이 프로토콜은 커피-곰팡이 상호작용에서 펙틴을 검출하는 현미경 방법을 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
식물 세포는 곰팡이 감염으로부터 자신을 방어하기 위해 구성 적 또는 유도성 인 다른 구조적 메커니즘을 사용합니다. 캡슐화는 식물 세포 원형질체로부터 진균성 하우스토리아를 분리하는 효율적인 유도성 메카니즘이다. 반대로, 세포벽의 고분자 성분 중 하나 인 펙틴은 괴사 성 상호 작용에서 여러 펙톨리아 효소의 표적입니다. 여기에서, 광학 현미경을 통해 펙틴 및 진균 균사를 검출하는 프로토콜이 제시된다. 녹균인 헤밀리아 바스타트릭 스에 의해 감염된 커피 잎의 세포에서 펙틴이 풍부한 캡슐화와 세르코스포라 코페이콜라 에 의해 유도된 중엽 세포벽 변형이 조사된다. Lesioned 잎 샘플을 Karnovsky 용액으로 고정시키고, 탈수시키고, 2-4일 동안 글리콜 메타크릴레이트에 포매하였다. 모든 단계는 세포간 공간에서 공기를 제거하고 매립 과정을 개선하기 위해 진공 펌핑으로 이어졌다. 매립된 블록을 5-7 μm 두께의 섹션으로 절편화하고, 물로 덮인 유리 슬라이드 상에 증착시키고, 이어서 40°C에서 30분 동안 가열하였다. 다음으로, 슬라이드를 락토페놀 중의 5% 코튼 블루로 이중 염색하여 곰팡이를 검출하고, 물에서 0.05% 루테늄 레드로 염색하여 펙틴(펙틴의 폴리우론산의 산성기)을 검출하였다. Hemileia vastatrix 의 곰팡이 haustoria는 펙틴에 의해 캡슐화 된 것으로 밝혀졌습니다. 커피 자궁 경부증에서 중엽 세포는 세포벽의 용해를 나타 냈으며 세포 간 균사와 conidiophores가 관찰되었습니다. 여기에 제시된 방법은 식물-진균 상호작용에서 펙틴-관련 반응을 검출하는데 효과적이다.
서론
식물의 세포벽 방어 메커니즘은 곰팡이 감염을 억제하는 데 중요합니다. 연구에 따르면 19세기 1,2 이후 세포벽 두께와 조성의 변화가보고되었습니다. 이러한 변화는 유두의 형성을 자극하는 곰팡이 병원체에 의해 유도 될 수 있으며, 이는 곰팡이가 세포에 들어가는 것을 방지하거나 진균 성 하우스토리아에서 숙주 세포 원형질체를 분리하기 위해 균사를 캡슐화하는 데 사용될 수 있습니다. 동적 세포벽 장벽 (즉, 유두와 완전히 둘러싸인 haustorium)의 생산은 식물 저항을 촉진시키는 데 중요합니다3. 곰팡이 관련 질환에 대한 조직병리학적 연구는 이러한 메카니즘의 발생을 조사하였고, 진균 공격에 대한 내성 메카니즘으로서 세포벽 중합체, 셀룰로스, 헤미셀룰로오스(arabinoxylans) 및 칼로스를기술하였다 4,5,6,7.
세포벽은 미생물 공격에 대한 첫 번째....
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프로토콜
1. 완충용액 및 시약의 제조
- 증류수 100 mL에 카코딜레이트 나트륨 4.28 g을 첨가하여 2 M 카코딜레이트 완충액을 제조하고 0.2 N HCl로 pH를 7.25로 조정하였다.
- 100 mL의 25% 수성 글루타르알데히드, 10% 수성 포름알데히드 10 mL, 25 mL의 2 M 카코딜레이트 완충액, 및 0.5 mL의 0.5 MCaCl2 26을 혼합하여 카르노프스키 고정제 용액 100 mL를 제조하였다. 증류수로 부피를 100 mL까지 구성하십시오.
참고 : 솔루션은 6 개월 동안 냉장고에 보관할 수 있습니다.
주의: 카코딜레이트 완충 용액은 독성이 있습니다. 따라서 흄 후드 또는 열린 영역에서 고정 솔루션을 처리하십시오. 취급하는 동안 용액 증기를 흡입하지 말고 장갑을 착용하십시오. - 다음을 혼합하여 Hoagland 수성 영양액을 제조하였다: 3 mM Ca(NO3)2.4H2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H2O, 46.4 mM
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결과
GMA 임베디드 섹션의 코튼 블루 락토페놀 염색은 생영양 및 괴사성 진균 상호작용 모두에서 커피 메소필 세포 사이와 내부 사이에 여러 곰팡이 구조의 존재를 밝혀냈다.
생물영양 병리계에서, 이중 염색 방법을 사용하여 염색할 때, 세포벽 및 치밀한 원형질체 함량을 함유하는 헤밀리아 vastatrix hyphae는 해면질과 팰리세이드 실질종 모두에서 진한 파란색으로 나타난다(도 4A,B). haustorium 모세포 (Hmc) 및 haustoria는 또한 강한 진한 청색을 나타낸다 (그림 4C). 루테늄 적색으로 역염색할 때, 세포간 공간에서의 진균 분포가 명확하게 정의된다(그림 4D). 진한 파란색 Hmc의 존재는 감염 영역을 감지하는 데 도움이됩니다. 상호 작용 중에 H.......
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토론
본 연구는 생물영양 병리계에서 하우스토리아를 캡슐화하는 세포벽의 펙틴 조성을 조사하기 위해 대안적인 이중 염색 조직화학 시험을 도입한다. 그 목적은 또한 그것에 의해 유도된 괴사성 균류 및 세포벽 변화를 검출하는 방법의 효능을 입증하는 것이다. 여기서, 커피 실질마 세포벽의 펙틴은 녹균인 헤밀리아 혈관염의 목과 하우스토리움을 모두 캡슐화할 수 있다. 실바 등은 또한 커피-H. 바스타트릭스 파토스14,29에서 셀룰로스 및 칼로스에 의한 캡슐화를 기술하였다. 방어 메카니즘과 관련된 세포벽 폴리머 중에서, 펙틴은 식물-병원체 시스템(10,11,12)에서 중요한 역할을 한다. 따라서 펙틴 기능에 대한 지식은 조직병리학적으로 큰 가치가 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자들은 허드슨 W. P. 드 카르발호 박사에게 이 작품을 개발하기 위한 지원에 감사를 표하고 싶다. 저자들은 또한 광 현미경 검사 시설을 제공 한 전자 현미경 연구소 ''엘리엇 와타나베 키타 지마 교수''에 감사드립니다. 저자들은 식물 재료에 병변을 공급해 준 Flávia Rodrigues Alves Patrício 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 블레이드 DB80 HS | Leica | 14035838383 Sectioning | |
| Cacodylate buffer | EMS | # 11652 | 고정 |
| 코튼 블루 Lactophenol | Metaquí 운모 | 70SOLSIG024629 | 염색 |
| 포름알데히드 | EMS | #15712 | 고정 |
| 글루타르알데히드 | EMS | #16216 | 고정 |
| 히스토레신 키트 | Technovit /EMS | #14653 | 임베딩용 히스토레신 |
| 핫 플레이트 | Dubesser | SSCD25X30-110V | 염색 |
| 현미경 | Zeiss | #490040-0030-000 | 이미지 캡처 |
| Microtome (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 14050238005 | Sectioning |
| Plastic molding cup tray | EMS | 10176-30 | Staining |
| Ruthenium red | LABHouse | #006004 | |
| Staining Software Axion Vision | Zeiss | #410130-0909-000 | 이미지 캡처 |
| 진공 펌프 | Prismatec | 131 TIPO 2 V.C. | 고정 |
참고문헌
- deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5(1863).
- Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 ....
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