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방법 논문

생체 내 쥐의 심부 뇌 자극에 의해 유도 된 활동 패턴을 밝히기위한 양전자 방출 단층 촬영

2.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63478

⸱

2022년 3월 23일

 ,  ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Laboratorio de Imagen Médica, Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, 3Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, 4CIBER de Salud Mental (CIBERSAM), 5High Performance Research Group in Physiopathology and Pharmacology of the Digestive System (NeuGut), Universidad Rey Juan Carlos

이 논문에서

요약

우리는 생체 내 FDG-PET를 이용한 급성 심부 뇌 자극에 의해 유도 된 대사 신경 조절을 평가하는 전임상 실험 방법을 설명합니다. 이 원고에는 정위 수술에서 자극 치료의 적용, PET 이미지의 획득, 처리 및 분석에 이르기까지 모든 실험 단계가 포함되어 있습니다.

초록

심부 뇌 자극 (DBS)은 환자의 병태 생리학에 관여하는 뇌 구조에 전기 펄스를 적용하는 것을 기반으로하는 침습적 신경 외과 기술입니다. DBS의 오랜 역사에도 불구하고 그 작용 메커니즘과 적절한 프로토콜은 불분명하여 이러한 수수께끼를 해결하기위한 연구의 필요성을 강조합니다. 이러한 의미에서 기능적 이미징 기술을 사용하여 DBS의 생체 내 효과를 평가하는 것은 자극이 뇌 역학에 미치는 영향을 결정하는 강력한 전략을 나타냅니다. 여기에서는 뇌 대사에 대한 DBS의 급성 결과를 평가하기 위해 종단 연구 [18F]-플루오로 데 옥시 클루 코스 양전자 방출 단층 촬영 (FDG-PET)과 결합 된 전임상 모델 (Wistar rats)에 대한 실험 프로토콜이 설명됩니다. 첫째, 동물들은 전두엽 피질에 전극을 양측 이식하기 위해 정위 수술을 받았다. 전극 배치를 확인하기 위해 각 동물의 수술 후 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔을 획득했습니다. 회복 1주일 후, 자극 없이 각각의 조작된 동물의 제1 정적 FDG-PET를 획득하고(D1), 이틀 후(D2), 동물을 자극하는 동안 제2 FDG-PET를 획득하였다. 이를 위해 전극은 FDG를 동물에게 투여 한 후 분리 된 자극기에 연결되었습니다. 따라서, FDG 흡수 기간 (45 분) 동안 동물을 자극하여 뇌 대사에 대한 DBS의 급성 효과를 기록했다. 이 연구의 탐색적 특성을 감안할 때, FDG-PET 이미지는 D1과 D2 연구 사이의 쌍을 이루는 T-검정을 기반으로 한 복셀-현명한 접근 방식으로 분석되었습니다. 전반적으로 DBS와 영상 연구의 결합을 통해 신경망에 대한 신경 조절 결과를 설명할 수 있어 궁극적으로 DBS를 둘러싼 수수께끼를 푸는 데 도움이 됩니다.

서론

신경 자극이라는 용어는 치료 목표1로 신경계를 자극하기위한 다양한 기술을 포함합니다. 그 중 심뇌 자극 (DBS)은 임상 실습에서 가장 널리 퍼진 신경 자극 전략 중 하나입니다. DBS는 정위 수술에 의해 조절되는 뇌 표적에 배치 된 전극을 통해 환자의 신체에 직접 이식 된 신경 자극기에 의해 전달되는 전기 펄스로 심부 뇌 핵의 자극으로 구성됩니다. 다양한 신경 및 정신 장애에서 DBS 적용의 타당성을 평가하는 논문의 수는 지속적으로 증가하고 있습니다.2 그 중 일부만이 식품의약국(FDA)의 승인을 받았습니다(즉, 본태성 진전, 파킨슨병, 근긴장이상, 강박 장애 및 의학적으로 불응성 간질)3 . 또한, 공식적으로 승인 된 것보다 더 많은 병리의 DBS 치료를 위해 많은 뇌 표적과 자극 프로토콜이 연구 중이지만 그 중 어느 것도 결정적인 것으로 간주되지 않습니다. DBS 연구 및 임상 절차의 이러한 불일치는 부분적으로 작용 메커니즘에 대한 완전한 이해 부족 때문일 수 있습니다4. 따라서 DBS가 뇌 역학에 미치는 생체 내 효과를 해독하기 위해 엄청난 노력을 기울이고 있으며, 모든 발전은 아무리 작더라도 DBS 프로토콜을 개선하여 더 큰 치료 성공을 거둘 수 있도록 도와줍니다.

이러한 맥락에서 분자 이미징 기술은 DBS의 생체 내 신경 조절 효과를 관찰할 수 있는 직접적인 창을 엽니다. 이러한 접근법은 DBS가 적용되는 동안 DBS의 영향을 결정할 뿐만 아니라 그 결과의 본질을 밝히고, 원치 않는 부작용 및 임상적 개선을 예방하고, 자극 매개변수를환자의 필요에 맞게 조정할 수 있는 기회를 제공합니다5. 이들 방법들 중에서, 2-데옥시-2-[18F]플루오로-D-글루코오스 (FDG)를 사용하는 양전자 방출 단층촬영(PET)은 상이한뇌 영역(6)의 활성화 상태에 대한 특정 및 실시간 정보를 제공하기 때문에 특히 흥미롭다. 구체적으로, FDG-PET 영상화는 뉴런과 신경교 세포 사이의 대사 결합의 생리학적 원리에 기초한 신경 활성화의 간접적인 평가를 제공한다6. 이러한 의미에서 여러 임상 연구에서 FDG-PET를 사용하여 DBS 조절 뇌 활동 패턴을보고했습니다 (검토를 위해3 참조). 그럼에도 불구하고 임상 연구는 이질성 또는 모집 어려움과 같은 환자에게 초점을 맞출 때 연구 잠재력을 크게 제한하는 몇 가지 단점을 쉽게 발생시킵니다6. 이러한 맥락에서 연구자들은 인간 상태의 동물 모델을 사용하여 임상 번역 전에 생물 의학적 접근법을 평가하거나 이미 임상 실습에 적용된 경우 치료 이점 또는 부작용의 생리적 기원을 설명하게됩니다. 따라서 인간 병리학과 실험실 동물의 모델링 된 조건 사이의 먼 거리에도 불구하고 이러한 전임상 접근법은 임상 실습으로의 안전하고 효과적인 전환에 필수적입니다.

이 원고는 뇌 대사에 대한 DBS의 급성 결과를 평가하기 위해 종단 FDG-PET 연구와 결합 된 쥐 모델에 대한 실험적 DBS 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜로 얻은 결과는 DBS에 의해 뇌 활동에 유도 된 복잡한 조절 패턴을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서, 생체 내에서 자극의 결과를 조사하기 위한 적절한 실험 전략이 제공되어, 임상의가 특정 상황에서 치료 효과를 예상한 다음 자극 파라미터를 환자의 필요에 맞게 조정할 수 있다.

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프로토콜

실험 동물 절차는 유럽 공동체 이사회 지침 2010 / 63 / EU에 따라 수행되었으며 Gregorio Marañón 병원의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 실험 프로토콜의 그래픽 요약이 그림 1A에 나와 있습니다.

1. 생체 내 신경영상에 의한 뇌 표적 국소화

  1. 동물 준비
    참고 : ~ 300g의 수컷 Wistar 쥐가 사용되었습니다.
    1. 동물을 마취 유도 상자에 넣고 상단을 밀봉하십시오.
    2. 세보 플루 란 기화기 (5 % O100에서 유도의 경우 2 %)를 켭니다. 쥐가 마취되면 가스 흐름을 노즈 콘으로 전환하십시오. 쥐 발을 꼬집어 마취 상태를 확인하십시오.
    3. 동물 앙와위를 CT 침대에 놓고 세보 플루 란 마취를 유지합니다 (100 % O2에서 유지 보수를 위해 3 %).
  2. CT 영상
    알림: 암페어, 전압, 투사 수, 촬영 컷 수 및 복셀 해상도의 선택은 CT 스캐너에 따라 다릅니다. 여기서 다음 매개 변수 : 340mA, 40KV, 360 프로젝션, 8 샷 및 200μm 분해능이 사용되었습니다 7,8,9.
    1. 안면 마스크 또는 코 콘을 쥐에게 고정하십시오.
    2. 쥐의 머리, 어깨, 엉덩이, 꼬리를 실크 테이프로 고정하여 손상없이 충분한 구속을 제공합니다.
    3. 쥐를 지속적으로 모니터링하십시오.
    4. CT 스캐너의 시야 중앙에서 머리를 찾습니다.
    5. 스캐너 사양에 따라 획득 파라미터를 사용하여 CT 이미지 획득을 진행합니다.
    6. 10분 후, 생체 내 CT 스캔이 완료되면, 세보플루란 흐름을 멈추고 쥐를 MRI 스캐너에 넣는다.
  3. MR 이미징
    참고: 스캔 획득 사양은 다양한 소프트웨어 시스템과 더 중요한 특정 연구 질문을 포함하여 스캐너마다 다릅니다. 여기에는 7-Tesla 스캐너가 사용되었습니다. TE = 33ms, TR = 3732ms, 및 슬라이스 두께가 0.8mm(34슬라이스)인 T2-가중 스핀-에코 시퀀스 7,8,9, FOV가 3.5 x 3.5cm2인 256 x 256픽셀의 매트릭스 크기를 사용하였다.
    1. MRI 침대에 동물 앙와위를 놓고 세보 플루 란 마취를 유지합니다 (100 % O2에서 유지 보수를 위해 3 %).
    2. MRI 획득 중 머리의 움직임을 방지하기 위해 스캐너 베드에 놓인 정위 프레임에 머리를 고정합니다. 또한 실크 테이프로 쥐 몸의 나머지 부분을 고정하십시오.
    3. MRI 스캐너의 시야 중앙에서 머리를 찾습니다.
    4. 위치가 정확하면 MRI 이미지 획득을 진행합니다.
    5. 생체 내 MRI 스캔이 완료되면 세보 플루 란 흐름을 멈추고 쥐를 새장에 넣습니다.
    6. 쥐는 일반적으로 스캔하는 동안 체온을 낮추기 때문에 케이지 근처에 가열 램프를 배치하십시오.
    7. 마취에서 회복 될 때까지 쥐를 모니터링하십시오.
  4. Atlas 공동 위치 파악 및 대상 좌표 계산
    1. 스캐너의 권장 사항에 따라 CT 및 MRI 이미지를 획득하고 재구성한 후 CT 및 MRI 이미지를 공동 등록합니다.
    2. 영상 처리 소프트웨어를 사용하여 상호 정보10을 기반으로 하는 자동 경직 등록 알고리즘을 사용하여 CT와 MRI를 공간적으로 정규화합니다.
    3. Paxinos 및 Watson 쥐 뇌 아틀라스11에 따라 공동 등록된 이미지에서 브레그마 선을 국소화하고 브레그마에서 대상(즉, 내측 전전두엽 피질, mPFC)까지의 전방/후방(AP: +3.5mm), 정중선/외측(ML: +0.6mm) 및 배복부(DV: -3.4mm) 축의 거리를 측정합니다.
      알림: Bregma에서 대상까지의 좌표는 체중, 크기, 성별 및 품종이 다를 때 쥐마다 다를 수 있습니다.

2. 정위 수술

주의 : 사용하기 전에 모든 수술 재료, 임플란트 및 정위 장치를 오토 클레이브하고 동물 복지에 영향을 미칠 수있는 감염 및 합병증을 피하기 위해 수술 부위를 소독하십시오. 멸균 수술 장갑을 사용하고 오염을 방지하기 위해 끈적 끈적한 커튼으로 동물을 덮으십시오.

  1. 동물 준비 및 마취
    1. 동물에게 수술 전날 0.1mg/kg 부프레노르핀 복강내 투여하였다. 동물을 마취 유도 상자 챔버에 넣고 상단을 밀봉하십시오.
    2. 세보 플루 란 기화기 (5 % O100에서 유도의 경우 2 %)를 켭니다.
    3. 쥐가 기대어 앉으면 세보 플루 란 기화기를 끄고 상자 챔버에서 쥐를 꺼냅니다.
    4. 동물을 마취하기 위해 케타민 (100 mg / kg)과 자일 라진 (10 mg / kg)의 혼합물을 복강 내 투여하십시오.
    5. 동물이 완전히 마취 될 때까지 기다리십시오. 인터 디지털 영역을 꼬집어 마취 수준을 확인하십시오.
    6. 귀와 눈 사이의 영역을 면도하십시오.
  2. 정위 프레임과 개두술에 배치
    1. 동물을 정위 프레임의 엎드린 위치에 놓고 쥐가 수술 중에 동물을 올바른 위치에 유지하기 위해 머리 고정 어댑터를 사용하십시오.
    2. 쥐 귀 바를 사용하여 머리의 움직이지 않도록하십시오. 이어바를 너무 깊게 삽입하면 고막이 손상될 수 있으므로 주의하세요.
    3. 수술 중 건조를 방지하기 위해 안과 용 윤활 젤을 눈에 바르고 멸균 거즈로 덮으십시오.
    4. 오염을 방지하기 위해 끈적 끈적한 커튼으로 동물을 덮으십시오.
    5. 면도 부위에 요오드 포비돈 용액을 바르고 멸균 거즈로 닦으십시오.
    6. 면도 한 부위의 젤에 메피 바카 인을 바르면 국소 부위가 마취됩니다.
    7. 귀 사이의 두개골 위에있는 피부에 세로 절개를하여 람다에서 브레그마까지 (즉, 두개골 정점에서 눈으로) 1.5-2cm 연장합니다.
    8. 2 개 또는 3 개의 클램프를 사용하여 두개골을 노출시킵니다. 면봉으로 골막을 제거하고 식염수로 혈액을 깨끗이하여 Bregma와 시상 봉합사를 노출시킵니다. 과량의 식염수를 거즈로 제거하십시오.
    9. 치과용 시멘트 접착력을 향상시키기 위해 메스로 두개골 표면을 긁습니다. 과산화수소에 적신 면봉으로 해당 부위를 청소하십시오.
  3. 두개골에 전극 배치 및 고정
    1. 수술 중 올바른 위치를 보장하기 위해 플라스틱 핀셋으로 전극을 곧게 펴십시오.
      알림: 접지가 있는 동심 양극성 백금-이리듐 전극이 이 프로토콜에 사용됩니다.
    2. 입체 프레임의 오른팔 홀더에 하나의 전극을 배치하십시오.
      알림: 더 잘 고정하려면 홀더를 전극에 맞게 조정해야 할 수도 있습니다( 그림 1B 참조). 전극이 홀더의 축과 평행한지 확인하십시오.
    3. 정위 프레임을 통해 전극을 잡고 있는 오른팔을 움직이고 전극 끝을 Bregma 위에 정확히 놓습니다. 전극의 변형을 피하기 위해 전극 팁을 두개골에 최대한 가깝게 가져 오되 만지지 말고 입체 프레임에서 제공하는 Bregma의 결과 좌표를 기록하십시오. 수술 용 펜으로 전극의 초기 위치를 나타내는 두개골에 표시를하십시오.
    4. 홀더를 1.4.3단계에서 얻은 AP 및 ML 좌표로 이동하고 전극 대상의 위치를 나타내는 수술용 펜으로 두개골에 표시를 합니다.
    5. 전극을 잡고 있는 입체 프레임의 오른팔을 제거합니다. 전극으로 아무것도 만지지 않도록주의하십시오.
    6. 작은 전기 드릴을 사용하여 경막이 보일 때까지 목표 위치의 두개골 (직경 약 1-1.5mm)을 통해 구멍을 뚫습니다. 면봉을 사용하여 출혈을 멈추십시오.
    7. 두개골을 따라 4 개의 구멍을 뚫어 4 개의 나사 (바람직하게는 2-3mm 길이의 스테인레스 스틸 나사)를 찾아 치과 용 시멘트의 표면적을 늘리고지면을 찾습니다. 나사 4개를 부착합니다.
    8. 오른쪽 전극으로 입체 프레임의 오른팔을 찾습니다. 구멍과 일치해야하는 계산 된 위치로 팔을 이동하십시오. 그런 다음 경막에 닿을 때까지 전극을 내립니다. 이 위치는 DV 방향으로 0 레벨로 사용됩니다.
    9. 단계 1.4.3에서 DV 위치를 사용하여 전극의 끝을 DV 방향으로 삽입합니다. 면봉으로 전극 부위 주변의 혈액과 뇌척수액을 청소하십시오.
    10. 전극에 가장 가까운 나사 중 하나에 접지를 부착하십시오.
    11. 전극과 나사 주위에 치과용 시멘트를 바르고 동물을 다치게 할 수 있는 날카로운 모서리를 피하면서 치과용 시멘트의 모양을 만듭니다. 치과용 시멘트는 조직/두개골의 과열/열 손상을 방지하기 위해 층에 적용됩니다. 두꺼운 층은 추가 층이 추가되기 전에 경화하는 데 더 많은 시간이 필요합니다. 홀더에서 전극을 제거하기 전에 치과용 시멘트가 완전히 경화되었는지 확인하십시오.
      주의 : 치과 용 시멘트의 준비는 혼합물에서 독성 증기를 방출하여 시멘트의 응고로 끝납니다. 따라서이 시점부터 수술이 끝날 때까지 화학 가스에 효과적인 보호 마스크를 착용하십시오.
    12. 뇌의 다른 반구에 대해 2.3.2-2.3.11 단계에서 동일한 절차를 반복하십시오.
    13. 전극을 덮지 않고 캡을 형성하기 위해 더 많은 치과 용 시멘트를 바르십시오. 굳을 때까지 기다리십시오.
    14. 삼각형 바늘로 꼰 천연 실크 비 흡수성 봉합사 1/0을 사용하여 캡 앞뒤로 봉합하십시오. 필요한 경우 비흡수성 봉합사가 위치한 신체 부위에 따라 특정 시간에 봉합사를 제거합니다. 요오드 포비돈 용액을 사용하여 수술 부위를 소독하십시오.
    15. 입체 프레임에서 쥐를 제거하십시오.
  4. 전극 배치 확인을 위한 CT 영상
    1. 1.2.4-1.2.5단계를 수행하고 그림 1C를 참조하십시오.
    2. 생체 내 CT 스캔이 완료되면 쥐를 케이지에 넣습니다.
    3. 1.3.6 단계를 따르십시오. 및 1.3.7.
  5. 수술 후 관리
    1. 수술 후 치료로 항생제 (세프 트리 악손, 100mg / kg, 피하)를 5 일 동안 투여하고 진통제 (부 프레 노르 핀, 0.1mg / kg, 복강 내)를 3 일 동안 투여합니다. 이 항생제 요법은 뚜껑 주변에서 감염 징후 (발적, 부기 및 삼출물)가 관찰되면 5 일 동안 연장 될 수 있습니다.
    2. 매일 각 동물을 육안으로 검사하여 통증이나 고통의 징후를 찾고 요오드 포비돈 용액으로 뚜껑을 청소하십시오.
    3. 수술 후 최대 1주일 동안 집중 치료를 제공합니다.

3. PET/CT 영상 획득

참고: 각 동물은 전기 자극에 의해 유도된 급성 효과를 평가하기 위해 흡입 마취 하에 두 번의 PET/CT 연구(즉, 부재 시 및 DBS 투여 중)를 받습니다. 두 스캔 세션 모두 동일한 영상 획득 프로토콜을 따르며 수술 후 1주일(D1, 자극 없음)과 2일 후(D2, DBS 중)에 수행됩니다.

  1. 동물 준비 및 마취
    1. FDG의 더 높은 뇌 흡수를 허용하기 위해 각 PET 스캔 전에 8-12 시간 동안 쥐를 빠르게 하여 신호 대 잡음비12를 개선합니다.
    2. 동물을 마취 유도 상자에 넣고 상단을 밀봉하십시오.
    3. 세보 플루 란 기화기 (5 % O100에서 유도의 경우 2 %)를 켭니다.
    4. 쥐가 마취되면 가스 플럭스를 코 콘으로 전환하십시오.
  2. FDG 주입 및 섭취 기간
    주의 : FDG는 방사능 추적자이므로 방사능 노출을 피하기 위해 방사선 보호 조치를 고려하십시오. 기관이 방사성 화합물로 작업 할 수있는 모든 권한을 가지고 있는지 확인하십시오.
    1. 바람직하지 않은 방사능 노출을 피하기 위해 사용될 때까지 FDG 바이알을 납이 늘어선 캐비닛 안에 보관하십시오.
    2. 작은 게이지 주사기 (~ 27G)에 활성 측정기에서 측정 한 것처럼 가능한 한 적은 양의 ~ 37MBq의 FDG 용액을 채 웁니다.
    3. 동물의 꼬리 아래에 가열 패드를 놓거나 적외선을 사용하여 꼬리 정맥을 확장하십시오.
    4. 꼬리의 정점에서 측면 정맥이 분명 해지면 위생 알코올 (96 %)로 해당 부위를 청소하십시오.
    5. 측면 꼬리 정맥 중 하나를 통해 FDG 용액을 주입하고 궤적과 평행 한 주사기와 바늘의 경사가 위쪽을 향하도록 정맥에 접근합니다.
    6. 마취를 끄고 동물을 새장에 다시 넣어 가열 램프 아래에서 완전히 회복하십시오.
    7. 이미지 획득 세션을 시작하기 전에 45분 동안 방사성 추적자를 흡수하십시오. 이 기간 동안 동물을 깨어 있고 납 차폐 챔버 안에 두십시오.
    8. D2 연구의 경우 FDG 섭취 기간 동안 아래 섹션 4(전기 자극 투여)에 설명된 대로 DBS를 전달합니다.
  3. PET 획득 및 이미징 재구성
    참고: PET 이미지 획득 사양은 스캐너와 스캔 시간에 따라 다릅니다. 이 프로토콜의 경우 400-700keV 7,8,9의 에너지 창을 사용하여 소형 동물 PET/CT 스캐너로 45분 동안 정적 PET 이미지를 획득했습니다. 획득 프로토콜을 설계하기 전에 PET/CT 장비의 사양을 검토하십시오.
    1. FDG 주사 45 분 후, 동물을 마취 유도 상자에 넣고 상단을 밀봉하십시오.
    2. 세보 플루 란 기화기 (5 % O100에서 유도의 경우 2 %)를 켭니다.
    3. 동물을 PET / CT 침대로 옮기고 앙와위 자세로 눕히고 코를 마취 코 콘에 고정하고 세보 플루 란 마취를 유지합니다 (3 % O100에서 유지를 위해 2 %). 쥐 발을 꼬집어 마취 상태를 확인하십시오.
    4. 1.2.2단계와 1.2.3단계를 반복합니다.
    5. PET 스캐너의 시야 중앙에서 머리를 찾습니다.
    6. 스캐너 사양에 따른 획득 파라미터를 사용하여 정적 PET 이미지를 획득합니다.
    7. 2D-OSEM (정렬 된 부분 집합 기대 최대화 알고리즘)을 사용하여 이미지를 재구성하고 감쇠 및 부동 시간 보정 7,8,9를 적용합니다.
    8. 생체내 PET 스캔이 완료되면, 스캐너 베드 상에서 동물의 머리 위치를 옮기지 않고 CT 획득을 후속적으로 진행하기 위해 래트에 대한 세보플루란의 흐름을 유지한다.
  4. CT 획득
    1. 이전 PET 획득과 관련하여 동물의 위치를 변경하지 않고 CT 이미지 획득을 진행하십시오.
    2. 1.2.3-1.2.5단계를 반복합니다.
    3. 생체 내 CT 스캔이 완료되면 세보플루란 흐름을 멈추고 회복을 위해 쥐를 각각의 케이지에 넣습니다.
    4. 1.3.6 단계를 따르십시오. 및 1.3.7.
    5. 방사능이 완전히 붕괴 될 때까지 동물을 납 차폐 챔버에 보관하십시오.

4. 전기 자극 관리

알림: 전기 자극은 D2 이미징 세션의 FDG 흡수 기간 동안 전달됩니다. 이 프로토콜의 경우, 자극은 정전류 모드, 150μA에서 고주파(130Hz) 전기 자극 및 100μs(7,13,14)의 펄스 폭과 함께 분리된 자극기로 전달되었습니다.

  1. DBS 자극기 구성
    1. 격리 된 자극기와 필요한 전선을 넓고 조용한 방에 준비하고 동물 케이지를위한 충분한 공간과 잠재적으로 방해 할 수있는 자극의 영향을 최소화하십시오.
    2. 자극 와이어를 스위블에 연결하여 동물이 우리 안과 자극기에 자유롭게 움직일 수 있도록합니다.
    3. 연구의 필요에 따라 자극 매개 변수를 설정하십시오.
    4. 오실로스코프를 사용하여 전류 모드, 주파수 및 펄스 폭을 확인하십시오. 직사각형 펄스 모양의 이상성 파형을 확인합니다(그림 1D).
  2. DBS 전달
    1. D1 이미징 세션 후 D2 획득 시까지 동물에게 일일 습관화 프로토콜(45분/일)을 적용하여 자극 시스템과 작업자의 취급에 익숙해지도록 하여 D2에서 바람직하지 않은 스트레스 반응을 피합니다. 자극 시스템을 각 동물에 연결하되 자극을 켜지 마십시오.
    2. 자극기가 설치되고 동물에게 FDG가 주입되면 스위블을 전극에 연결하고 자극기를 켭니다.
    3. 45 분 후 자극기를 끄고 동물을 스위블에서 분리 한 다음 신속하게 마취 유도 챔버로 옮겨 3.3 단계를 시작합니다.

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그림 1: 실험 설계 . (A) 이 프로토콜에서 따르는 실험 단계의 요약. (B) 전극의 더 나은 고정을 위한 홀더 적응의 대표 사진, 전극이 있는 (왼쪽) 및 없는 것(오른쪽). (C) MRI와 수술 동물의 CT의 융합 이미지, 내측 전두엽 피질 (mPFC)의 올바른 전극 배치를 보여줍니다. (D) 이상성 자극 파형을 보여주는 오실로스코프 화면의 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. PET 이미지 처리 및 분석

참고: D1 및 D2의 이미지에 대해 동일한 이미지 처리를 수행하여 후속 복셀별 통계 분석을 위해 비교 가능한 데이터를 얻습니다.

  1. PET 이미지의 공간 정합
    1. 특수 이미징 처리 소프트웨어를 사용하십시오. 전체 등록 워크플로는 그림 2에 나와 있습니다.
    2. 각 PET 및 CT 이미지를 시야각에 맞게 중앙에 놓고 자릅니다. 상호 정보15에 기초한 자동 경질 등록 알고리즘을 사용하여 PET 이미지를 CT에 등록한다.
      참고: 엄격한 등록 방법은 동물 간에 체중이나 크기에 큰 차이가 없는 경우에만 적합합니다. 그렇지 않으면 탄력적 메서드를 사용하는 것이 좋습니다.
    3. 각 CT 영상을 단계 5.1.2에서와 같이 Paxinos 및 Watson 래트 뇌 지도책(11 )에 공간적으로 등록된 기준 CT에 등록한다. 결과 변환 매개 변수를 저장합니다.
    4. 5.1.3단계에서 얻은 변환 매개변수를 적용합니다. 등록된 각 PET 영상을 참조CT 영상에 등록된 PET 영상을 획득한다.
    5. 모든 최종 PET 이미지를 Nifti 형식으로 저장합니다.
  2. PET 이미지의 강도 정규화 및 평활화
    참고: 강도 정규화 및 평활화는 공개적으로 사용 가능한 리소스를 기반으로 하는 다양한 사내 스크립트로 수행됩니다.
    1. 2mm의 FWHM(전폭 반치)의 등방성 가우스 커널로 PET 이미지를 매끄럽게 하여 가능한 등록 오류를 수정합니다.
      알림: 평활화 필터의 크기는 PET 획득의 해상도에 따라 다르지만 FWHM 복셀 크기의 2-3배인 필터를 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 적절한 참조 클러스터 정규화 방법16을 사용하여 PET 복셀 값의 강도를 정규화합니다.
    3. 참조 CT 영상에 등록된 기준 MRI로부터 뇌 마스크를 분할한다.
    4. 각 PET 이미지에 뇌 마스크를 적용하여 복셀별 분석에서 뇌 외부의 복셀을 제외합니다.
  3. 복셀별 분석
    참고: PET 이미지 데이터의 복셀-단위 분석으로 구성된 통계 분석은 특수 이미징 분석 소프트웨어(17)를 사용하여 수행되었다.
    1. 쌍체 T-검정을 사용하여 D1 및 D2 PET 이미지를 비교하여 적절한 통계적 유의성 임계값을 설정합니다.
    2. 유형 I 오류를 줄이기 위해 50개의 인접한 복셀보다 큰 클러스터만 분석의 최종 결과로 간주합니다.
    3. 결과를 T2 MRI에 오버레이된 T-맵으로 나타내고, DBS에 의해 유도된 포도당 뇌 대사의 변화를 보여준다(FDG 감소를 위한 차가운 색, FDG 증가를 위한 따뜻한 색).

figure-protocol-2
그림 2: 마이크로 PET/CT 이미징 등록 워크플로우. 통계 파라메트릭 매핑(SPM) 소프트웨어를 사용한 후속 복셀별 분석을 위한 PET 이미지 공간 정규화 처리의 세부 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

동물은 연구 종료 시 또는 동물의 복지가 손상되었을 때CO2를 사용하여 희생되었습니다. 수술한 동물의 완전한 PET/CT 연구의 예가 그림 3에 나와 있습니다. 따라서, 랫트 뇌에 삽입된 전극은 도 3A에 도시된 CT 이미지에서 명확하게 관찰될 수 있다. 이 이미징 양식은 우수한 해부학적 정보를 제공하고 기능적 양식이 구조적 이미지보다 흐릿한 경향이 있다는 점을 감안할 때 FDG-PET 이미지의 등록을 용이하게 합니다(그림 3A,B). 또한, FDG-PET의 병합 이미지와 동일 동물의 CT 이미지를 도 3C에 나타내었다.

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토론

신경 정신 장애의 병태 생리학에 관여하는 뇌 기능 및 신경망에 대한 이해의 발전을 감안할 때, 점점 더 많은 연구가 광범위한 신경 기반 병리학에서 DBS의 잠재력을 인식하고 있습니다2. 그러나이 요법의 작용 메커니즘은 불분명합니다. 특정 병리학 및 자극 상황에서 얻은 효과를 설명하기 위해 여러 이론이 시도되었지만 제안 된 연구의 이질성으로 인해 결정적인 결론에 도달하기가 매우 어렵습니다4. 따라서 많은 노력에도 불구하고 실질적인 합의는 없지만 DBS 중재를받는 환자의 수는계속 증가하고 있습니다 18. 그런 다음 생체 내 뇌에서 DBS 결과를 이해하면 각 환자의 요구에 더 적합한 자극 매개 변수와 자극 프로토콜을 밝혀 더 나은 성공률을 얻을 수 있습니다. 이러한 맥락에서 FDG-PET와 같은 비 침습적 기능적 신경 영상 양식은 뇌에서 전기 자극의 직접적인 영향으로 실제로 일어나는 일을 밝...

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공개 사항

저자는이 기사와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

여기에 설명된 방법론의 최적화에 귀중한 지원을 해주신 Christine Winter, Julia Klein, Alexandra de Francisco 및 Yolanda Sierra 교수에게 감사드립니다. MLS는 유럽 지역 개발 기금 (ERDF)이 공동 자금을 지원하는 살루드 카를로스 III 연구소 (프로젝트 번호 PI17/01766 및 보조금 번호 BA21/0030)의 지원을 받았습니다. 시버 삼 (프로젝트 번호 CB07 / 09 / 0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (프로젝트 번호 2017/085); 마프레 재단; 그리고 Fundación Alicia Koplowitz.  MCV는이 기관의 장학금 보유자 인 Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno와 EU 공동 프로그램-신경 퇴행성 질환 연구 (JPND)의 지원을 받았습니다. DRM은 Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid가 지원했으며, 유럽 사회 기금 "미래에 투자"(보조금 번호 PEJD-2018-PRE/BMD-7899)가 공동 자금을 지원했습니다. NLR은 Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019"의 지원을 받았습니다. MD 작업은 MCIN(Ministerio de Ciencia e Innovación)과 ISCIII(Instituto de Salud Carlos III)(PT20/00044)의 지원을 받았습니다. CNIC는 Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) 및 Pro CNIC Foundation의 지원을 받고 있으며 Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505)입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
7-Tesla Biospec 70/20 스캐너Bruker, 독일SN0021소동물 이미징용 MRI 스캐너
BetadineMeda Pharma S.L., 스페인644625.6요오드 용액(요오드포비돈)
Beurer IL 11BeurerSN87318적외선 바이폴라
케이블 50cm w/50cm 메쉬 최대 100cm플라스틱 One, 미국305-305(CM)
바이폴라 케이블 TT2  50 cm 최대 100 cmPlastics One, USA305-340/2양극성 케이블 TT2  50 cm 최대 100 cm
BuprexSchering-Plough, S.A961425Buprenorphine (진통제)
Ceftriaxona Reig Jofré 1g IMLaboratorio Reig Jofré S.A., 스페인624239.1Ceftriaxone (항생제)
정류자Plastics One, 미국SL2 + 2C4 채널 정류자 DBS
동심 바이폴라 백금-이리듐 전극플라스틱 One, 미국MS303 / 8-AIU / SpcDBS
드릴러용 전극 BoshT58704드릴러
FDGCurium Pharma Spain S.A., 스페인-----2-[18F]플루오로-2-데옥시-D-글루코스(PET 방사성 추적자)
가열 패드DAGA, 스페인23115가열 패드
KetolarPfizer S.L., 스페인776211.9케타민(마취제)
리폴라식 2 mg/gBausch & Lomb S.A, 스페인65277안과 윤활 젤
MatLab R2021aThe MathWorks, IncSPM12
MRIcroMcCausland Center for Brain Imaging을 위한 지원 소프트웨어,  University of South Carolina, USAv2.1.58-0이미징 전처리 및 분석용 소프트웨어
MMWKS(Multimodality Workstation)BiiG, 스페인이미징 처리 및 분석용 소프트웨어
Omicrom VISION VETRGB Medical Devices, Spain731100 ReV B소형 이미징용 심폐 모니터
Prevex 면봉Prevex, 핀란드-----면봉
SevoraneAbbVie Spain, S.L.U, Spain673186.4Sevoflurane (흡입 마취)
작은 나사Max Witte GmbH1,2 x 2 DIN 84 A2작은 나사
쥐용 표준 U-프레임 입체 기구, 18° Ear BarHarvard Apparatus, 미국75-1801)을 위한 양암 정위 프레임
TheWellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, UK복셀 와이즈 이미징 분석을 위한SPM12
STG1004Multi Channel Systems GmbH, 독일STG1004절연 자극기
SuperArgus PET/CT 스캐너Sedecal, 스페인S0026403소동물 이미징용 NanoPET/CT 스캐너
바늘이 있는 봉합사, 1/º로르카 마르시아쿠테; n S.A., Spain55325꼰 천연 실크 비흡수성 봉합사 1/0, 삼각형 바늘
포함 Technovit 4004 (분말 및 액체)Kulzer Technique, 독일64708471; 64708474개두술용 아크릴 치과 시멘트
탭 Wistar 쥐 (Rattus norvergicus)스페인 찰스 리버동물 시설모델 사용
XylagesicLaboratorios Karizoo, A.A, 스페인572599-4자일라진(마취제)
Normon S.A., 스페인602910국소용 젤 메피바카인
쥐 통계 파라메트릭 매핑(SPM12 소프트웨어 동물

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