습니다. E.L. (11A3320N) 및 C.N. (1S14218N)은 FWO / FWO-SB 박사 학위 펠로우십의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-메르캅토에탄올 | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48웰 플레이트, TC 처리, 개별 포장 | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| 알부민 소(세포 배양 등급) | Serva | 47330 | |
| B-27 보충제( 50X), 비타민 A 뺀 | Gibco | 12587010 | |
| Base 금형 | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| 카세트, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µ m 메쉬, 일회용 | Falcon | 352340 | |
| Vibrio cholerae의 콜레라 독소 | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| 소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, 분말, High glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus 접착 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding 워크스테이션, 220 - 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | ||
| 소 태아 혈청 (FBS) | 시그마 - 알드리치 | F7524 | |
| 글루타 맥스 보충제 | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | 시그마 - 알드리치 | H4034 | |
| HEPES 완충 용액 | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | 시그마 - 알드리치 | 688001 | |
| L- 글루타민 (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty 냉동 용기 | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher | 375353 | |
| 합성용 파라포름알데히드(PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| 페니실린 G 나트륨염 | 시그마-알드리치 | P3032 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 페놀 레드 | 머크 | 107241 | |
| 염화칼륨 (KCl) | 머크 | 104936 | |
| 재조합 인간 EGF 단백질, CF | R & D 시스템 | 236-EG | |
| 재조합 인간 FGF basic/FGF2/bFGF(157aa) 단백질 | R& D 시스템 | 234-FSE | |
| 재조합 인간 FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| 재조합 인간 IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| 재조합 인간 IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| 재조합 인간 Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| 재조합 인간 R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| 재조합 인간/쥐 FGF-8B | Peprotech | 100-25 | |
| 재조합 마우스 소닉 고슴도치/SHH(C25II) N-Terminus | R& D 시스템 | 464-SH | |
| RNeasy 마이크로 키트 | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| 염화나트륨(NaCl) | BDH | 102415K | |
| 인산이수소나트륨 1-수화물 | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| 나트륨 탄산수소 (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| 나트륨 - 피루브 산 (C3H3NaO3) | 시그마 - 알드리치 | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µ m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP 멸균 원심분리기 튜브 상단 필터 유닛, 0.22 μ m | Millipore | SCGP00525 | |
| 멸균수 | Fresenius | B230531 | |
| 스트렙토마이신 황산염 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| 글리신 최대(대두)의 트립신 억제제 | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| 트립신 용액 2.5 | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
참고문헌
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen,....
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재인쇄 및 허가
