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방법 논문

환경 오염을 해결하기위한 Extremophilic 미생물의 생물 탐사

3.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63453

⸱

2021년 12월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Naples Federico II, 2Institute of Polymers, Composites and Biomaterials (IPCB), Consiglio Nazionale delle Ricerche CNR, 3Division of Biological Systems and Engineering, Lawrence Berkeley National Laboratory, 4BAT Center-Interuniversity Center for Studies on Bioinspired Agro-Environmental Technology, University of Napoli Federico II

이 논문에서

요약

지열 온천에서 중금속 내성 미생물을 분리하는 것은 생물 정화 및 환경 모니터링 바이오 시스템 개발을위한 뜨거운 주제입니다. 이 연구는 온천에서 중금속 내성 박테리아를 분리하고 식별하기위한 방법 론적 접근법을 제공합니다.

초록

지열 온천은 깊은 대수층에서 일어나는 암석과 물 사이의 상호 작용으로 인해 다양한 금속 이온이 풍부합니다. 더욱이, pH와 온도의 계절성 변화로 인해, 원소 조성의 변동은 이러한 극한 환경 내에서 주기적으로 관찰되어 환경 미생물 군집에 영향을 미친다. 화산 열 통풍구에서 번성하는 극단 성 미생물은 환경에 존재하는 여러 금속 이온을 처리하기위한 저항 메커니즘을 개발하여 복잡한 금속 생화학 적 사이클에 참여합니다. 또한, 극단 동물과 그 제품은 시장에서 광범위한 발판을 마련했으며, 이는 특히 효소에 해당됩니다. 이러한 맥락에서, 그들의 특성화는 환경 모니터링 및 생물 개선을위한 바이오 시스템 및 바이오 프로세스의 개발에 기능적입니다. 현재까지, 극단성 미생물의 실험실 조건에서의 분리 및 재배는 여전히 그들의 생명 공학 잠재력을 완전히 활용하기위한 병목 현상을 나타냅니다. 이 연구는 온천에서 고온성 미생물을 분리하고 다음 단계를 통해 유전 형 및 표현형을 식별하기위한 간소화 된 프로토콜을 설명합니다 : (1) 지열 사이트 ( "Pisciarelli", 이탈리아 나폴리의 Campi Flegrei의 화산 지역)에서 미생물 샘플링; (2) 중금속 내성 미생물의 분리; (3) 미생물 분리물의 확인; (4) 단리물의 표현형 특성화. 이 연구에서 설명 된 방법론은 일반적으로 다른 극한 환경으로부터 미생물을 격리하는 데에도 적용될 수 있습니다.

서론

지구상의 극한 환경은 가혹한 조건 (즉, 온도, pH, 염분, 압력 및 중금속)1,2을 견딜 수있는 미생물의 훌륭한 원천이며, 아이슬란드, 이탈리아, 미국, 뉴질랜드, 일본, 중앙 아프리카 및 인도, 가장 잘 인정되고 연구 된 화산 지역 3,4,5,6,7,8,9 . 열병은 45°C에서 80°C까지의 온도 범위에서 열악한 환경에서 진화해 왔습니다10,11,12. 고세균 또는 박테리아 왕국에 속하는 고온성 미생물은 생물 다양성, 계통 발생 및 산업 응용을위한 독점적 인 생체 분자 생산 연구를위한 저수지입니다 13,14,15,16. 실제로, 지난 수십 년 동안, 세계 시장에서의 지속적인 산업 수요는 여러 생명 공학 분야 17,18,19에서 다양한 응용 분야를 위해 극단 성애자 및 열접합체의 착취를 장려했습니다.

유기체가 컨소시엄에 살고있는 온천은 생물 다양성의 풍부한 원천이므로 미생물 생태학20,21을 연구하는 매력적인 서식지를 나타냅니다. 더욱이, 이러한 화산 금속이 풍부한 지역은 일반적으로 중금속(22,23)의 존재에 생존하고 적응하기 위해 관용 시스템을 진화시킨 미생물에 의해 식민지화되어 생지화학적 순환에 적극적으로 관여한다. 요즘 중금속은 인간과 환경에 우선 오염 물질로 간주됩니다. 중금속 내성 미생물은 금속을 변형시키고 생태계를 리모델링함으로써 금속을 가용화하고 침전시킬 수 있습니다24,25. 중금속 저항의 분자 메커니즘에 대한 이해는 새로운 녹색 접근법26,27,28을 개발하는 것이 시급한 주제입니다. 이러한 맥락에서, 새로운 내성 박테리아의 발견은 환경 생물 개선을위한 새로운 전략을 개발하기위한 출발점을 나타냅니다24,29. 미생물 실험을 통해 수열 환경을 탐구하고 중금속 내성을 뒷받침하는 유전자의 역할에 대한 지식을 높이려는 노력과 함께 이탈리아의 캄피 플레 그리 (Campi Flegrei)의 온천 지역에서 미생물 스크리닝이 수행되었습니다. 이러한 중금속이 풍부한 환경은 강력한 수열 활동, 푸마롤 및 끓는 풀을 나타내며, 계절성, 강우량 및 지하 지질 운동에 의존하여 pH 및 온도가 가변적입니다30. 이러한 관점에서, 우리는 중금속에 내성을 가진 박테리아를 분리하는 적용하기 쉽고 효과적인 방법, 예를 들어 Geobacillus stearothermophilus GF1631 (분리 1로 명명) 및 Alicyclobacillus mali FL1832 (분리 2로 명명)를 Campi Flegrei의 Pisciarelli 영역에서 설명합니다.

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프로토콜

1. 지열 부위의 미생물 샘플링

  1. 원하는 온도와 pH를 가진 기준 장소로 사용하여 샘플링 할 부위를 선택하십시오. 디지털 써모커플 프로브를 통해 물리적 파라미터를 측정하여 선택한 풀이나 진흙에 삽입합니다.
  2. 토양 샘플 20g (이 경우 Pisciarelli Solfatara의 수열 부위의 진흙에서)을 수집하여 멸균 된 숟가락으로 채취하십시오. 선택한 각 사이트에 대해 적어도 두 개의 샘플을 채취하십시오.
  3. 샘플을 50 mL 멸균 폴리프로필렌 튜브에 넣고 즉시 닫는다.
  4. 디지털 열전대 프로브를 샘플링 사이트에 직접 삽입하여 pH와 온도를 측정합니다. 사용 후 프로브를 탈이온수로 조심스럽게 헹구십시오.

2. 중금속 내성 미생물의 분리

참고: 멸균된 생물학적 후드 아래에서 2.1-2.7단계를 수행하십시오.

  1. 각 채취한 시료 2 g을 갓 제조된 루리아-베르타니 배지(LB) 50 mL에 접종하고, 여기서 pH는 HCl 또는 NaOH의 첨가를 통해 4 또는 7로 조정하였다.
  2. 샘플을 샘플링 부위의 동일한 온도와 ±5°C(피시아렐리 샘플의 경우 55°C 및 60°C)에서 180rpm의 진탕 속도로 24시간 동안 온도 조절된 오비탈 진탕기에서 인큐베이션한다.
  3. 성장된 샘플 200 μL를 LB 한천 (pH 4 또는 pH 7) 상에서 플레이트하고, 55°C 또는 60°C에서 48시간 동안 정적 조건에서 인큐베이션한다.
  4. 단일 콜로니를 분리하고 줄무늬 도금 사이클(단계 2.3 및 2.4)을 적어도 세 번 반복한다.
  5. -80°C 냉동 세포 스톡을 제조하기 위해, 배양물을 밤새 성장시키고(ON) 성장된 세포에 20% 글리세롤을 첨가한다(최종 부피 1 mL에서); 빠른 동결을 위해 아세톤과 드라이 아이스의 혼합물을 사용하십시오.
  6. 글리세롤 스톡으로부터 접종물을 제조하기 위해, 50 mL의 LB (pH 4 또는 pH 6)에 50 μL를 접종하고, 180 rpm ON에서 오비탈 진탕기에서 55°C 또는 60°C에서 인큐베이션한다.
  7. 성장 프로파일을 얻기 위해, 예비배양물(단계 2.6으로부터 수득됨)을 10 mL의 LB(pH 4 또는 pH 6)에0.1 OD600 nm로 희석하고, 세포를 오비탈 진탕기에서 16시간 동안 55°C 또는 60°C에서 성장시키고, 30분 간격으로OD600 nm 를 측정하였다.
  8. 단계 2.7에서 수득된 데이터로부터 성장 곡선을 X축 상에서 시간(min)으로 구성하고,OD600 nm 를 Y축에 작제한다.
  9. 단계 2.7 및 2.8에 기술된 동일한 성장 곡선을 실현하되 배양 배지의 pH(± 1 unit)를 변화시키지만(예를 들어, pH 4에서 성장한 샘플의 경우 pH 3 및 5) 실험실 조건에 대한 최적의 pH를 결정한다.

3. 미생물 분리물의 확인

  1. 게놈 DNA의 제조
    1. 글리세롤 스톡으로부터 줄무늬가 있는 단리물을 50 mL의 LB 배지 (pH 4 또는 pH 6)에 접종하고 180 rpm ON에서 55°C 또는 60°C에서 오비탈 진탕기에서 성장시킨다.
    2. ON 배양물을 5000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 수확 한다. 상층액을 버리십시오.
    3. 사용 직전에 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% 트리톤 X-100 및 라이소자임(20 mg/mL)으로 구성된 박테리아 용해 완충액 10 mL를 준비하십시오.
    4. 펠렛을 180 μL의 박테리아 용해 완충액에 재현탁시킨다. 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
    5. 게놈 DNA 정제 키트 (표 물질)에 표시된 지침에 따라 게놈 DNA를 추출하십시오.
    6. UV-Vis 측정에 의해 추출된 게놈 DNA 및 이의 순도를 정량화한다. 순도의 경우 비율 - OD 260 / 280 nm 및 OD 260 / 230 nm를 결정하십시오.
    7. 각 샘플의 200 ng을 0.8% 아가로스 겔에 로딩하고 크기 분포를 고중량 분자 마커와 비교함으로써 게놈 DNA의 완전성을 평가한다.
    8. 의뢰하여 16S rRNA 단편 준비, 시퀀싱 및 얻어진 서열의 비교 분석(1000 bp)을 미국 국립 생명공학정보센터(NCBI)33의 뉴클레오타이드 데이터베이스에 존재하는 것들과 비교한다.
  2. 16S rRNA 시퀀싱의 데이터를 확증하기 위해, 소화된 염색체 DNA에 대해 자동화된 리보타이핑을 수행한다(외부 서비스, Table of Materials).
  3. 리보타이핑 데이터로만 스펙 식별을 결정할 수 없는 경우, 지방산 식별을 위해 MALDI-TOF MS 분석을 의뢰합니다.
  4. 동정된 속의 계통발생학적 분석을 수행하기 위해, 단리물의 16S rRNA 서열을 BLASTn34로 분석한다. 99%에서 97%까지의 동일성을 가진 서열은 CLUSTAL 오메가35를 사용하여 다중 서열 정렬을 구축하는 데 사용해야 합니다. ClustalW2(Simple Phylogeny)의 기본 옵션을 사용하여 인접 조인 트리를 구성합니다.

4. 중금속 및 항생제 감수성

  1. 글리세롤 스톡으로부터 단리된 생성물을 접종하고(단계 2.5 참조) 이를 이전에 결정된 최적의 pH 및 온도 조건 하에서 LB 200 mL에서 성장시킨다.
  2. 각 예비배양물을 0.1OD600 nm 에서 증가된 농도의 중금속을 함유하는 LB 배지 5 mL (적절한 pH에서)에 희석한다. 농도는 중금속 [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] 또는 항생제[암피실린, 바시트라신, 클로람페니콜, 시프로플록사신, 에리스로마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 반코마이신]의 경우 0.5-1 mg/mL로 다양하다.
  3. 중금속과 항생제 치료를 별도로 수행하십시오. 50 mL 폴리프로필렌 튜브를 사용하여 각 조건/처리에 대해 16시간 동안 55°C 또는 60°C에서 180rpm의 진탕 속도로 온도 조절 오비탈 진탕기에서 세포를 성장시킵니다.
  4. 미생물 성장이 일어나지 않는 튜브의 농도 값, 즉 16 시간 후에 세포 성장을 완전히 억제하는 값을 결정하여 항생제 또는 중금속에 대한 최소 억제 농도 (MIC)를 계산하십시오.
  5. LB-agar 플레이트 상에 MIC로 간주되는 값에서 성장한 배양물 200 μL를 (적절한 pH 및 온도에서) 플레이팅하여 세포에 대한 농도가 억제되고 치명적이지 않은지 확인하고 ON 배양 후 콜로니의 존재를 검증하였다.
    주: LB 한천 플레이트 상에서의 배양은 단지 몇 주 동안 4°C에서 생존가능하기 때문에, 단리물을 더 긴 시간 동안 보존하기 위해, 글리세롤 스톡을 제조하고 -80°C에서 저장하였다. MIC 결정을 위해, 독립적인 배양물을 사용하여 적어도 세 개의 독립적인 반복실험이 수행되었다. 표준 편차는 삼중 실험들 사이에서 계산되었다.

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결과

샘플링 사이트
이 프로토콜은 온천으로부터 중금속 내성 박테리아를 분리하는 방법을 예시한다. 이 연구에서, 산-황화 지열 환경인 피시아렐리 지역을 샘플링 부위로 사용하였다(도 1). 이 생태계는 화산 활동에서 파생 된 공격적인 유황 유체의 흐름을 특징으로합니다. 산 황화 지열 시스템의 미생물 군집이 고농도의 중금속의 존재에 의해 만들어진 극단적 인 선택적 압력을 받는다는 것이 입증되었습니다. 샘플은 버블링 진흙 풀에 대하여 한계가 있는진흙 풀 2,21개로부터 연중 두 개의 상이한 기간(4월과 9월)에 수집되었다. 진흙 풀에서는 pH 값의 변동 (4 월의 ~ pH 6 및 9 월의 ~ pH 5)이 등록되었지만 온도는 두 경우 모두 ~ 55 °C였습니다. 그러나, 더 높은 온도는 또한 다른 년

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토론

온천은 똑같이 다양한 대사 능력을 가진 미개척 미생물의 다양성을 함유한다12. 중금속을 덜 독성이 적은 화합물(10 )로 효율적으로 전환시킬 수 있는 미생물의 격리를 위한 전략의 개발은 전 세계적으로 관심이 높아지고 있는 연구 분야이다. 이 논문은 독성 화학 물질에 저항 할 수있는 능력을 갖춘 미생물의 선별 및 분리를위한 간소화 된 접근 방식을 설명하는 것을 목표로합니다. 기술된 방법은 물, 음식, 토양 또는 퇴적물과 같은 다양한 환경 공급원으로부터 미생물을 분리하도록 용이하게 변형될 수 있다. 그러나, 미생물 배양에 의존하는 것과 관련된 이 기술에는 몇 가지 한계가 있다. 따라서이 설정은 쉽게 배양 할 수없는 환경에서 박테리아를 분리하는 데 적합하지 않습니다. 이 문제를 극복하는 한 가지 방법은 다른 박테리아 배지 (즉, 선택적 배지 또는 사전 적응 전략)와 더 긴 배양 시간42를 사용하는 것입니다....

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 및 GoodbyWaste: Obtain GOOD제품-익스플로잇 BY-product-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italy의 지원을 받았습니다. 지열 사이트의 식별 및 특성화에 대해 Monica Piochi 박사와 Angela Mormone 박사 (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italy)에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암피실린시그마 알드리치A9393
아우라 미니바이오 에어 s.c.r.l.생물학적 후드
: 바시트라신시그마 알드리치B0125
카드뮴 클로그마 알드리202908
클로람페니콜시그마 알드리치C0378
시프로플록사신시그마 알드리치17850
코발트 클로라이드시그마 알드리치C8661
구리 클로라이드Sigma Aldrich224332
ErythromycinSigma AldrichE5389
Exernal ServiceDSMZLeibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
게놈 DNA 정제 키트Thermo Scientific#K0721
Kanamycin sulphateSigma Aldrich60615
MaxQTM 4000 벤치탑 오비탈 쉐이커Thermo ScientificSHKE4000
염화수은Sigma Aldrich215465
NanoDrop 1000 분광 광도계Thermo Scientific
염화니켈Sigma Aldrich654507
Orion Star A221 휴대용 pH 측정기Thermo ScientificSTARA2218
나트륨(메타) 비소: 시그마 AldrichS7400
비산 나트륨 : 이염기성 헵타 하이드레이트: 시그마 AldrichA6756
염화나트륨: 시그마 AldrichS5886
스트렙토 마이신시그마 AldrichS6501
테트라 사이클린: 시그마 Aldrich87128
: Tryptone BioChemicaApplichem PanreacA1553
VancomycinSigma Aldrich PHR1732
분자 생물학을 위한 효모 추출물Applichem Panreac  A3732
라이드 시치 ,

참고문헌

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