Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론

요약

이 연구는 라벨링 사이트 선택, 염료 선택, 수집 및 데이터 분석을 포함한 FRET 매핑의 방법론을 자세히 설명합니다. 이 방법론은 단백질 시스템에서 결합 부위, 형태 변화 및 동적 운동을 결정하는 데 효과적이며 기존 3-D 구조 정보와 함께 수행 할 때 가장 유용합니다.

초록

Förster 공명 에너지 전달 (FRET)은 생체 관 내 뿐만 아니라 세포 내에서도 생체 분자 사이의 거리를 성공적으로 측정하는 데 사용되는 확립 된 형광 기반 방법입니다. FRET에서, 형광 강도 또는 수명의 변화에 의해 측정되는 에너지 전달의 효율은 두 형광 분자 또는 라벨 사이의 거리와 관련된다. 거리로부터의 역학 및 형태 변화의 결정은 생물학적 시스템에 대한 이 방법의 적용의 몇 가지 예에 불과하다. 특정 조건 하에서, 이 방법론은 결합 표면에 대한 역학, 유연성 및 적응에 관한 정보를 제공함으로써 기존의 X선 결정 구조를 추가하고 향상시킬 수 있다. 우리는 결합 부위의 식별 또는 이량체 서브유닛의 배향을 통해 구조적 특성을 밝히기 위한 FRET와 연관된 거리 결정의 사용을 기술한다. 라벨링 부위의 신중한 선택과 종종 여러 라벨링 전략의 고용을 통해, 우리는 단백질-DNA 복합체 및 SecA-SecYEG 단백질 전좌 시스템에서 글로벌 구조적 특성을 결정하기 위해 이러한 매핑 방법을 성공적으로 적용했습니다. SecA-SecYEG 시스템에서, 우리는 프리단백질 결합 부위를 확인하고 결합된 신호 서열 영역의 국소 입체형태를 결정하기 위해 FRET 매핑 방법을 사용하였다. 이 연구는 적절한 라벨링 부위의 식별, 비천연 아미노산 잔기를 포함한 가능한 라벨에 대한 논의, 라벨링 절차, 측정 수행 방법 및 데이터 해석을 포함하여 FRET 매핑 연구를 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.

서론

단백질의 경우, 3차원(3차원) 구조 지식과 함께 역학의 해명은, 생체분자 시스템의 구조-기능 관계에 대한 이해를 향상시킨다. X선 결정학 및 극저온 전자 현미경과 같은 구조적 방법은 정적 구조를 포착하고 종종 생체 분자 결합 및 역학의 측면을 밝히기 위해 여러 구조의 결정을 필요로합니다¹. 이 문서에서는 결합 부위 또는 결합 상호 작용과 같은 전역 구조 요소를 매핑하는 솔루션 기반 방법에 대해 설명합니다.이 요소는 잠재적으로 더 일시적이며 정적 방법에 의해 덜 쉽게 캡처됩니다. 이 방법론에 대한 강력한 후보 시스템은 3-D 구조가 이전에 X선 결정학, NMR 분광법 또는 기타 구조적 방법에 의해 결정된 시스템이다. 이 경우, 우리는 단백질 일반 분비 경로의 중심자인 SecA-SecYEG 복합체의 X선 결정 구조를 활용하여^{프리단백질을 멤}브레인을 가로지르는 수송 전에 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 사용하여 신호 펩티드 결합 부위의 위치를 매핑합니다. 3-D 구조에 대한 우리의 지식과 결합 된 유전 적 변형을 통한 생물학적 시스템의 조작은 채널 ³에 삽입되기 직전에 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태를 결정할 수있었습니다.

프로토콜

1. 라벨링 사이트 선택

1. 기존 단백질 구조 상의 추정적 결합 부위를 삼각 측량하기 위해 적어도 세 개의 잠재적 표지 부위를 동정한다. 이 경우, 유전자 융합을 통해 SecA에 부착된 SecA, SecYEG 및 프리단백질이 확인되었다².
   1. 추정적 결합 부위의 25-75 Å 이내 및 단백질의 비교적 정적 영역 내에서 표지 부위를 선택하고, 거리는 사용되는 특정 FRET 염료 쌍을 결정할 것이다⁽³⁶). 서로 비교적 구별되는 단백질 영역에서 라벨링 부위를 찾으므로, 부위는 중앙에 위치한 추정 결합 부위가 있는 삼각형의 정점을 설명합니다(그림 1A-D).
   2. 다른 Cys 잔기가 없는 단백질에 관심 있는 표지 부위에 시스테인 (Cys) 잔기를 도입하거나 동정하여, 특정 부위^37,38의 표지 효율을 개선시킨다.
   3. 클릭 화학으로 표지하기 위해 비천연 아미노산, 예를 들어, p-아지도페닐알라닌을 도입하여 서로 다른 염료

결과

이 연구는 SecYEG 채널 내로 프리단백질을 삽입하기 전에 SecA 상의 프리단백질 결합 부위의 위치를 결정하는 데 초점을 맞추었다. 결합 부위를 매핑하기 위해, 프리단백질의 상이한 영역과 SecA 및 SecYEG 단백질 상의 세 개의 별개의 위치 사이에서 FRET 실험을 수행하였다(도 1A-D). SecA, SecYEG, 및 프리단백질의 거리 및 입체 구조로부터 프리단백질 결합 부위의 위치를 예측하였다. 이러한 측정을 수행하기 위해 3개의 분리된 독립체(SecA, SecYEG 및 프리단백질)를 채용하는 대신, PhoA 신호 서열은 Gly-Ser 링커 ^2,3의 혼입 후 유전자 변형을 통해 SecA에 부착되었다. 염료를 사용한 facile 표지를 위해, Cys 잔기 또는 호박색 돌연변이를 PhoA 예비단백질의 잔.......

토론

FRET 매핑 방법론의 사용을 통해, 우리는 SecA 단백질 상의 신호 서열 결합 부위를 동정하였다. 중요하게도, 복합체의 3-D 결정 구조의 존재는 우리의 연구를 크게 촉진했습니다. 이 매핑 방법론의 강점은 기존 구조를 사용하여 레이블링을 위한 위치를 식별하는 능력에 있습니다. 이 방법론은 3-D 구조를 결정하는 데 사용할 수 없습니다. 그러나, 구조 요소(56)의 결정, 기존 구조물(⁴⁹)의 정제, 결합 부위 위치(^2,32)의 결정^, 또는 동적 운동⁽⁵⁷)의 해명은 모두 이 방법의 가능한 적용이다.

SecYEG-SecA-PhoA 복합체에서 세 개의 라벨링 부위는 추정 결합 부위 주위에 삼각형을 형성합니다(그림.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
490nm LED 레이저	Horiba	1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne	Life Technologies	A20347
Agar	Difco	DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne	Life Technologies	A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10906
Amicon Ultra­ 4 원심분리기 필터 (50kDa MWCO)	Sigma	UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM)	Anatrace	D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
extended signal peptide SP41	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
FluorEssence	Fluoromax4 분광계를 위한	Horiba	버전 2.4
Fluoromax 4 분광계	Horiba	N/A
GlobalsWE	Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine		시간 분해 붕괴
H­에 대한 스펙트럼 분석 프로그램; 4&수줍음; 아지도&샤이; Phe­ OH	BACHEM	4020250.0001
LB (Miller) Broth	Fisher Scientific	BP9723
Ludox HS-40 콜로이드 실리카(H2O에서 40wt.% 현탁액)	산란 용액을 만들기 위해	Sigma-Aldrich	420816
PTI Felix GX	Horiba	버전 4.1.0.4096	PTI Time Master Instrument용 스펙트럼 수집 프로그램
PTI Time Master 기기	Horiba	NA
Pymol 분자 그래픽 프로그램	슈뢰딩거	버전 2.4
수조	Thermo Scientific	NESLAB RTE 10

분광 수집 프로그램적절한 희석이 필요합니다.